Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe wykrycie interakcji białko-białko w przejściowym systemie ekspresji. Pomiar ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach transakcji quan-signal, takich jak ilościowe monitorowanie kierunków naszych białek białkowych po obróbce chemicznej lub środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje luminometr lub kamerę CCD do wykrywania aktywności lucyfericznej, która reprezentuje intensywność kierunku białka białkowego, dzięki czemu wyniki są dokładniejsze.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden mililitr roztworu zawierającego pięć procent podchlorynu sodu i punkt zerowy jeden procent trytona x sto do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej nasiona. Pozostaw roztwór na pięć minut, aby wysterylizować nasiona. Następnie umyj nasiona sterylną wodą pięć razy.

Zawieś umyte nasiona w dwustu mikrolitrach sterylnej wody. Za pomocą cienkich końcówek ostrożnie umieść pojedyncze nasiona na powierzchni pochodzącego z agaru MS. Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.

Następnie utrzymuj średnie płytki w normalnych warunkach wzrostu przez dziesięć dni. Przenieś kiełkujące sadzonki do gleby, uważając, aby nie uszkodzić korzeni. Przykryj tacę przezroczystą plastikową osłoną na noc, aby utrzymać wilgotność.

Hoduj rośliny w pomieszczeniu do kontrolowanego wzrostu przez siedem tygodni, kiedy będą gotowe do infiltracji Agrobacterium tumefaciens. Aby rozpocząć, dostarcz sto pięćdziesiąt nanogramów plazmidów do szczepu komórek GV3101 kompetentnego dla a-tumefaciens. Umieścić probówki zawierające kulturę a-tumefaciens w shakerze i inkubować przez cztery godziny.

Za pomocą szklanej pałeczki przenieś kulturę z probówek na pożywki LB. Kultura a-tumefaciens i pożywka agarowa LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez cztery dni. Następnie przygotuj się do zaszczepienia pojedynczej kolonii a-tumefaciens z każdej płytki do własnej probówki zawierającej trzy mililitry płynnego podłoża LB.

Wstrząsać w temperaturze 280 RBM w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby rozmnożyć kulturę. Następnie przenieś 75 mikrolitrów kultury bakteryjnej do 15 mililitrów świeżej płynnej pożywki LB zawierającej 15 mikrogramów na mililitr kanamycyny i 50 mikrogramów na mililitr ryfampicyny. Hoduj bakterie przy 220 obr./min w 30 stopniach Celsjusza przez około 8 godzin, aż OD600 osiągnie wartość od 0,5 do 1.

Następnie przenieś kulturę do 15 mililitrowych probówek wirówkowych. Wirować przy 4000 razy większej grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić paletę w 15 mililitrach roztworu transformacyjnego.

Wirować przy 4000 razy większej grawitacji i 4 stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie powtórzyć jeszcze raz etap zawieszania i wirowania. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić paletę w 5 mililitrach roztworu transformacyjnego.

Pozostaw zawieszoną paletę na dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach. Następnie dodaj roztwór transformacyjny do OD600 wynosi 0,5 lub połącz dwie próbki o równej objętości w celu zbadania sparowanych oddziaływań białkowych. Za pomocą jednomililitrowej igły strzykawki naciekaj zawieszone komórki do czwartego do siódmego liścia.

Następnie natychmiast przykryj rośliny czarną plastikową osłoną na 12 godzin. Po pierwsze, rośliny powinny być bardzo zdrowe, aby zapewnić sukces. Po drugie, upewnij się, że nie uszkodzisz żadnych liści podczas procesu infiltracji.

Przechowuj tacę w ciemności przez 12 godzin. Następnie hoduj rośliny w normalnych warunkach przez 2 do 4 dni przed wykryciem aktywności lucyferazy. Aby rozpocząć metodę obrazowania, oderwij naciekający liść.

Umieść całą ulotkę na talerzu z podłożem agarowym MS. Za pomocą 50-mililitrowej butelki z rozpylaczem rozpyl bufor roboczy lucyferonu na stronę przyosiową liści. Następnie trzymaj w ciemności przez 5 minut, aby ugasić autofluorescencję chlorofilu.

Użyj aparatu do obrazowania CCD chłodzonego niższym światłem, schłodzonego do minus 30 stopni Celsjusza, aby uchwycić obrazy z czasem ekspozycji wypełnionym światłem 50 milisekund i czasem wykrywania luminescencji wynoszącym 1 minutę. Następnie wytnij fragmenty liści z obszaru infiltracji liści N-benthamiana. Zanurz fragmenty w 100 mikrolitrach wody dejonizowanej w studzienkach 96-dołkowej białej płyty.

Dodaj dziesięć mikrolitrów buforu roboczego lucyferonu. Odstaw talerz na 5 minut. Następnie wykonaj dowolny specyficzny zabieg, aby zbadać dynamikę interakcji białek i zmierzyć luminescencję bezpośrednio za pomocą komercyjnego luminometru.

Pokazano tutaj demonstrację lucyferyjnej aktywności reprezentującej interakcje COP 1 SPA 1. Aktywność lucyferyczna, która jest wykrywana przez luminescencję, jest obrazowana przez kamerę CCD. Obserwuje się, że interakcje COP 1 SPA 1 powodują mutację miedzi w funkcjonalnej lucyferazie.

Następnie określa się aktywność lucyferazy w trakcie leczenia Jasmine 8 w czasie. Interakcje COP 1 SPA 1 reprezentowane przez aktywność lucyferazy są obserwowane jako stopniowo zanikające w ciemności. Leczenie Jasmine 8 dodatkowo zmniejsza te interakcje.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 1 tygodnia, po tym, jak rośliny są gotowe, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu zdrowych roślin. Ostrożnie infiltruj liście i odpowiednio uwzględnij kontrole.

Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się transakcjami sygnałowymi do szybkiego zbadania dynamiki interakcji białek białkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uprawiać rośliny tytoniu, infiltrować agrobakterie do liści tytoniu i wykrywać lucyferyjne działania.