Name: Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do szybkiego, ilościowego wykrywania interakcji białko-białko w układzie przejściowej ekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20140919), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31470375), Priorytetowy Program Rozwoju Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu oraz Projekt Qing Lan.

1. Przygotowanie roślin (8 tygodni)
<ol>
	<li>Umieść 50 nasion Nicotiana benthamiana w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 5% roztworu NaClO i 0,1% Triton X-100 (V/V) i pozostaw na 5 minut w celu wysterylizowania nasion.</li>
	<li>Opłucz nasiona sterylną wodą 5 razy i zawieś nasiona w 200 μl sterylnej wody.</li>
	<li>Ostrożnie umieść pojedyncze nasiona na powierzchni pożywki MS-agar (1 l: 1x sole Murashige i Skoog, 10 g sacharozy, pH 5,8 (KOH), 1% agar) z cienkimi końcówkami i przechowuj średnie płytki w 4 °C przez 3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologami, wykonaj ten krok na czystej stole. Podczas sterylizacji nie ma potrzeby potrząsania probówką.</li>
	<li>Umieść pożywki w normalnych warunkach wzrostu (22 °C, natężenie światła białego 80 - 90 μmolm-2 s-1) na 10 dni, a następnie przenieś kiełkujące sadzonki do gleby. 
	UWAGA: Upewnij się, że wkładasz korzenie sadzonek do gleby i nie uszkadzaj korzeni. Przykryj tacę przezroczystą plastikową osłoną na noc, aby utrzymać wilgotność.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu o kontrolowanym wzroście w cyklu 16 godzin/8 godzin światła/ciemności i wilgotności 70%. 7-tygodniowe rośliny N. benthamiana są gotowe do infiltracji Agrobacteriumtumefaciens (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Podlewaj rośliny i zwalczaj szkodniki w razie potrzeby, aby utrzymać rośliny w zdrowiu.</li>
</ol>
2. Przejściowe wyrażenie w liściach N. bentamiana (7 - 10 dni)
<ol>
	<li>Dostarczyć 150 ng plazmidów (plazmid kontrolny pEGAD-HA-LUC, pusty wektor i skonstruowany plazmid do testu LCI, w tym przypadku użyliśmy pCAMBIA1300-Nluc i pCAMBIA1300-Cluc do budowy plazmidu) do A. tumefaciens kompetentnego szczepu komórkowego GV3101 za pomocą standardowej metody elektroporacji.</li>
	<li>Kultura A. tumefaciens na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) (1 l: 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu, 1,5% agaru) zawierającym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 28 °C przez 4 dni. 
	UWAGA: Wybór antybiotyków zależy od zastosowanego wektora i szczepu A. tumefaciens.</li>
	<li>Zaszczepić jedną pojedynczą kolonię A. tumefaciens z każdej płytki do 3 ml płynnego podłoża LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny i wstrząsać z prędkością 220 obr./min w temperaturze 28 °C przez 24 godziny w celu rozmnażania hodowli komórkowej.</li>
	<li>Przenieść 75 μl kultury bakteryjnej do 15 ml świeżej płynnej pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny, rozcieńczając ją przez współczynnik 200. Hodować bakterie przy 220 obr./min w temperaturze 30 °C przez około 8 godzin, aż OD600 osiągnie wartość od 0,5 do 1,0.</li>
	<li>Przenieść płynną kulturę A. tumefaciens do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 15 ml roztworu transformacyjnego w celu przepłukania osadu.</li>
	<li>Wirować probówkę w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut i wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml roztworu transformacyjnego i przechowywać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dostosuj gęstość komórek osadów A. tumefaciens roztworem transformacyjnym, aż końcowe stężenie OD600 wyniesie 0,5 lub wymieszaj dwie próbki o równej objętości w celu zbadania sparowanych oddziaływań białkowych.</li>
	<li>Naciekaj zawieszone komórki do4-tych do7-tych liści za pomocą 1 ml bezigłowej strzykawki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1BC). Po infiltracji natychmiast przykryj rośliny czarną plastikową osłoną i umieść tacę w ciemności na 12 godzin. Następnie hoduj rośliny jak zwykle przez 2 do 4 dni, zanim wykryjesz aktywność LUC. 
	UWAGA: Wybierz zdrowe liście o podobnej wielkości. Infiltracja czterech różnych stref w jednym liściu jest w porządku.</li>
</ol>
3. Wykrywanie aktywności lucyferazy (jeden dzień)
Uwaga: Istnieją dwa sposoby monitorowania aktywności lucyferazy. Jeden opiera się na obrazowaniu, a drugi ma na celu ilościowy pomiar aktywności lucyferazy.
<ol>
	<li>Metoda obrazowania
	<ol>
		<li>Oderwij naciekany liść i umieść całą ulotkę na podłożu MS-agar.</li>
		<li>Rozpyl bufor roboczy lucyferyny na powierzchnię przyosiową liścia za pomocą butelki z rozpylaczem o pojemności 50 ml. Trzymaj materiały w ciemności przez 5 minut, aby ugasić autofluorescencję chlorofilu.</li>
		<li>Użyj aparatu do obrazowania CCD chłodzonego słabym oświetleniem (schłodzonego do -30 °C) do robienia obrazów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Czas naświetlania pola świetlnego wynosi 50 ms, a czas wykrywania luminescencji 1 min. 
		UWAGA: Dostosuj parametry zgodnie z instrukcją obsługi maszyny. Niższe temperatury poprawią stosunek sygnału do szumu, aby poprawić jakość obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, zmierz luminescencję bezpośrednio za pomocą komercyjnego luminometru.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyciąć fragmenty liści (około 0,25cm2) z obszaru infiltracji liści N. benthamiana i zanurzyć krążek liściowy w 100 μl wody dejonizowanej w 96-dołkowej białej płytce (<klasa silna = "xfig">Ryc. 3).</li>
		<li>Dodać 10 μl buforu roboczego lucyferyny i odstawić na 5 minut. Następnie wykonaj specjalne zabiegi, aby zbadać dynamikę interakcji białek. 
		UWAGA: Wykryj luminescencję za pomocą luminometru w różnych punktach czasowych, aby uzyskać dynamikę aktywności lucyferazy, która reprezentuje kinetykę interakcji białko-białko pod określonym traktowaniem. Metoda ta ma zalety w przypadku jednoczesnego testowania dużej liczby par białek. Dla tych, którzy nie mają komercyjnego luminometru, zbadaj obfitość białka lucyferazy za pomocą western blot, dlatego odnieś się do ilościowej aktywności LUC. Jeśli światło niekoniecznie jest wymagane, po prostu trzymaj płytkę w luminometrze i mierz luminescencję w różnych punktach czasowych. W przeciwnym razie przenieś płytkę do komory wzrostowej podczas szczeliny wykrywania. Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, należy użyć co najmniej trzech kontrprób biologicznych. Chociaż aktywność LUC z różnych stref infiltracji będzie się różnić, ich zmieniające się wzorce są spójne po normalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest prosty i powtarzalny do badania in vivo interakcji białko-białko, a szczególnie nadaje się do wykrywania dynamiki interakcji białek podczas leczenia egzogennego. Kluczowym krokiem w tym teście jest infiltracja N. benthamiana . Aby zapewnić powodzenie infiltracji, rośliny muszą być bardzo zdrowe. Innym krytycznym czynnikiem jest to, kiedy sprawdzić aktywność lucyferazy po infiltracji. Nie ma poprawnej odpowiedzi na to pytanie. Naukowcy są zachęcani do monitorowania aktywności ...

Aby koordynować wzrost ze swoim środowiskiem, rośliny rozwinęły eleganckie ścieżki sygnałowe, aby wyczuwać, przekazywać i reagować na sygnały sygnalizacyjne. Podobnie jak biegacze w sztafecie, białka są niezbędnymi graczami w transdukcji sygnału roślinnego. Powszechnie uznaje się, że interakcja białko-białko (PPI) odgrywa główną rolę w komunikacji komórkowej. Fosforylacja, acetylacja i degradacja białek zależą od fizycznej interakcji między białkiem docelowym a jego enzymami modyfikującymi. Na przykład białka z rodziny Jasmonate ZIM-domain protein (JAZ) oddziałują z czynnikiem transkrypcyjnym MYC2 i hamują jego aktywność transkrypcyjną1,2. Biorąc pod uwagę znaczenie PPI, ostatnio zbadano interakcje białek na dużą skalę w roślinach3,4,5. Wyniki interaktomii dodatkowo ujawniają złożoną sieć regulacyjną, która koordynuje różne funkcje komórkowe.
Istnieją pewne sprawdzone podejścia do monitorowania PPI. Test drożdży dwuhybrydowych (Y2H) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania IPP. Y2H jest łatwy do wykonania i nadaje się do szybkiego testu w celu zbadania interakcji białek. Y2H jest również szeroko stosowany do badań przesiewowych nieznanych partnerów interakcji dla określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponieważ jednak Y2H jest w całości przeprowadzany w drożdżach, nie może odzwierciedlać prawdziwego scenariusza w komórkach roślinnych i zapewnia wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich. Inną podobną strategią jest test pull-down. Ogólnie rzecz biorąc, dwa białka są wyrażane i oczyszczane z komórek Escherichia coli, a następnie mieszane i unieruchamiane w celu wykrycia interakcji białkowych. Chociaż metoda ta nie jest czasochłonna, nie pozwala również uzyskać wyników interakcji in vivo. Do celów interakcji in vivo koimmunoprecypitacja (co-IP) jest najpopularniejszym testem, który wymaga wysokiej jakości przeciwciała do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie może wykluczyć możliwości wystąpienia pośrednich IPP. Ponadto, ze względu na skomplikowane procedury eksperymentalne w co-IP, wyniki zwykle różnią się w zależności od indywidualnej wiedzy specjalistycznej.
Testy rekonstytucji oparte na reporterach znacznie przyspieszają wykrywanie in vivo IPI. Metody te obejmują transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)6, dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną (BiFC)7 oraz test obrazowania komplementacji lucyferazy świetlika (LCI)8. Chociaż te trzy podejścia są lepsze niż co-IP, aby odzwierciedlić bezpośrednie PPI in vivo, FRET i BiFC wymagają specjalnych mikroskopów do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych i nie mogą łatwo określić ilościowo intensywności oddziaływania. W przeciwieństwie do tego, LCI wykorzystuje lucyferazę świetlika, która będzie świecić po reakcji z substratem lucyferyną. Co ważniejsze, intensywność PPI można określić na podstawie wartości aktywności lucyferazy. W ten sposób LCI nie tylko wskazuje, czy dwa białka oddziałują na siebie, czy nie, ale także dostarcza informacji na temat dynamiki interakcji po poddaniu działaniu substancji. Chociaż istnieją pewne ustalone metody monitorowania dynamiki oddziaływań (oparte na powierzchniowym rezonansie plazmonów lub przesunięciach termostabilności)9,10, podejścia te wymagają delikatnych instrumentów lub specjalnego etykietowania. W przeciwieństwie do tego, LCI jest łatwiejszy do wykonania i wykrycia.
Zasada dla LCI polega na tym, że połówki amino-końcowe i karboksylowe lucyferazy (nazwane odpowiednio N-Luc lub C-Luc) zostały połączone z białkiem A i B, a te dwa białka fuzyjne były jednocześnie wyrażane w komórkach roślinnych. Jeśli białko A oddziałuje z białkiem B, wówczas dwie połówki lucyferazy zostaną odtworzone, aby stać się aktywnym enzymem lucyferazy. Aktywność lucyferazy można wykryć za pomocą luminometru lub kamery CCD. Nie jest konieczne otrzymywanie stabilnych transformantów dla LCI; Wyrażenie przejściowe wystarczy, aby uzyskać wynik interakcji wysokiej jakości.
RING-typ E3 konstytutywny fotomorfogenny 1 (COP1) ubikwityny typu E3 oddziałuje z niezliczonymi czynnikami transkrypcyjnymi i wspomaga ich degradację poprzez proteasom 26S11. Niektóre z tych czynników transkrypcyjnych ukierunkowanych na COP1 są pozytywnymi regulatorami fotomorfogenezy. W ciemności COP1 oddziałuje z supresorem fitochromu A-105 1 (SPA1), który zwiększa aktywność COP1 E3 8. Po percepcji światła fotoreceptory znoszą interakcję COP1-SPA1, aby zahamować aktywność COP1, a następnie ustabilizować substraty COP112,13,14. Przykład ten ilustruje biologiczne znaczenie badania PPI i określania dynamiki PPI.

<table><tbody><tr><td>Roztwór do przemian</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Kwas morpholineetanosulfonowy</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27,8 mM Glukoza</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&razy; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M Acetosyringone</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5,7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna bufor roboczy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Sól potasowa lucyferyny</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0,025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O do 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Interakcje białko-białko są podstawowymi mechanizmami przekazywania transdukcji sygnału w większości procesów komórkowych; dlatego identyfikacja nowych par interakcji białko-białko i monitorowanie dynamiki interakcji białek są szczególnie interesujące dla ujawnienia, jak rośliny reagują na czynniki środowiskowe i/lub sygnały rozwojowe. Opracowano wiele podejść do badania interakcji białko-białko, zarówno in vitro, jak i in vivo. Wśród nich niedawno opracowany test obrazowania komplementacji lucyferazy (LCI) jest najprostszą i najszybszą metodą wykazywania interakcji białko-białko in vivo. W tym teście białko A lub białko B jest połączone odpowiednio z amino-końcową lub karboksylowo-końcową połową lucyferazy. Kiedy białko A oddziałuje z białkiem B, dwie połówki lucyferazy zostaną odtworzone, tworząc funkcjonalny i aktywny enzym lucyferazy. Aktywność lucyferazy może być rejestrowana za pomocą luminometru lub kamery CCD. W porównaniu z innymi podejściami, test LCI pokazuje interakcje białko-białko zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym. Naciek Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana jest szeroko stosowanym systemem przejściowej ekspresji białek. Dzięki połączeniu LCI i ekspresji przejściowej, podejścia te pokazują, że fizyczna interakcja między COP1 i SPA1 była stopniowo zmniejszana po leczeniu jasmonianem.

W niniejszym protokole komplementacji lucyferazy służącym do badania oddziaływań białko-białko in vivo można wyróżnić trzy główne etapy: wzrost roślin, infiltrację tytoniu oraz test lucyferazy. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest infiltracja liści N. benthamiana zawiesiną A. tumefaciens (Rysunek 1).
Poniżej przedstawiono przykład użyteczności tej techniki w potwier...

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe wykrycie interakcji białko-białko w przejściowym systemie ekspresji. Pomiar ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach transakcji quan-signal, takich jak ilościowe monitorowanie kierunków naszych białek białkowych po obróbce chemicznej lub środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje luminometr lub kamerę CCD do wykrywania aktywności lucyfericznej, która reprezentuje intensywność kierunku białka białkowego, dzięki czemu wyniki są dokładniejsze.Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden mililitr roztworu zawierającego pięć procent podchlorynu sodu i punkt zerowy jeden procent trytona x sto do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej nasiona. Pozostaw roztwór na pięć minut, aby wysterylizować nasiona. Następnie umyj nasiona sterylną wodą pięć razy.Zawieś umyte nasiona w dwustu mikrolitrach sterylnej wody. Za pomocą cienkich końcówek ostrożnie umieść pojedyncze nasiona na powierzchni pochodzącego z agaru MS. Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.Następnie utrzymuj średnie płytki w normalnych warunkach wzrostu przez dziesięć dni. Przenieś kiełkujące sadzonki do gleby, uważając, aby nie uszkodzić korzeni. Przykryj tacę przezroczystą plastikową osłoną na noc, aby utrzymać wilgotność.Hoduj rośliny w pomieszczeniu do kontrolowanego wzrostu przez siedem tygodni, kiedy będą gotowe do infiltracji Agrobacterium tumefaciens. Aby rozpocząć, dostarcz sto pięćdziesiąt nanogramów plazmidów do szczepu komórek GV3101 kompetentnego dla a-tumefaciens. Umieścić probówki zawierające kulturę a-tumefaciens w shakerze i inkubować przez cztery godziny.Za pomocą szklanej pałeczki przenieś kulturę z probówek na pożywki LB. Kultura a-tumefaciens i pożywka agarowa LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez cztery dni. Następnie przygotuj się do zaszczepienia pojedynczej kolonii a-tumefaciens z każdej płytki do własnej probówki zawierającej trzy mililitry płynnego podłoża LB.Wstrząsać w temperaturze 280 RBM w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby rozmnożyć kulturę. Następnie przenieś 75 mikrolitrów kultury bakteryjnej do 15 mililitrów świeżej płynnej pożywki LB zawierającej 15 mikrogramów na mililitr kanamycyny i 50 mikrogramów na mililitr ryfampicyny. Hoduj bakterie przy 220 obr./min w 30 stopniach Celsjusza przez około 8 godzin, aż OD600 osiągnie wartość od 0,5 do 1.Następnie przenieś kulturę do 15 mililitrowych probówek wirówkowych. Wirować przy 4000 razy większej grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić paletę w 15 mililitrach roztworu transformacyjnego.Wirować przy 4000 razy większej grawitacji i 4 stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie powtórzyć jeszcze raz etap zawieszania i wirowania. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić paletę w 5 mililitrach roztworu transformacyjnego.Pozostaw zawieszoną paletę na dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach. Następnie dodaj roztwór transformacyjny do OD600 wynosi 0,5 lub połącz dwie próbki o równej objętości w celu zbadania sparowanych oddziaływań białkowych. Za pomocą jednomililitrowej igły strzykawki naciekaj zawieszone komórki do czwartego do siódmego liścia.Następnie natychmiast przykryj rośliny czarną plastikową osłoną na 12 godzin. Po pierwsze, rośliny powinny być bardzo zdrowe, aby zapewnić sukces. Po drugie, upewnij się, że nie uszkodzisz żadnych liści podczas procesu infiltracji.Przechowuj tacę w ciemności przez 12 godzin. Następnie hoduj rośliny w normalnych warunkach przez 2 do 4 dni przed wykryciem aktywności lucyferazy. Aby rozpocząć metodę obrazowania, oderwij naciekający liść.Umieść całą ulotkę na talerzu z podłożem agarowym MS. Za pomocą 50-mililitrowej butelki z rozpylaczem rozpyl bufor roboczy lucyferonu na stronę przyosiową liści. Następnie trzymaj w ciemności przez 5 minut, aby ugasić autofluorescencję chlorofilu.Użyj aparatu do obrazowania CCD chłodzonego niższym światłem, schłodzonego do minus 30 stopni Celsjusza, aby uchwycić obrazy z czasem ekspozycji wypełnionym światłem 50 milisekund i czasem wykrywania luminescencji wynoszącym 1 minutę. Następnie wytnij fragmenty liści z obszaru infiltracji liści N-benthamiana. Zanurz fragmenty w 100 mikrolitrach wody dejonizowanej w studzienkach 96-dołkowej białej płyty.Dodaj dziesięć mikrolitrów buforu roboczego lucyferonu. Odstaw talerz na 5 minut. Następnie wykonaj dowolny specyficzny zabieg, aby zbadać dynamikę interakcji białek i zmierzyć luminescencję bezpośrednio za pomocą komercyjnego luminometru.Pokazano tutaj demonstrację lucyferyjnej aktywności reprezentującej interakcje COP 1 SPA 1. Aktywność lucyferyczna, która jest wykrywana przez luminescencję, jest obrazowana przez kamerę CCD. Obserwuje się, że interakcje COP 1 SPA 1 powodują mutację miedzi w funkcjonalnej lucyferazie.Następnie określa się aktywność lucyferazy w trakcie leczenia Jasmine 8 w czasie. Interakcje COP 1 SPA 1 reprezentowane przez aktywność lucyferazy są obserwowane jako stopniowo zanikające w ciemności. Leczenie Jasmine 8 dodatkowo zmniejsza te interakcje.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 1 tygodnia, po tym, jak rośliny są gotowe, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu zdrowych roślin. Ostrożnie infiltruj liście i odpowiednio uwzględnij kontrole.Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się transakcjami sygnałowymi do szybkiego zbadania dynamiki interakcji białek białkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uprawiać rośliny tytoniu, infiltrować agrobakterie do liści tytoniu i wykrywać lucyferyjne działania.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji...

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Ten film demonstruje test komplementacji rozszczepionej lucyferazy w celu wykrycia interakcji białko-białko. W tym teście interesujące białka są oznaczane do małych i dużych fragmentów enzymu lucyferazy. Kiedy białka wchodzą w interakcję, duże i małe fragmenty łączą się, tworząc aktywny kompleks enzymatyczny, który w obecności określonego substratu uwalnia jasną luminescencję, którą można zmierzyć.

Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Poznaj metodę obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do szybkiego, ilościowego wykrywania interakcji białko-białko w układzie przejściowej ekspresji.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Przeglądaj więcej filmów