Name: Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Poznaj metodę biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą glutaminianu in vitro. Ta technika oferuje potencjał wyższej ostrości wzroku i bardziej naturalnego widzenia niż stymulacja elektryczna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca przedstawiona w artykule była wspierana przez National Science Foundation, grant programu Emerging Frontiers in Research and Innovation (NSF-EFRI) numer 0938072. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego artykułu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NSF. Autorzy pragną również podziękować dr Samsoonowi Inayatowi za jego pracę polegającą na zaprojektowaniu i przetestowaniu wstępnej eksperymentalnej konfiguracji do stymulacji chemicznej oraz panu Ashwinowi Raghunathanowi za jego pracę nad zaprojektowaniem, wyprodukowaniem i oceną wieloportowego urządzenia mikroprzepływowego użytego w tym badaniu.

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Genetics+and+Biology+Coming+Together%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).</li>
<li>Marc, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17591910">Neural reprogramming in retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).</li>
<li>Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644448">Retinal remodeling.</a> Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).</li>
<li>Soto, F., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+remodeling+of+neuronal+circuits+in+early+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Independent+Oscillatory+Networks+in+the+Degenerating+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Review+of+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy.</a> Mol Ther. 21, 509-519 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> The Lancet. 385, 509-516 (2015).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+Transplantation+in+Late+Stage+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).</li>
<li>Zrenner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+blindness+with+microelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Fighting blindness with microelectronics.</a> Sci Transl Med. 5, (2013).</li>
<li>Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bionic+Eye%3A+A+Quarter+Century+of+Retinal+Prosthesis+Research+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development.</a> Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).</li>
<li>Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argus+II+epiretinal+prosthesis+system+allows+letter+and+word+reading+and+long-term+function+in+patients+with+profound+vision+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss.</a> Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).</li>
<li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words%5BTitle%5D)+AND+%22P+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).</li>
<li>Stronks, H. C., Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+performance+of+the+Argus+II+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">The functional performance of the Argus II retinal prosthesis.</a> Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).</li>
<li>Stingl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+vision+with+wirelessly+powered+subretinal+electronic+implant+alpha-IMS%5BTitle%5D)+AND+%22P+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS.</a> P R Soc B. 280, (2013).</li>
<li>Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+retinal+prosthetic+research%3A+the+Boston+Retinal+Implant+Project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroophthalmol%22%5BJournal%5D)">Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project.</a> J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).</li>
<li>Ayton, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-Human+Trial+of+a+Novel+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis.</a> PLoS ONE. 9, e115239(2014).</li>
<li>Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+implants%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal implants: a systematic review.</a> Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).</li>
<li>Cai, C., Twyford, P., Fried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+retinal+neurons+to+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">The response of retinal neurons to high-frequency stimulation.</a> J Neural Eng. 10, 036009(2013).</li>
<li>Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attaining+higher+resolution+visual+prosthetics%3A+a+review+of+the+factors+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations.</a> J Neural Eng. 10, 011002(2013).</li>
<li>Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolar+surface+electrical+stimulation+of+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina.</a> Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).</li>
<li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+subretinal+microphotodiodes+successfully+replace+degenerated+photoreceptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors?</a> Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).</li>
<li>Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Histological+and+Electrophysiological+Results+of+an+Inactive+Epiretinal+Electrode+Array+Implantation+in+Dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li>
<li>Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+chemical+release+from+an+artificial+synapse+chip%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Localized chemical release from an artificial synapse chip.</a> PNAS. 101, 9951-9954 (2004).</li>
<li>Finlayson, P. G., Iezzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+in+normal+and+s334ter-4+rat+retinas%3A+a+candidate+for+a+neurotransmitter-based+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).</li>
<li>Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+rat+retinal+neurons%3A+feasibility+of+an+epiretinal+neurotransmitter-based+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis.</a> J Neural Eng. 12, 016010(2015).</li>
<li>Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+stimulation+of+the+retina+with+subretinally+injected+exogenous+neurotransmitter%3A+A+biomimetic+alternative+to+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation.</a> Sci Rep. 6, 38505(2016).</li>
<li>Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+alterations+in+retinal+neurons+in+the+S334ter-line3+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat.</a> Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).</li>
<li>Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+two+lines+of+transgenic+S334ter+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats.</a> Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).</li>
<li>Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf</a> (2017).</li>
<li>Reinhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-By-Step+instructions+for+retina+recordings+with+perforated+multi+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays.</a> PLoS ONE. 9, e106148(2014).</li>
<li>Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+swelling%2C+glutamate+uptake%2C+and+excitotoxic+neurodegeneration+in+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina.</a> Glia. 25, 379-389 (1999).</li>
<li>Tunnicliff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+by+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake by chick retina.</a> Biochem J. 150, 297-299 (1975).</li>
<li>Schwartz, E. A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+glutamate+and+sodium+co-transport+in+a+glial+cell+of+the+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina.</a> J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).</li>
<li>Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+glutamate+uptake+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol-+Vasc+S%22%5BJournal%5D)">Free radicals and glutamate uptake in the retina.</a> Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).</li>
<li>Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+threshold+of+a+brisk-transient+ganglion+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro.</a> J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).</li>
<li>Ahlers, M. T., Ammermüller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+precise+temperature+control+of+isolated+nervous+tissue+under+optical+access%3A+Application+to+multi-electrode+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings.</a> J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).</li>
<li>Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+in+the+normal+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow in the normal human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).</li>
<li>The Retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neuroscience%22">Neuroscience</a>. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda demonstruje unikalny paradygmat stymulacji neuronalnej, w którym neurony siatkówki są stymulowane chemicznie poprzez wstrzykiwanie natywnych neuroprzekaźników chemicznych do podpowierzchni siatkówki in vitro. Ta technika stymulacji chemicznej oferuje kilka korzyści w porównaniu z konwencjonalną techniką stymulacji elektrycznej, w tym selektywność i wysoką swoistość ogniskową docelowych neuronów. Powyższy protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób pneumatyczne wstrzyknięcia neuroprzeka...

Choroby zwyrodnieniowe fotoreceptorów, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, są głównymi dziedzicznymi przyczynami utraty wzroku i są obecnie nieuleczalne1,2. Chociaż choroby te wynikają z różnych specyficznych mutacji genetycznych, choroby zwyrodnieniowe fotoreceptorów charakteryzują się jako grupa postępującą utratą komórek fotoreceptorowych w siatkówce, co ostatecznie powoduje ślepotę. Utrata fotoreceptorów powoduje powszechną przebudowę siatkówki, ale neurony siatkówki, które przeżyły, w tym komórki dwubiegunowe i RGC, pozostają nienaruszone i względnie funkcjonalne nawet w zaawansowanych stadiach zwyrodnienia fotoreceptorów3,4,5,6,7.
Mechanizmy i patologie tych chorób zostały dobrze scharakteryzowane3,4,5,6,7 ale skuteczne leczenie pozostaje nieuchwytne. W ciągu ostatnich trzech dekad naukowcy na całym świecie badali różne metody leczenia przywracające wzrok osobom dotkniętym chorobami zwyrodnieniowymi wywołanymi przez fotoreceptory, w tym terapię genową8, leczenie komórkami macierzystymi9, przeszczep siatkówki10 oraz sztuczna stymulacja11,12 neuronów siatkówki, które przeżyły. Spośród nich najbardziej dostępne klinicznie są protezy siatkówki, które są sztucznymi urządzeniami do neurostymulacji, które tradycyjnie wykorzystują układ elektrod do elektrycznej stymulacji komórek dwubiegunowych lub RGC w określonych wzorach w celu stworzenia sztucznej percepcji wzrokowej u pacjentów11. Protezy elektryczne obecnej generacji, takie jak Argus II13 i Alpha-IMS14, uzyskały aprobatę kliniczną, a wstępne badania wykazały, że mogą poprawić jakość życia pacjentów poprzez przywrócenie pomiaru widzenia przy użyciu wszczepionych urządzeń zarówno nasiatkówkowych (przód siatkówki), jak i podsiatkówkowych (tył siatkówki)15,16. Grupy badawcze na całym świecie pracują nad rozwojem protez siatkówki wykraczającym poza sukcesy tych urządzeń pierwszej generacji17,18,19,20 ale napotkały trudności z zaprojektowaniem protezy elektrycznej zdolnej do przywrócenia pacjentom wysokiej ostrości widzenia poniżej ustawowego poziomu ślepoty. Ostatnie badania wykazały, że osiągnięcie wyższej rozdzielczości przestrzennej niż ta, którą umożliwiają protezy elektryczne obecnej generacji, jest wyzwaniem ze względu na limit wstrzykiwania ładunku, co wymaga użycia dużych elektrod do bezpiecznej stymulacji neuronów siatkówki kosztem rozdzielczości przestrzennej, tj. ostrości wzroku11,21. Co więcej, stymulacja elektryczna jest dodatkowo ograniczona, ponieważ zazwyczaj stymuluje wszystkie pobliskie komórki, a zatem wywołuje nienaturalne i mylące percepcje u pacjentów, głównie dlatego, że jest to z natury nienaturalny paradygmat stymulacji21. Niemniej jednak wczesne sukcesy stymulacji elektrycznej pokazały, że sztuczna neurostymulacja może być skutecznym sposobem leczenia chorób zwyrodnieniowych fotoreceptorów. Prowadzi to do hipotezy, że jeszcze skuteczniejsze leczenie może być osiągalne poprzez stymulację siatkówki neuroprzekaźnikami chemicznymi, naturalnymi czynnikami komunikacji w synapsach chemicznych. Celem metody przedstawionej w niniejszej pracy jest zbadanie możliwości terapeutycznej stymulacji chemicznej, która ma na celu naśladowanie naturalnego systemu komunikacji synaptycznej między neuronami siatkówki, jako biomimetycznej alternatywy dla stymulacji elektrycznej protezy siatkówki.
Tłumaczenie koncepcji terapeutycznej stymulacji chemicznej na chemiczną protezę siatkówki polega na chemicznej aktywacji docelowych neuronów siatkówki za pomocą małych ilości natywnych neuroprzekaźników, takich jak glutaminian, uwalnianych przez urządzenie mikroprzepływowe zawierające dużą gamę mikroportów w odpowiedzi na stymulację wzrokową. W ten sposób chemiczna proteza siatkówki byłaby zasadniczo biomimetyczną sztuczną warstwą fotoreceptorów, która tłumaczy fotony naturalnie docierające do siatkówki na sygnały chemiczne. Ponieważ te sygnały chemiczne wykorzystują te same neuroprzekaźniki, które są wykorzystywane w normalnej sygnalizacji siatkówki i stymulują ocalałe neurony siatkówki zdegenerowanej siatkówki poprzez te same szlaki synaptyczne, które są używane przez normalne ścieżki widzenia, wynikowa percepcja wzrokowa uzyskana przez chemiczną protezę siatkówki może być bardziej naturalna i zrozumiała w porównaniu z tą, która jest wywoływana przez protezę elektryczną. Co więcej, ponieważ mikroporty, przez które uwalniane są neuroprzekaźniki, mogą być bardzo małe i ułożone w dużej gęstości, w przeciwieństwie do elektrod, potencjalna proteza chemiczna może być w stanie osiągnąć większą stymulację ogniskową i wyższą rozdzielczość przestrzenną niż proteza elektryczna. Tak więc, w oparciu o te potencjalne zalety, chemiczna proteza siatkówki stanowi bardzo obiecującą alternatywę dla protez elektrycznych.
Chemiczna stymulacja siatkówki, do niedawna była stosunkowo mało zbadana. Podczas gdy elektryczna stymulacja siatkówki została dobrze scharakteryzowana przez dziesięciolecia pracy w ramach in vitro22,23, in vivo23,24, oraz badań klinicznych13,14, badania nad stymulacją chemiczną zostały ograniczone wyłącznie do kilku prac in vitro25,26,27,28. Iezzi i Finlayson26 oraz Inayat et al.27 zademonstrował epiretinalną stymulację chemiczną siatkówki in vitro za pomocą odpowiednio pojedynczej elektrody i matrycy wieloelektrodowej (MEA), w celu zarejestrowania wywołanych glutaminianem reakcji neuronów siatkówki. Ostatnio Rountree i wsp.28 zademonstrował różnicową stymulację ścieżek siatkówkowych OFF i ON za pomocą glutaminianu od strony podsiatkówkowej i MEA do rejestrowania odpowiedzi neuronalnych z wielu miejsc na siatkówce. Chociaż prace te wstępnie ustaliły wykonalność stymulacji chemicznej, niezbędne są dalsze badania, aby zbadać wiele aspektów tego podejścia poza tymi, które omówiono do tej pory25,26,27,28 i dostroić parametry stymulacji terapeutycznej zarówno in vitro, jak i in vivo modele zwierzęce przed przełożeniem tej koncepcji na chemiczną protezę siatkówki, jak omówiono powyżej. Obecnie jednak w literaturze nie ma ustalonej metodyki przeprowadzania chemicznej stymulacji siatkówki, a metody zastosowane w poprzednich pracach nie zostały opisane na tyle szczegółowo, aby było to niezbędne dla badań replikatywnych. Dlatego uzasadnieniem dla tego artykułu jest zapewnienie dobrze zdefiniowanych ram do prowadzenia chemicznej stymulacji siatkówki in vitro dla tych badaczy zainteresowanych powtórzeniem naszych poprzednich badań27,28 lub dalszym rozwojem tej rodzącej się koncepcji neurostymulacji chemicznej.
Tutaj demonstrujemy metodę przeprowadzania in vitro chemicznej stymulacji neuronów siatkówki w całych siatkówkach dzikich szczurów oraz model zdegenerowanego fotoreceptora szczura, który ściśle naśladuje postęp chorób zwyrodnieniowych fotoreceptorów u ludzi. Przesłanką do opracowania tej metody stymulacji w modelach in vitro jest ocena zakresów terapeutycznych różnych parametrów stymulacji oraz zbadanie charakterystyk odpowiedzi neuronalnej, które byłyby niemożliwe lub trudne do zaobserwowania w modelach in vivo, zwłaszcza podczas wstępnych badań skoncentrowanych na ocenie wykonalności tego podejścia. W tej procedurze pokazujemy zarówno jednomiejscową, jak i jednoczesną wielomiejscową stymulację chemiczną siatkówki poprzez dostarczanie niewielkich ilości 1 mM glutaminianu w pobliżu docelowych neuronów siatkówki za pomocą dostępnych na rynku jednoportowych szklanych mikropipet i niestandardowego wieloportowego urządzenia mikroprzepływowego poddanego mikroobróbce. Podczas gdy zarówno stymulacje jednomiejscowe, jak i wieloośrodkowe spełniają podstawowy cel, jakim jest zbadanie terapeutycznej wykonalności neuromodulacji chemicznej, każda z nich służy innemu celowi z unikalną zaletą. Stymulacja w jednym miejscu, która może być osiągnięta za pomocą dostępnych na rynku wstępnie wyciągniętych szklanych mikropipet, może być wykorzystana do wstrzykiwania chemikaliów bezpośrednio do podpowierzchni siatkówki w jednym miejscu i służy do zbadania, czy obserwowalne reakcje na impulsy RGC, które są podobne do wizualnie wywołanych reakcji świetlnych, mogą być wywołane ogniskowo pod miejscem wstrzyknięcia. Z drugiej strony, stymulacja wielomiejscowa, która wymaga specjalnie wyprodukowanego wieloportowego urządzenia mikroprzepływowego, może być wykorzystywana do przestrzennego wstrzykiwania chemikaliów w wiele miejsc na powierzchni siatkówki i służy do zbadania, jak dobrze wzorce odpowiedzi RCG wywołane glutaminianem odpowiadają wzorcom wstrzykiwania glutaminianu w badaniach stymulacji wzorców.

<table><tbody><tr><td>Układ mikroelektrod, układ perforowany</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>MEA Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Dolna płyta perfuzyjna do pMEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td></td></tr><tr><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp 3-osiowy zmotoryzowany mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>System sterowania mikromanipulatorem</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Styl bramowy Statyw mikromanipulatora z prowadnicą liniową</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html 8-kanałowy programowalny wielokanałowy wtryskiwacz ciśnienia</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Dostawca: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 lub PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Producent: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Integrujący wzmacniacz zacisków krosowych</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A został zastąpiony nowszym modelem Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Zacisk krosowy headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania próżni</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Wstępnie wyciągnięte 10 &mu; Średnica końcówki m Mikropipety</td><td>szklane World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr> <tr><td>Zoom stereomikroskop</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>Statyw do mikroskopu z podwójną kulką liniową ramię łożyska</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z hybrydowym stojakiem LED C-LEDS Nikon</td><td>, Tokio, Japonia</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Odwrócony system mikroskopowy</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td>Zaćmienie Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy (glutaminian)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm (wysokość 10 mm)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>60 mm przezroczysta szalka Petriego; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jubilerzy #5 Kleszcze</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Standard Scalpel Blad #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Rękojeść skalpela #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tubingen Dissectsors</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td></td><td>503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr> <tr><td>zestaw siatek nylonowych</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Siatka do plastrów harfy</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, Nowy Jork</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> <tr><td>Ag/AgCl granulat elektrody referencyjnej</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>4-kanałowy system perfuzji grawitacyjnej sterowany zaworem</td><td>ALA Instrumenty naukowe, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>Kamera</td></tr> <tr><td>mikroskopowa http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ Zyla 5.5 sCMOS</td><td>Andor Technology, Belfast, Wielka Brytania</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>Srebrny drut (50 &mu; średnica m)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>rurki z mikrootworami Tygon (średnica 1,6 mm)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>Uchylny uchwyt narzędziowy ze stalową kaniulą</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, Nowy Jork</td><td>TILTPORT</td><td>Po jednym z nich wykorzystano do górnej perfuzji i odsysania; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Jasnoczerwony arkusz filtracyjny</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Producent: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Producent: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Wesson Galaxy Czerwona latarka</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Producent: https://www.smith-wesson.com/ Producent: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements: Oprogramowanie do badań podstawowych</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Choroby zwyrodnieniowe fotoreceptorów powodują nieodwracalną ślepotę poprzez postępującą utratę komórek fotoreceptorów w siatkówce. Protezy siatkówki są nową metodą leczenia chorób zwyrodnieniowych fotoreceptorów, która ma na celu przywrócenie wzroku poprzez sztuczną stymulację ocalałych neuronów siatkówki w nadziei na wywołanie zrozumiałej percepcji wzrokowej u pacjentów. Obecne protezy siatkówki wykazały sukces w przywracaniu ograniczonego wzroku pacjentom przy użyciu szeregu elektrod do elektrycznej stymulacji siatkówki, ale napotykają znaczne bariery fizyczne w przywracaniu pacjentom wysokiej ostrości, naturalnego widzenia. Neurostymulacja chemiczna z wykorzystaniem natywnych neuroprzekaźników jest biomimetyczną alternatywą dla stymulacji elektrycznej i może ominąć podstawowe ograniczenia związane z protezami siatkówki za pomocą neurostymulacji elektrycznej. W szczególności neurostymulacja chemiczna ma potencjał, aby przywrócić pacjentom bardziej naturalne widzenie z porównywalną lub lepszą ostrością wzroku poprzez wstrzykiwanie bardzo małych ilości neuroprzekaźników, tych samych naturalnych środków komunikacji używanych przez synapsy chemiczne siatkówki, w znacznie lepszej rozdzielczości niż obecne protezy elektryczne. Jednakże, jako stosunkowo niezbadany paradygmat stymulacji, nie ma ustalonego protokołu osiągania chemicznej stymulacji siatkówki in vitro. Celem tej pracy jest zapewnienie szczegółowych ram do osiągnięcia chemicznej stymulacji siatkówki dla badaczy, którzy chcą zbadać potencjał chemicznej neuromodulacji siatkówki lub podobnych tkanek nerwowych in vitro. W tej pracy opisujemy eksperymentalną konfigurację i metodologię wywoływania reakcji kolców komórek zwojowych siatkówki (RGC) podobnych do reakcji światła wzrokowego w siatkówkach szczurów typu dzikiego i zdegenerowanych przez fotoreceptory poprzez wstrzykiwanie kontrolowanych objętości neuroprzekaźnika glutaminianu do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą szklanych mikropipet i niestandardowego wieloportowego urządzenia mikroprzepływowego. Ta metodologia i protokół są na tyle ogólne, że można je dostosować do neuromodulacji przy użyciu innych neuroprzekaźników, a nawet innych tkanek nerwowych.

Ten protokół może być używany do chemicznej stymulacji zarówno normalnych, dzikich siatkówk, jak i zdegenerowanych przez fotoreceptory, pomimo znacznej przebudowy komórkowej spowodowanej utratą fotoreceptorów. Przed rozpoczęciem eksperymentów z siatkówkami zdegenerowanymi przez fotoreceptory lub dzikimi, sprzęt do rejestracji i stymulacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2) muszą być przygotowane, a pMEA (<silna klasa="xfig">Rysunek 5...

Ten protokół opisuje nowatorską metodę badania formy chemicznej neurostymulacji całych siatkówek szczurów in vitro za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu. Neurostymulacja chemiczna jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej neurostymulacji elektrycznej neuronów siatkówki w leczeniu nieodwracalnej ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Ogólnym celem tej metodologii jest umożliwienie nowatorskiej neuromodulacji neuronów siatkówki opartej na chemii przy użyciu neuroprzekaźników, które mogłyby potencjalnie zastąpić funkcjonalność wadliwych komórek siatkówki u pacjentów ze ślepotą neurodegeneracyjną w celu przywrócenia wzroku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sztucznego widzenia. Na przykład, czy glutaminian, główny neuroprzekaźnik siatkówki, może być stosowany do terapeutycznej stymulacji zdegenerowanej siatkówki spowodowanej fotoreceptorem?Główną zaletą naszej techniki jest to, że jest biomimetyczna, stymulacja siatkówki w ten sposób daje potencjał wyższej ostrości wzroku i bardziej naturalistycznego widzenia niż jest to możliwe w przypadku stymulacji elektrycznej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku leczenia ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów, ponieważ wczesna interwencja terapeutyczna zdegenerowanej siatkówki może przywrócić wrażliwość na glutaminian w neuronach siatkówki. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść oba wyłuszczone oczy na szalce Petriego o średnicy 60 milimetrów ze świeżym natlenionym roztworem pożywki Amesa.Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wykonaj małe nacięcie w powierzchni rogówki za pomocą skalpela lub ostrych nożyczek. Następnie wykonaj cięcie od tego małego nacięcia do krawędzi rogówki. I rozciągnij go w odcinku obwodowym wokół całej krawędzi rogówki.Następnie usuń oderwaną rogówkę wraz z soczewką, półprzezroczystą cieczą wodnistą i ciałem szklistym. Delikatnie trzymając muszlę oczną jedną parą kleszczyków, ostrożnie wykonaj dwa małe nacięcia po przeciwnych stronach muszli ocznej. Następnie użyj dwóch par kleszczy, aby delikatnie rozsunąć muszlę oczną przy każdym z nacięć.I oddziel siatkówkę od twardówki. Powoli unieś całą siatkówkę z twardówki i muszli ocznej i przetnij nerw wzrokowy, jeśli jest nadal przyczepiony. Następnie wykonaj podłużne nacięcia w siatkówce, aby uzyskać połówki lub ćwiartki.A następnie delikatnie rozprowadź jeden odcinek siatkówki na nylonowej siatce tak, aby komórki zwojowe były skierowane od siatki. Umieść siatkę i siatkówkę na perforowanym układzie wieloelektrodowym, tak aby komórki zwojowe stykały się z powierzchnią PMEA. A następnie umieść ciężarek na siatce, aby utrzymać siatkówkę na miejscu.W tej procedurze, przy słabym czerwonym oświetleniu, umieść PMEA w MEA amplifier i zamknij amplifier zatrzaski. Umieść górny wylot perfuzji w komorze PMEA i włącz górny zawór perfuzyjny, aby uzyskać szybkość perfuzji około trzech mililitrów na minutę. Następnie ustaw górny wlot ssący na żądanym ósmym poziomie perfuzji.Upewnij się, że działa. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji danych i kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć odbieranie danych. Upewnij się, że wszystkie kanały PMEA są wolne od zakłóceń i rejestrują sygnały neurologiczne.Jeśli nie, zmień położenie PMEA we wzmacniaczu, aby uzyskać lepszy kontakt między pinami wzmacniacza a stykami PMEA. Następnie upewnij się, że dolna linia perfuzji jest wolna od pęcherzyków powietrza. Włącz dolny zawór perfuzyjny, aby upewnić się, że siatkówka jest zaopatrywana w tlen i składniki odżywcze.Następnie włącz szybką kamerę dołączoną do odwróconego mikroskopu optycznego i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Po potwierdzeniu, że dolna perfuzja płynie, powoli zwiększaj dolne ssanie, ręcznie obracając pokrętło podciśnienia na zestawie odpadów próżniowych, obserwując siatkówkę przez odwrócony mikroskop. Gdy zaobserwujesz, że siła ssania działa na siatkówkę, przestań zwiększać ssanie.Po upewnieniu się, że siatkówka została utrzymana na miejscu przez dolne ssanie, zdejmij ciężar z siatkówki za pomocą kleszczy i delikatnie usuń nylonową siatkę, ostrożnie odrywając jeden róg od siatkówki. Utrzymuj perfuzję przez około 30 minut, aby siatkówka ustabilizowała się po urazie chirurgicznym. Na tym etapie ostrożnie włóż wstępnie wyciągniętą mikropipetę o średnicy 10 mikrometrów do standardowego uchwytu na pipety zawierającego elektrodę drucianą z chlorku srebra i srebra o średnicy 50 mikrometrów.Jeśli zamiast tego używasz wieloportowego urządzenia mikroprzepływowego, włóż pręt ze stali nierdzewnej podłączony do urządzenia do standardowego uchwytu na pipety bez drutu elektrodowego. W przypadku korzystania ze szklanej mikropipety należy połączyć uchwyt pipety z zaciskiem krosowym i podłączyć dolne przyłącze portu ciśnieniowego uchwytu pipety do jednego z kanałów systemu wtrysku ciśnieniowego. Lub, jeśli korzystasz z urządzenia wieloportowego, podłącz złącza luer portu ciśnieniowego każdego z ośmiu portów wtrysku z kanałem od pierwszego do ósmego systemu wtrysku ciśnieniowego.Następnie ręcznie włącz system wtrysku ciśnieniowego i włącz kanał pierwszy. Upewnij się, że system jest odpowietrzony do atmosfery i ustaw ciśnienie wtrysku na 0.1 funta na cal kwadratowy. Następnie włącz mikromanipulator i skalibruj go, naciskając przycisk kalibracji na sterowniku manipulatora.Ustaw mikromanipulator tak, aby końcówka mikropipety znajdowała się około 30 milimetrów nad wzmacniaczem MEA. Następnie napełnij małą szalkę Petriego roztworem glutaminianu i umieść ją pod mikromanipulatorem. Opuść końcówkę mikropipety do roztworu i napełnij szklaną mikropipetę lub rurkę urządzenia wieloportowego roztworem o grubości około 20 milimetrów.Następnie wyjmij końcówkę lub urządzenie do mikropipet z roztworu. Wyjmij szalkę Petriego i umieść mikromanipulator nad komorą PMEA. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zamontowanego na wysięgniku wyrównaj końcówkę mikropipety lub rogi urządzenia ze znakiem odniesienia wytrawionym w pierścieniu komory PMEA.Następnie zapisz pozycje manipulatora na powierzchni sterowej za pomocą przycisków zapisz odniesienie A i zapisz odniesienie B, aby odwzorować układ współrzędnych manipulatora elektrod PMEA. Następnie użyj oprogramowania sterującego manipulatorem. Wybierz docelową elektrodę PMEA o silnej spontanicznej aktywności i kliknij przycisk przejścia do kanału, aby wyrównać szklaną mikropipetę z elektrodą docelową.Jeśli korzystasz z urządzenia wieloportowego, dopasuj mikroporty urządzenia do docelowych elektrod PMEA o silnej spontanicznej aktywności przy użyciu tego samego procesu. Jeśli pomiar impedancji jest dostępny, włącz patch clamp amplifier i zainicjuj oprogramowanie do wizualizacji impedancji, klikając przycisk Start, aby zobrazować impedancję elektrody chlorkowo-srebrnej wewnątrz uchwytu pipety. Obserwując sygnały impedancji w czasie rzeczywistym, powoli opuszczaj mikropipetę lub urządzenie, aż zetknie się z powierzchnią siatkówki, na co wskazuje szybki wzrost sygnału impedancji.W przypadku stymulacji podpowierzchniowej opuść pipetę o 40 mikrometrów dalej w przypadku siatkówki S334 tera trzy lub o 70 mikrometrów w przypadku siatkówki typu dzikiego. Wykonaj kilka krótkotrwałych wstrzyknięć za pomocą systemu wtrysku ciśnieniowego. Aby określić, czy komórki w pobliżu końcówki mikropipety lub mikroportów urządzenia są podatne na stymulację glutaminianu poprzez obserwację neurosygnałów.Teraz skieruj zieloną diodę LED w kierunku górnej powierzchni siatkówki. Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do akwizycji danych, wpisując nazwę pliku i klikając przycisk nagrywania. Po rozpoczęciu nagrywania otwórz program do kontroli bodźca i załaduj domyślny plik bodźca, klikając przycisk odczytu pliku bodźca.Następnie kliknij przycisk uruchom plik bodźca, aby zainicjować domyślny plik bodźca. Po zakończeniu tworzenia pliku bodźca zatrzymaj nagrywanie, aby zapisać plik do przyszłego sortowania i analizy danych. Oto reprezentatywne nagrania z dziewięciu elektrod PMEA, pokazujące dane elektrody filtrowanej górnoprzepustowo podczas wizualnej stymulacji światłem za pomocą zielonej diody LED, gdzie każdy prostokąt pokazuje dane neuronowe z unikalnej elektrody.Zapis każdej elektrody obrazuje dane zebrane w pierwszej sekundzie po włączeniu zielonej diody LED. Skoki zostały zidentyfikowane za pomocą napięcia progowego wynoszącego minus 18 mikrowoltów. Stymulacja wizualna spowodowała wybuch skoków we wszystkich elektrodach z wyjątkiem górnej środkowej, która posiadała hamującą reakcję na światło.Podobny wykres dla tych samych elektrod, pokazujący spontaniczną aktywność neuronalną bez stymulacji wizualnej lub iniekcyjnej. Chociaż obecne były mniejsze impulsy, wzorce skoków bardzo różniły się od tych zarejestrowanych w odpowiedzi na stymulację wizualną. Poniżej znajdują się reprezentatywne nagrania z tego samego podzbioru elektrod zarejestrowanych bezpośrednio po wstrzyknięciu glutaminianu do elektrody centralnej.Wstrzyknięty glutaminian wywołał impuls skoków w elektrodzie centralnej, który był bardzo podobny do wizualnie wywołanych impulsów kolców. Wszystkie inne elektrody pozostały nienaruszone przez wstrzyknięcie glutaminianu, co świadczy o doskonałej rozdzielczości przestrzennej techniki stymulacji chemicznej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu perfuzji, aby upewnić się, że siatkówka jest stale zaopatrywana w tlen i składniki odżywcze przez cały czas trwania eksperymentu. Technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się sztucznym widzeniem i opracowywaniem protez wzrokowych do zbadania neuromodulacji opartej na chemikaliach w leczeniu ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osiągnąć neuromodulację neuronów siatkówki za pomocą neuroprzekaźników.

methodology-for-biomimetic-chemical-neuromodulation-rat-retinas-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Dzięki temu badaniu wprowadzamy standaryzowany model stresu dla izolowanej superkrwistej siatkówki bydlęcej do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych. Oceniano wpływ hipoksji (czysty N2) lub stresu glutaminianu (250 μM glutaminianu) na funkcję siatkówki reprezentowaną przez amplitudy załamków a i b.

Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Protokół pokazuje, że przeprowadzając mikroprzeszczepy błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis, można rejestrować spójne i niezawodne odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego i kwasu γ-aminomasłowego.

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Poznaj metodę biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą glutaminianu in vitro. Ta technika oferuje potencjał wyższej ostrości wzroku i bardziej naturalnego widzenia niż stymulacja elektryczna.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Przeglądaj więcej filmów