Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc
28 czerwca 2018
Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.
Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie skuteczności przeszczepiania komórek raka płuc inicjujących nowotwór do dróg oddechowych myszy. Metoda ta może pomóc w ustanowieniu nowych modeli przedklinicznych w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii nowotworów, w tym przyczyny oporności na leki i związek między zwłóknieniem a rakiem płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że zwiększa ona skuteczność przeszczepu komórek inicjujących nowotwór do płuc różnych szczepów myszy.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii, ponieważ umożliwia nam modelowanie większej różnorodności podtypów ludzkiego raka płuc, o których wiadomo, że mają różne odpowiedzi kliniczne na leczenie. W przypadku tego protokołu myszom należy najpierw wstrzyknąć bleomycynę. Następnie, po 14 dniach, wstrzykuje się komórki nowotworowe.
Procedura dla obu zastrzyków jest bardzo podobna i opisana tutaj. Dwie godziny przed wstrzyknięciem rozmrozić bulion z bleomycyny na lodzie i rozcieńczyć go do stężenia roboczego. Trzymaj go na lodzie.
W przypadku bolusa komórkowego należy przygotować zawiesinę komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Czas procedury dla każdej myszy wynosi łącznie około 10 minut. Pamiętaj, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie za pomocą szczypania palca u nogi i nałożyć maść weterynaryjną na oczy.
W tym momencie, jeśli mysz ma ciemne włosy, ogol cały obszar żeber zarówno brzusznie, jak i grzbietowo, aby można go było poprawnie zobrazować. Następnie umieść mysz na platformie intubacyjnej, zabezpieczając ją przednimi zębami, tak aby tyłem opierała się o platformę. Jeśli ma zostać wstrzyknięty bolus komórkowy, należy go teraz ponownie zawiesić, delikatnie rozcierając.
Teraz oświetl górną część klatki piersiowej, otwórz usta i delikatnie wyciągnij język za pomocą płaskich kleszczy. Przygotuj cewnik dożylny do tchawicy, wyjmując igłę, a następnie umieść go nad otworem tchawicy. Następnie wprowadź cewnik do tchawicy, aż górna część cewnika znajdzie się w pobliżu przednich zębów i oświetl wnętrze cewnika, aby potwierdzić jego umieszczenie.
Następnie dozuj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej bleomycyny lub zawiesiny komórkowej bezpośrednio do cewnika. Odczekaj kilka sekund, aż cała objętość przesunie się w dół cewnika. Następnie wyjmij cewnik i wyrzuć go do 10% wybielacza.
Jeśli mysz nie wdycha płynu, uważnie monitoruj jej oddech i wyreguluj położenie cewnika. Jeśli mysz przestanie oddychać, natychmiast wyjmij cewnik i pozwól myszy oddychać przed ponownym włożeniem cewnika. Po usunięciu cewnika kontynuuj wykonywanie zabiegu, aby pięć leczonych myszy było nadal znieczulonych i gotowych do obrazowania.
W celu rekonwalescencji umieść mysz na wznak na poduszce grzewczej zatwierdzonej przez IACUC w klatce regeneracyjnej i monitoruj ją, aż w pełni wyzdrowieje. Dwie lub trzy minuty po wstrzyknięciu komórek wstrzyknij 100 mikrolitrów lucyferyny wstecz-orbitalnie, za pomocą igły insulinowej. Zmieniaj oko używane do wstrzykiwań podczas każdej sesji obrazowania.
Po odczekaniu co najmniej dwóch minut, umieść do pięciu myszy w zwierzęcym obrazie bioluminescencyjnym w pozycji leżącej mostka i uzyskaj obraz grzbietowy przy użyciu ustawień luminescencji. Pod panelem sterowania dostosuj ustawienia rozdzielczości i czułości, aby zmierzyć luminescencję komórek. W przypadku większości zastosowań zacznij od trzech minut, ustaw kategoryzację na średnią, ustaw przysłonę f/stop na jeden, ustaw pole widzenia na d i ustaw wysokość obiektu na 1,5.
Jeśli wstrzyknięcie się powiodło, wykrywany jest sygnał w górnej części klatki piersiowej w jednym płucu lub w obu płucach. Jeśli komórki są skupione przy wejściu tchawicy, wstrzyknięcie nie powiodło się. Po wykonaniu zdjęcia grzbietowego odwróć myszy i uzyskaj obraz brzuszny, a następnie dostosuj ustawienie w razie potrzeby.
Po wykonaniu badań obrazowych należy przystąpić do opieki pooperacyjnej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie powtórz ten protokół obrazowania trzy dni po wszczepieniu, a następnie co tydzień. Do analizy obrazów należy użyć oprogramowania do analizy bioluminescencji.
Najpierw załaduj wszystkie odpowiednie obrazy w serii. Ta sekcja jest szczegółowo opisana w jednym pakiecie oprogramowania. Następnie dla każdej myszy, na pierwszym obrazie z serii, utwórz kwadratowy obszar zainteresowania i umieść go nad górnym obszarem klatki piersiowej obejmującym cały obszar płuc.
Następnie, za pomocą prawego przycisku myszy, uzyskaj dostęp do funkcji kopiowania wszystkich obszarów zainteresowania i użyj tego narzędzia, aby zastosować te same obszary zainteresowania do każdego obrazu w grupie. Następnie na każdym obrazie dostosuj pozycje kwadratów, aby zakryć górną część klatki piersiowej każdej myszy. Zrób to zarówno dla widoku brzusznego, jak i grzbietowego.
Teraz w lewym górnym rogu okna obrazu wybierz funkcję fotonów. Następnie wybierz opcję miary. Dane z obszarów zainteresowania są następnie wyświetlane w tabeli wyjściowej jako całkowity strumień.
Przeanalizuj te dane zgodnie z potrzebami. Gdy odporność była osłabiona, myszy atymiczne były leczone bleomycyną. Przed wszczepieniem bolusa komórkowego przejściowe zwłóknienie obserwowano do 14 dnia u myszy leczonych bleomycyną, ale nie u myszy leczonych nośnikiem.
Następnie komórki z ustalonej linii komórkowej ludzkiego raka płuc, H2030, zostały dostarczone dotchawiczo do płuc tych myszy. Po 35 dniach myszy leczone bleomycyną miały duże obciążenie guzem płuc. Jednak u zwierząt leczonych podłożem nie wykryto żadnych nowotworów.
Obciążenie guzem płuc potwierdzono za pomocą badania histologicznego. Płuca wstępnie leczone nośnikiem nie miały śladów guzków nowotworowych, podczas gdy płuca poddane wstępnej działaniu bleomycyny miały duże guzki nowotworowe. Po przeszczepieniu przerzutowej linii komórkowej H2030 BrM 3, w ciągu 39 do 57 dni, bioluminescencja była zbyt intensywna do obrazowania, więc przerzuty analizowano w odległych narządach ex vivo.
Niewielkie zmiany można było wykryć w różnych tkankach, co sugeruje, że ta metoda jest obiecująca w badaniu spontanicznie rozsianej choroby. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 10 minut na klatkę pięciu myszy bez obrazowania i 20 minut na klatkę, gdy obrazuje się również myszy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym wprowadzeniu cewnika i monitorowaniu oddechu zwierzęcia.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak badania farmakologiczne lub chemia aminooctowa pobranej tkanki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak wszczepione guzy reagują na leki lub scharakteryzować interakcje zrębu guza specyficzne dla płuc. Po opracowaniu technika ta może być stosowana do różnych szczepów myszy i modeli nowotworów, w tym ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w fizjologicznie odpowiednich warunkach. Nie zapominaj, że praca z bleomycyną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak manipulacja w kapturze stanowiącym zagrożenie biologiczne i odpowiednia utylizacja.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę polepszenia przyjęcia komórek raka płuc w płucach myszy poprzez wstępne przygotowanie dróg oddechowych poprzez uszkodzenie. Ta technika może ułatwić badanie interakcji stromy, rozsiewu przerzutowego i współistnienia raka płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Badania translacyjne
- Modele przedkliniczne
Tło
- Transplantacja komórek raka płuc inicjujących nowotwory do myszy jest kluczowa dla badań nad biologią raka.
- Zrozumienie oporności na leki i związku między przewlekłym zapaleniem a rakiem płuc jest istotne.
- Różne podtypy ludzkiego raka płuc reagują różnie na leczenie.
- Obecne modele mogą nie adekwatnie reprezentować te różnice.
Cel badania
- Aby poprawić efektywność transplantacji komórek raka płuc u myszy.
- Aby ustanowić modele przedkliniczne, które mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii raka.
- Aby modelować szerszy zakres ludzkich podtypów raka płuc.
Zastosowanie metod
- Myszy są injektowane z bleomycyną, aby wywołać uszkodzenie dróg oddechowych.
- Po 14 dniach komórki nowotworowe są wstrzykiwane do dróg oddechowych.
- Efektywność przyjęcia jest oceniane na różnych szczepach myszy.
- Przeprowadzana jest analiza interakcji stromy i zachowania przerzutowego.
Główne wyniki
- Metoda znacząco zwiększa efektywność transplantacji komórek inicjujących nowotwory.
- Pozwala na modelowanie różnych podtypów raka płuc.
- Uzyskane są wglądy w związek między rakiem płuc a przewlekłym zapaleniem.
- Zostają podkreślone potencjalne implikacje dla terapii i zrozumienia oporności na leki.
Wnioski
- Ta technika poprawia badania nad biologią raka płuc w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia platformę do badania reakcji terapeutycznych w różnych podtypach raka płuc.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do eksploracji nowych strategii leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
