Name: Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj protokoły immunofluorescencyjnego znakowania mikrotubul i białek centrosomalnych w trójwymiarowych organoidach jelitowych oraz tkance ex vivo. Metody obejmują izolację, fiksację formaldehydowo-metanolową i barwienie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Paulowi Thomasowi za porady i pomoc w zakresie mikroskopu. Prace te były wspierane przez BBSRC (grant nr. BB/J009040/1 do M.M.M. i T.W.).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Izolacja tkanki jelitowej Izolacja krypt i kosmków jelita cienkiego oraz krypt okrężnicy polega na odsłonięciu powierzchni błony śluzowej, potraktowaniu roztworem EDTA w celu rozluźnienia kontaktów komórkowych, frakcjonowaniu (wstrząsaniu) i odwirowaniu. Przedstawiony protokół izolacji kosmków jelitowych/krypty został zmodyfikowany na podstawie Belshaw i wsp. oraz Whiteheada i wsp.17,18
Odsłanianie powierzchni błony śluzowej Eksperymentowaliśmy z wieloma podejściami do odsłonięcia powierzchni błony śluzowej przewodu pokarmowego podczas opracowywania tej procedury. Klasycznym podejściem jest wywrócenie rurki (odwrócenie jej na lewą stronę), zwykle w segmentach o długości około 100 mm, za pomocą metalowego pręta, który jest chwytany w fałdzie tkanki na jednym końcu, a następnie pozostała rurka nasunięta na rurkę19. W przypadku tkanek myszy idealny jest metalowy pręt (średnica 2,4 mm) z zaokrąglonymi końcami. Takie podejście ma tę zaletę, że rozszerza powierzchnię błony śluzowej, umożliwiając lepszy dostęp do PBS i EDTA. Początkowo stosowaliśmy to podejście, ale przeszliśmy do cięcia rurki na krótkie odcinki (około 5 cm) i otwierania każdej sekcji nożyczkami preparacyjnymi, ponieważ okazało się to łatwiejsze. Takie podejście jest odpowiednie, jeśli wymaganych jest tylko kilka jelit; ale jeśli w eksperymencie miałoby zostać użytych więcej zwierząt, to specjalnie skonstruowane urządzenie do rozcinania rurki wzdłużnie, jak opisali Yoneda i wsp.14 byłoby bardziej efektywne.
Oderwanie kosmków i krypt od warstwy mięśniowej Początkowo zastosowaliśmy 3 mM EDTA w PBS i stosunkowo długi czas inkubacji do 60 minut, aby rozluźnić powierzchnię błony śluzowej z leżącej poniżej tkanki17,18. Przy tym stężeniu EDTA stwierdziliśmy, że czas inkubacji wynoszący 30 minut był wystarczający do rozluźnienia krypt z okrężnicy myszy. Jednak w przypadku izolacji krypty/kosmków jelita cienkiego próbowaliśmy użyć bardziej skoncentrowanego EDTA przez krótszy czas, co okazało się skutecznym podejściem. Wszystkie późniejsze prace przeprowadzono z tkanką ekstrahowaną przy użyciu techniki 30 mM EDTA, generując odpowiednie frakcje dla kosmków lub krypt. W przypadku krypt zwykle łączymy frakcje 3 - 5 przed ustaleniem, ale ważne jest, aby sprawdzić, czy są to odpowiednie frakcje, ponieważ czas będzie zależał od wielu czynników, takich jak pozycja wzdłuż przewodu pokarmowego, wiek myszy, stan zapalny, poprzednia dieta itp. Podobnie, czas trwania wstrząsu tkanki po leczeniu EDTA, aby był skuteczny, może się różnić w różnych warunkach. Wynikiem są izolowane frakcje tkankowe zawierające mieszaninę kosmków i krypt lub głównie kosmków lub krypt (ryc. 2). Ponieważ w okrężnicy nie ma kosmków, ekstrakcja krypty może być możliwa do osiągnięcia w jednym kroku, potrząsając tkanką w probówce przez 30 sekund. Frakcje te można następnie utrwalić i przetworzyć w celu znakowania immunologicznego.
Izolacja organoidów jelitowych z macierzy podstawnej Izolację organoidów z kopuł macierzy piwnicznej można osiągnąć za pomocą roztworu do odzyskiwania komórek. Roztwór działa poprzez depolimeryzację zżelowanej matrycy podstawowej, ale temperatura musi wynosić 2 - 8 °C. Należy pamiętać, że dynamiczne mikrotubule mogą nie zostać zachowane. W związku z tym w przypadku znakowania immunologicznego dynamicznych mikrotubul i +TIP, takich jak komórka EBs, nie zaleca się odzyskiwania z macierzy podstawowej przed utrwaleniem. Jednak większość mikrotubul w różnicujących się komórkach organoidowych jest stosunkowo stabilna i zostały one zachowane (ryc. 6). Sprawdził się również w przypadku znakowania immunologicznego białek centrosomalnych i złączowych, a także markerów komórkowych.
Protokoły fiksacji Formaldehyd (świeżo wyprodukowany z PFA) jest stosunkowo szybko działającym utrwalaczem, który tworzy odwracalne wiązania krzyżowe, a 4% PFA działa dobrze na przykład w mikrotubulach znakujących immunologicznie i gamma-tubulinie oraz barwieniu filamentów aktynowych falloidyną. Bardziej rozcieńczone roztwory PFA, takie jak 1%, działały dobrze w przypadku znakowania immunologicznego, na przykład z markerami komórek macierzystych Lgr5 i markerem komórek Panetha CD24 w niszy krypt komórek macierzystych, podczas gdy wyższe stężenia PFA nie działały.
Dodatek aldehydu glutarowego zapewnia lepszą konserwację mikrotubul, a tak zwane wiązanie PHEMO, które składa się z mieszaniny 3,7% PFA, 0,05% aldehydu glutarowego i 0,5% detergentu w buforze PHEMO (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA i 3 mM MgCl2)2 zapewnia doskonałe zachowanie mikrotubul bez uszczerbku dla antygenowości. Działa również dobrze do znakowania immunologicznego gamma-tubuliny, β-kateniny i E-kadheryny oraz barwienia filamentów aktynowych falloidyną. Jednak w hodowlach tkanek 3D i organoidów utrwalanie PHEMO dawało niespójne wyniki i dlatego nie było stosowane.
Metanol jest utrwalaczem koagulantu, który zapewnia stosunkowo dobrą penetrację i ma tendencję do zachowywania antygenowości. Utrwalanie 100% metanolem (-20 °C) wprowadza pewien skurcz, zapewnia umiarkowane zachowanie morfologii i działa w przypadku mikrotubul, +TIP i wielu przeciwciał centrosomalnych, w tym dzieniny, w hodowlach komórkowych 2D. Jednak niektóre organoidy zapadły się podczas stosowania tej metody utrwalania. Ponadto przenikanie przeciwciał przez całe krypty, kosmki lub organoidy było początkowo problemem, ale dodanie 0,1% detergentu do roztworu myjącego i długotrwałe mycie przyniosło lepsze wyniki.
Kombinacja formaldehydu i metanolu była wcześniej stosowana przez Rogersa i wsp.20 do znakowania immunologicznego EB1 u Drosophila. W związku z tym opracowano protokół utrwalania oparty na mieszaninie formaldehydu i metanolu dla tkanek jelitowych i organoidów na bazie 3% formaldehydu i 97% metanolu schłodzonego do temperatury -20 °C, ale z pominięciem 5 mM węglanu sodu w mieszaninie użytej przez Rogersa i wsp. 20 Ponadto próbki utrwalono w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Zadziałało to szczególnie dobrze w przypadku znakowania immunologicznego +TIP, takich jak CLIP-170 i EBs, ale okazało się również doskonałe do utrwalania i znakowania immunologicznego mikrotubul i aktyny w tkankach i organoidach 3D. Widoczne było bardzo dobre zachowanie strukturalne i antygenowość została zachowana dla kilku białek cytoszkieletu i związanych z nimi, a także białek centrosomalnych, takich jak gamma-tubulina i nineina, chociaż znakowanie dziewiątki działało bardziej konsekwentnie z wiązaniem metanolu.

Tworzenie nabłonka o polaryzacji apico-bazalnej jest podstawowym procesem rozwoju i obejmuje radykalną reorganizację mikrotubul i białek centrosomalnych. Promieniowa matryca mikrotubul wychodząca z centralnie umieszczonego centrosomalnego centrum organizowania mikrotubul (MTOC) jest widoczna w wielu komórkach zwierzęcych i dobrze nadaje się do stosunkowo płaskich komórek. Natomiast komórki nabłonka walcowatego, takie jak komórki jelita, gromadzą niepromieniowe transkomórkowe układy mikrotubul, które lepiej wspierają kształt i wyspecjalizowane funkcje tych komórek. Ta radykalna reorganizacja mikrotubul jest osiągana poprzez przemieszczanie się centrosomu do wierzchołka i tworzenie wierzchołkowych niecentrosomalnych MTOC (n-MTOCs), które stają się odpowiedzialne za zakotwiczenie transkomórkowych mikrotubul1,2,3,4,5.
Duża część naszej wiedzy na temat różnicowania nabłonka i związanej z tym reorganizacji mikrotubul pochodzi z badań warstw komórkowych 2D in vitro, które nie wykazują architektury tkankowej in vivo. Rozwój 3D kultur organoidowych in vitro, zapoczątkowany przez Cleversa i współpracowników6, stanowi duży postęp technologiczny, ponieważ naśladują one architekturę i rozwój in vivo. Hierarchia różnicowania nabłonka jest widoczna w jelicie; Komórki macierzyste na dnie krypt powodują powstawanie niedojrzałych komórek amplifikujących tranzyt, które namnażają się i stopniowo różnicują podczas migracji w górę krypty na kosmki jelita cienkiego lub powierzchnię okrężnicy, gdzie stają się w pełni zróżnicowane przed wydaleniem do lumen7. Co ważne, jest to replikowane w organoidach jelitowych, w których komórki z niszy komórek macierzystych namnażają się, tworząc torbiele, które następnie generują pąki przypominające krypty z komórkami macierzystymi na dole i różnicowaniem stopniowo postępującym w kierunku obszaru torbieli, który staje się podobny do kosmków8. Organoid jelitowy stanowi zatem potężny model do badania nie tylko mikrotubul i reorganizacji centrosomalnej podczas różnicowania nabłonka, ale także wielu innych białek, a także stanowi idealną platformę do badań przesiewowych leków i związków spożywczych o potencjalnych korzyściach terapeutycznych9,10.
Organoidy dobrze nadają się do obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie, a zarówno organoidy typu knock-in, jak i knock-out mogą być generowane za pomocą edycji genów CRISPR/Cas911,12. Jednak ustalenie ekspresji i lokalizacji endogennych białek, które mają być badane, jest ważne, zwłaszcza w celu zweryfikowania zachowania oznakowanych białek. Znakowanie immunologiczne organoidów 3D hodowanych w macierzy podstawowej lub tkance izolowanej ex vivo jest bardziej złożone niż komórki hodowane na szalkach hodowlanych w 2D. Protokół utrwalania musi zachować delikatną architekturę 3D organoidów, jednocześnie zachowując antygenowość przeciwciał (tj. epitopy do wiązania przeciwciał). Na przykład 4% paraformaldehyd (PFA) jest powszechnie stosowany jako utrwalacz, ale chociaż jest to stosunkowo szybko działający utrwalacz i zapewnia dobre zachowanie morfologiczne, z naszego doświadczenia wynika, że często powoduje utratę antygenowości i nie jest odpowiedni dla wielu przeciwciał centrosomalnych. Należy również wziąć pod uwagę zdolność utrwalacza i przeciwciał do przenikania do struktur i tkanek 3D. W tym celu zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy protokoły izolacji tkanek i pośredniego znakowania immunologicznego organoidów 3D in vitro i izolowanej ex vivo tkanki jelitowej. Opisujemy, jak wyizolować krypty i kosmki jelita cienkiego oraz tkankę okrężnicy, a także dołączamy protokół izolacji organoidów 3D jako alternatywę dla utrwalania i znakowania immunologicznego w macierzy podstawnej. Przedstawiamy trzy alternatywne protokoły utrwalania do znakowania immunologicznego mikrotubul i białek centrosomalnych, takich jak nineina oraz białka śledzące plus-end mikrotubul (+TIP), takie jak białka EB i CLIP-170 (patrz również referencje8,13). Omawiamy również zalety i wady związane z każdym protokołem.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>mycie i</td></tr><tr><td>roztwór do odzyskiwania komórek</td> PFA <td>Corning</td><td>354253</td><td>izolować organoidy</td></tr><tr><td>probówki do mikrowirówek lobind</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>zapobiegać przywieraniu komórek</td></tr><tr><td>0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Izolacja krypty</td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific 11517532</td><td></td><td>Izoluj krypty z kosmków</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>detergentowa</td></tr><tr><td>surowica kozia</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>Środek blokujący</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>stosowana jako środek nieprzywierający</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4% w</td><td>utrwalaczu</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PBS Alfa Aesar J61899Roztwór formaldehydu (36,5&ndash; 38% w H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>stosowany jako utrwalacz</td></tr><tr><td>Metanol 99,9% klasy analitycznej</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>stosowany jako utrwalacz</td></tr><tr><td>Mysz MaxFluor na myszy Zestaw do wykrywania immunofluorescencji</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>; w celu zmniejszenia niespecyficznego znakowania</td></tr><tr><td>Rotator SB2 lub SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>rotator probówki mikrowirówki</td></tr><tr><td>Pobieranie antygenu</td><td>cytrynianu</td><td></td><td></td> sodu</tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>mocowanie</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanowy</td><td>środek zapobiegający blaknięciu</td><td>Sigma</td><td>D27802</td></tr><tr><td>Trwały dodatnio naładowany, wstępnie umyty, 90 stopni szlifowane krawędzie</td><td>Przejrzystość</td><td>Szkiełka</td><td>N / C366</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe - grubość nr 1, 22 x 50 mm</td><td>Klarowność</td><td>NQS13/2250</td><td>szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matryca podstawowa do hodowli organoidów 3D</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>do przetwarzania tkanek/organoidów</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>do przetwarzania tkanek/organoidów</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>dla izolowanych organoidów</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-E-kadheryny</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne antytubuliny YL1/2 szczura</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td> 1:100</tr><tr><td>Przeciwciało alfa-tubuliny królika</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-beta-aktyny królika</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-p150 Szczur</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td> 1:100</tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne EB3KT36 szczura</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td> 1:200</tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne EB1</td><td></td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>610535 Bioscience</td> 1:200</tr><tr><td>Przeciwciało królika anty-Lgr5</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anty-szczur 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>przeciwciało seconday 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-mouse 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>seconday przeciwciało 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>seconday przeciwciało 1:400</td></tr></tbody></table>

znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3d in vitro

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Pojawienie się organoidów 3D in vitro, które naśladują architekturę i morfogenezę tkanek in vivo, znacznie zwiększyło możliwości badania kluczowych zagadnień biologicznych w biologii komórkowej i rozwojowej. Ponadto organoidy w połączeniu z najnowszymi osiągnięciami technicznymi w zakresie edycji genów i dostarczania genów wirusowych mogą przyczynić się do postępu w badaniach medycznych i opracowywaniu nowych leków stosowanych w leczeniu chorób. Organoidy hodowane in vitro w macierzy podstawowej zapewniają potężne systemy modelowe do badania zachowania i funkcji różnych białek i dobrze nadają się do obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie. Jednak ustalenie ekspresji i lokalizacji endogennych białek w tkance ex vivo i organoidach in vitro jest ważne dla weryfikacji zachowania znakowanych białek. W tym celu opracowaliśmy i zmodyfikowaliśmy protokoły izolacji, utrwalania i znakowania immunologicznego tkanek do lokalizacji mikrotubul, białek centrosomalnych i powiązanych białek w tkance jelitowej ex vivo oraz w organoidach jelitowych in vitro. Celem było, aby utrwalacz zachował architekturę 3D organoidów/tkanki, zachowując jednocześnie antygenowość przeciwciał i umożliwiając dobrą penetrację i usuwanie utrwalacza i przeciwciał. Wystawienie na działanie zimna depolimeryzuje wszystkie mikrotubule z wyjątkiem stabilnych, co było kluczowym czynnikiem przy modyfikowaniu różnych protokołów. Stwierdziliśmy, że zwiększenie stężenia kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) z 3 mM do 30 mM dało skuteczne oderwanie kosmków i krypt w jelicie cienkim, podczas gdy 3 mM EDTA było wystarczające dla krypt okrężnicy. Opracowany protokół wiązania formaldehydu/metanolu zapewnił bardzo dobrą konserwację strukturalną, zachowując jednocześnie antygenowość w celu skutecznego znakowania mikrotubul, aktyny i białek wiążących koniec (EB). Działało to również w przypadku białka centrosomalnego nineiny, chociaż protokół metanolowy działał bardziej konsekwentnie. Ustaliliśmy ponadto, że utrwalenie i znakowanie immunologiczne mikrotubul i powiązanych białek można osiągnąć za pomocą organoidów wyizolowanych z macierzy podstawnej lub pozostających w niej.

Prezentujemy protokoły izolacji struktur 3D jelit z organoidów in vivo i in vitro w macierzy podstawnej, a także szczegółowo opisujemy różne protokoły utrwalania i barwienia zoptymalizowane pod kątem znakowania immunologicznego białek mikrotubulowych, centrosomalnych i łączących, a także markerów komórkowych, w tym białka komórek macierzystych Lgr5.

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie 3D organoidów jelitowych osadzonych w macierzy podstawnej in vitro, a następnie utrwalenie i immunoznakowanie mikrotubul i organoidów centrosomalnych proteins. 3D in vitro są idealnymi modelami do badania kluczowych zagadnień biologicznych w biologii komórki i rozwoju. Jednak lokalizacja endogennych białek i struktur w modelach 3D jest bardziej złożona niż w hodowlach 2D.Co ważne, utrwalacz musi zachować delikatną architekturę 3D, zachowując jednocześnie antygenowość przeciwciał. Przedstawione metody obejmują izolację, utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów jelitowych 3D in vitro. Ale protokoły utrwalania i znakowania immunologicznego mogą być również stosowane w tkance izolowanej ex vivo.Główną zaletą przedstawionego protokołu utrwalania metanolu formaldehydu jest to, że zachowuje on struktury 3D przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości. Umożliwia dobrą penetrację i usuwanie post-fixedowych przeciwciał tevel w celu skutecznego znakowania mikrotubul, filamentów aktynowych i białek wiążących oraz kilku białek centrosomalnych, w tym nineiny. Procedurę zademonstrują doktor Deborah Goldspink, formalny adiunkt w moim laboratorium, oraz doktor Zoe Matthews, współautorka.Po wyizolowaniu krypt i kosmków jelitowych można utrwalić izolowane struktury nabłonkowe w celu barwienia immunologicznego. Izolowane krypty mogą być naprzemiennie umieszczane w kopułach matrycy, które następnie utworzą organoidy. Po około pięciu do siedmiu dniach inkubacji uformują się organoidy.Użyj 500 mikrolitrów RT-PBS do umycia studni zawierających kopuły macierzy piwnicznej organoidami. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania zimnych komórek do każdej studzienki. Następnie, za pomocą mikropipety P1000, zeskrob kopuły matrycy piwnicznej i ostrożnie pipetuj w górę iw dół w całej studzience, aby rozbić i usunąć matrycę piwniczną z tworzywa sztucznego.Upewnij się, że roztwór regeneracyjny jest zimny, aby pomóc w rozbiciu matrycy. Podczas skrobania należy używać wyłącznie mikropipety P1000, aby nie rozbić organoidów i aby pozostały nienaruszone. Zebrać supernatant w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania.Następnie kilkakrotnie odwróć rurkę i sprawdź pod mikroskopem w powiększeniu 50, czy organoidy zostały wyizolowane, poruszają się swobodnie i nie są w grudkach. Osadzać organoidy przez odwirowanie w temperaturze 1 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie usuń odczynnik do odzyskiwania i natychmiast przystąp do utrwalania.Aby utrwalić wcześniej wyizolowane organoidy formaldehydem i metanolem, ponownie zawieś organoidy w roztworze utrwalającym metanol formaldehydu o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Inkubować organoidy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce przez 15 minut, odwracając probówkę co pięć minut. Następnie otoczakować organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 g przez pięć minut.Usunąć utrwalacz, a następnie dodać roztwór myjący składający się z PBS z 1% surowicą drugorzędowych gatunków przeciwciał lub PBS z 0,1% detergentem i 1% surowicą. Po zagnieżdżeniu próbki jak poprzednio, usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić próbkę w świeżym roztworze myjącym. Za pomocą rotatora probówkowego myj komórki przez łącznie jedną godzinę, granulując organoidy przez odwirowanie co 15 minut i wymieniając roztwór myjący.Aby zablokować próbki organoidów jelitowych, dodaj 10% surowicę drugorzędowych gatunków przeciwciał do PBS. Osadzać organoidy w ilości 1 000 g przez pięć minut i usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do każdej próbki, która ma być inkubowana w różnych przeciwciałach.Następnie inkubować próbki i roztwór blokujący na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w PBS zawierające 10% surowicy i 0,1% detergentu. Następnie, po odwirowaniu próbek i usunięciu roztworu blokującego, użyj roztworu przeciwciała pierwotnego do ponownego zawieszenia osadu organoidowego.Obracaj probówki z prędkością 20 obr./min i czterema stopniami Celsjusza przez noc, aby utrzymać organoidy w zawiesinie. Następnego dnia przywróć próbki do temperatury pokojowej na rotatorze probówki na jedną godzinę. Po odwirowaniu próbki usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, dodaj jeden mililitr roztworu płuczącego do każdej probówki i ponownie zawieś granulki organoidów.Następnie natychmiast usuń roztwór przez odwirowanie. Dodaj jeden mililitr świeżego roztworu do mycia i mieszaj komórki na rotatorze rurowym z prędkością 20 obr./min przez dwie godziny. Następnie rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS 1% surowicą i 0,1% detergentem.Następnie, po granulowaniu tkanki, ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach wtórnego roztworu przeciwciał. Inkubować probówki na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, zawiesić osad w roztworze płuczącym i natychmiast odwirować próbki w celu osadzenia organoidów.Następnie usunąć sklarat nadporodowy i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego roztworu do mycia. Mieszać próbki na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez 1,5 do dwóch godzin, zmieniając roztwór płuczący co 20 do 30 minut, jak opisano powyżej. Aby zamontować organoidy, po odwirowaniu i usunięciu całego roztworu do płukania, dodaj do osadu dwie krople twardego podłoża mocującego z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.Odetnij końcówkę mikropipety P200 i ostrożnie umieść granulkę w podłożu montażowym. Podczas ponownego zawieszania utrwalonych i barwionych organoidów w podłożu montażowym należy uważać, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków. Jeśli obecne są bąbelki, pozwól im wypłynąć na powierzchnię, a następnie unikaj przenoszenia ich na szkiełko.Za pomocą mikropipety dozować organoidy z podłożem montażowym w linii wzdłuż środka szkiełka mikroskopowego. Następnie ostrożnie umieść szklankę nakrywkową na wierzchu i unikaj tworzenia bąbelków. Umieść szkiełko w zeszycie ze slajdami i przechowuj w lodówce przez noc, aby medium montażowe zastygło przed analizą pod mikroskopem konfokalnym.Pokazano tutaj obrazy z frakcji drugiej izolowanej tkanki jelita cienkiego zawierającej zarówno kosmki, jak i krypty oraz próbkę z frakcji trzeciej zawierającą głównie krypty. Jak widać na tych obrazach, dobre zachowanie i znakowanie mikrotubul i aktyny zarówno w kosmkach, jak i kryptach osiągnięto dzięki protokołowi utrwalania i znakowania immunologicznego metanolu formaldehydu opisanemu w tym filmie. Organoidy jelita cienkiego zostały wygenerowane i hodowane w macierzy podstawowej przez trzy tygodnie lub dłużej, a następnie wyizolowane, jak pokazano w tym filmie.Zróżnicowane komórki w domenach kosmków organoidowych zawierają stabilne mikrotubule apikopodstawne, które w większości przypadków były dobrze oznakowane. EB1 można było również zobaczyć wzdłuż sieci mikrotubul. Pokazany tutaj jest organoid w stadium torbieli i we wczesnym stadium rozwoju krypt.Obie próbki utrwalono w metanolu formaldehydu i znakowano immunologicznie dla mikrotubul i dziewięcioiny, co świadczy o dobrym zachowaniu i znakowaniu mikrotubul w wierzchołkowych niecentrosomalnych centrach organizowania mikrotubul. Po opanowaniu technikę tę można wykonywać z wieloma próbkami i przez dwa dni. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby ostrożnie zeskrobać studzienki podczas zbierania organoidów, aby uniknąć zakłócenia ich struktury 3D.Należy również zachować ostrożność podczas dodawania lub usuwania roztworów, aby zapobiec utracie organoidów podczas całej procedury barwienia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak naprawiać, znakować immunologicznie i montować izolowane organoidy i inne struktury nabłonkowe, takie jak krypty jelitowe. Nie zapominaj, że działające odczynniki utrwalające w tej procedurze mogą być bardzo niebezpieczne.Podczas wykonywania tej procedury należy przeprowadzić ocenę ryzyka i zawsze stosować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się wirusa oraz stosować środki ochrony indywidualnej.

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego nienaruszonych organoidów raka prostaty i ich obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej z pełnym wierzchołkiem. Technika ta ma na celu ocenę zdolności różnicowania ex vivo podstawnych i świetlnych komórek nabłonka prostaty.

Obrazowanie immunofluorescencyjne w całości: technika utrwalania i barwienia do oceny nienaruszonych organoidów

Ten film ilustruje opartą na immunofluorescencji metodę wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jelita czczego myszy. W obrębie kosmków jelitowych kolokalizacja zielonej fluorescencji na końcu światła z wydłużoną masą czerwonych korzonków wskazuje na obecność komórek kępkowych.

Oparta na immunofluorescencji metoda wizualizacji komórek kępek w kriosekcjach jelita drogowego

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Kuga i in. odkryli, że przeciwciała specyficzne dla statusu fosforylacji przeciwko białku wiążącemu aktynę, które fosforyluje się w tyrozynie 1798 (pY1798), mogą być używane do znakowania komórek kępek (TC). Protokół ten umożliwia solidną wizualizację TC przy użyciu barwienia immunofluorescencyjnego swobodnie pływających kriosekcji jelita czczego z przeciwciałami pY1798.

Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Poznaj protokoły immunofluorescencyjnego znakowania mikrotubul i białek centrosomalnych w trójwymiarowych organoidach jelitowych oraz tkance ex vivo. Metody obejmują izolację, fiksację formaldehydowo-metanolową i barwienie.

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Przeglądaj więcej filmów