Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie 3D organoidów jelitowych osadzonych w macierzy podstawnej in vitro, a następnie utrwalenie i immunoznakowanie mikrotubul i organoidów centrosomalnych proteins. 3D in vitro są idealnymi modelami do badania kluczowych zagadnień biologicznych w biologii komórki i rozwoju. Jednak lokalizacja endogennych białek i struktur w modelach 3D jest bardziej złożona niż w hodowlach 2D.

Co ważne, utrwalacz musi zachować delikatną architekturę 3D, zachowując jednocześnie antygenowość przeciwciał. Przedstawione metody obejmują izolację, utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów jelitowych 3D in vitro. Ale protokoły utrwalania i znakowania immunologicznego mogą być również stosowane w tkance izolowanej ex vivo.

Główną zaletą przedstawionego protokołu utrwalania metanolu formaldehydu jest to, że zachowuje on struktury 3D przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości. Umożliwia dobrą penetrację i usuwanie post-fixedowych przeciwciał tevel w celu skutecznego znakowania mikrotubul, filamentów aktynowych i białek wiążących oraz kilku białek centrosomalnych, w tym nineiny. Procedurę zademonstrują doktor Deborah Goldspink, formalny adiunkt w moim laboratorium, oraz doktor Zoe Matthews, współautorka.

Po wyizolowaniu krypt i kosmków jelitowych można utrwalić izolowane struktury nabłonkowe w celu barwienia immunologicznego. Izolowane krypty mogą być naprzemiennie umieszczane w kopułach matrycy, które następnie utworzą organoidy. Po około pięciu do siedmiu dniach inkubacji uformują się organoidy.

Użyj 500 mikrolitrów RT-PBS do umycia studni zawierających kopuły macierzy piwnicznej organoidami. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania zimnych komórek do każdej studzienki. Następnie, za pomocą mikropipety P1000, zeskrob kopuły matrycy piwnicznej i ostrożnie pipetuj w górę iw dół w całej studzience, aby rozbić i usunąć matrycę piwniczną z tworzywa sztucznego.

Upewnij się, że roztwór regeneracyjny jest zimny, aby pomóc w rozbiciu matrycy. Podczas skrobania należy używać wyłącznie mikropipety P1000, aby nie rozbić organoidów i aby pozostały nienaruszone. Zebrać supernatant w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania.

Następnie kilkakrotnie odwróć rurkę i sprawdź pod mikroskopem w powiększeniu 50, czy organoidy zostały wyizolowane, poruszają się swobodnie i nie są w grudkach. Osadzać organoidy przez odwirowanie w temperaturze 1 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie usuń odczynnik do odzyskiwania i natychmiast przystąp do utrwalania.

Aby utrwalić wcześniej wyizolowane organoidy formaldehydem i metanolem, ponownie zawieś organoidy w roztworze utrwalającym metanol formaldehydu o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Inkubować organoidy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce przez 15 minut, odwracając probówkę co pięć minut. Następnie otoczakować organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 g przez pięć minut.

Usunąć utrwalacz, a następnie dodać roztwór myjący składający się z PBS z 1% surowicą drugorzędowych gatunków przeciwciał lub PBS z 0,1% detergentem i 1% surowicą. Po zagnieżdżeniu próbki jak poprzednio, usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić próbkę w świeżym roztworze myjącym. Za pomocą rotatora probówkowego myj komórki przez łącznie jedną godzinę, granulując organoidy przez odwirowanie co 15 minut i wymieniając roztwór myjący.

Aby zablokować próbki organoidów jelitowych, dodaj 10% surowicę drugorzędowych gatunków przeciwciał do PBS. Osadzać organoidy w ilości 1 000 g przez pięć minut i usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do każdej próbki, która ma być inkubowana w różnych przeciwciałach.

Następnie inkubować próbki i roztwór blokujący na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w PBS zawierające 10% surowicy i 0,1% detergentu. Następnie, po odwirowaniu próbek i usunięciu roztworu blokującego, użyj roztworu przeciwciała pierwotnego do ponownego zawieszenia osadu organoidowego.

Obracaj probówki z prędkością 20 obr./min i czterema stopniami Celsjusza przez noc, aby utrzymać organoidy w zawiesinie. Następnego dnia przywróć próbki do temperatury pokojowej na rotatorze probówki na jedną godzinę. Po odwirowaniu próbki usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, dodaj jeden mililitr roztworu płuczącego do każdej probówki i ponownie zawieś granulki organoidów.

Następnie natychmiast usuń roztwór przez odwirowanie. Dodaj jeden mililitr świeżego roztworu do mycia i mieszaj komórki na rotatorze rurowym z prędkością 20 obr./min przez dwie godziny. Następnie rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS 1% surowicą i 0,1% detergentem.

Następnie, po granulowaniu tkanki, ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach wtórnego roztworu przeciwciał. Inkubować probówki na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, zawiesić osad w roztworze płuczącym i natychmiast odwirować próbki w celu osadzenia organoidów.

Następnie usunąć sklarat nadporodowy i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego roztworu do mycia. Mieszać próbki na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez 1,5 do dwóch godzin, zmieniając roztwór płuczący co 20 do 30 minut, jak opisano powyżej. Aby zamontować organoidy, po odwirowaniu i usunięciu całego roztworu do płukania, dodaj do osadu dwie krople twardego podłoża mocującego z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.

Odetnij końcówkę mikropipety P200 i ostrożnie umieść granulkę w podłożu montażowym. Podczas ponownego zawieszania utrwalonych i barwionych organoidów w podłożu montażowym należy uważać, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków. Jeśli obecne są bąbelki, pozwól im wypłynąć na powierzchnię, a następnie unikaj przenoszenia ich na szkiełko.

Za pomocą mikropipety dozować organoidy z podłożem montażowym w linii wzdłuż środka szkiełka mikroskopowego. Następnie ostrożnie umieść szklankę nakrywkową na wierzchu i unikaj tworzenia bąbelków. Umieść szkiełko w zeszycie ze slajdami i przechowuj w lodówce przez noc, aby medium montażowe zastygło przed analizą pod mikroskopem konfokalnym.

Pokazano tutaj obrazy z frakcji drugiej izolowanej tkanki jelita cienkiego zawierającej zarówno kosmki, jak i krypty oraz próbkę z frakcji trzeciej zawierającą głównie krypty. Jak widać na tych obrazach, dobre zachowanie i znakowanie mikrotubul i aktyny zarówno w kosmkach, jak i kryptach osiągnięto dzięki protokołowi utrwalania i znakowania immunologicznego metanolu formaldehydu opisanemu w tym filmie. Organoidy jelita cienkiego zostały wygenerowane i hodowane w macierzy podstawowej przez trzy tygodnie lub dłużej, a następnie wyizolowane, jak pokazano w tym filmie.

Zróżnicowane komórki w domenach kosmków organoidowych zawierają stabilne mikrotubule apikopodstawne, które w większości przypadków były dobrze oznakowane. EB1 można było również zobaczyć wzdłuż sieci mikrotubul. Pokazany tutaj jest organoid w stadium torbieli i we wczesnym stadium rozwoju krypt.

Obie próbki utrwalono w metanolu formaldehydu i znakowano immunologicznie dla mikrotubul i dziewięcioiny, co świadczy o dobrym zachowaniu i znakowaniu mikrotubul w wierzchołkowych niecentrosomalnych centrach organizowania mikrotubul. Po opanowaniu technikę tę można wykonywać z wieloma próbkami i przez dwa dni. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby ostrożnie zeskrobać studzienki podczas zbierania organoidów, aby uniknąć zakłócenia ich struktury 3D.

Należy również zachować ostrożność podczas dodawania lub usuwania roztworów, aby zapobiec utracie organoidów podczas całej procedury barwienia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak naprawiać, znakować immunologicznie i montować izolowane organoidy i inne struktury nabłonkowe, takie jak krypty jelitowe. Nie zapominaj, że działające odczynniki utrwalające w tej procedurze mogą być bardzo niebezpieczne.

Podczas wykonywania tej procedury należy przeprowadzić ocenę ryzyka i zawsze stosować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się wirusa oraz stosować środki ochrony indywidualnej.