Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ogólnym celem tego zestawu kolejnych metod jest wizualizacja i monitorowanie parametrów witalności w naprawie DNA w ożywianiu przetrwalników Bacillus subtilis po leczeniu plazmą niskociśnieniową przy użyciu czasowo-rozdzielczej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Nasza metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inaktywacji i sterylizacji drobnoustrojów. Pomaga nam to przeanalizować szkodliwy wpływ leczenia plazmą niskociśnieniową na wskaźniki biologiczne, takie jak przetrwalniki Bacillus subtilis.

Główną zaletą naszej techniki jest to, że łączymy kilka metod: oznaczenie widoku, skaningową mikroskopię elektronową i monitorowanie naprawy DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie, w celu weryfikacji szkodliwego wpływu obróbki plazmą niskociśnieniową. Aby przeprowadzić produkcję zarodników, przenieś pięciomililitrową kulturę na noc odpowiedniego szczepu B.subtilis uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami do 200 mililitrów płynnej pożywki do zarodnikowania shafer o podwójnej mocy i hoduj ją z energicznym napowietrzaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 72 godziny lub dłużej, aż ponad 95% kultury zostanie zarodnikowane. Zebrać zarodniki w 15-mililitrowych probówkach przez odwirowanie przy 3000 G przez 15 minut i oczyścić próbki za pomocą sterylnego destylowanego H2O w powtarzających się etapach mycia.

Sprawdź czystość i stan kiełkowania za pomocą błędnej sekrkopii kontrastowej i upewnij się, że zawiesiny zarodników składają się z więcej niż 99% zarodników jasnych fazowo i są wolne od komórek wegetatywnych, kiełkujących zarodników i resztek komórkowych, w przeciwnym razie dalsze eksperymenty mikroskopowe mogą zostać zakłócone. Określić miano zarodników, posiewając 50 mikrolitrów dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń na agarze LB w celu obliczenia CFU i inkubacji płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po oznaczeniu CFU dostosuj próbkę do 10 do 9 zarodników na mililitr, zagęszczając lub używając sterylnej wody do rozcieńczenia próbek.

Umieść nośnik próbki w postaci wysterylizowanych szkiełek mikroskopowych lub okrągłych 25-milimetrowych szkiełek nakrywkowych wewnątrz elektrycznie sterowanego urządzenia do rozpylania aerozolu w jednej linii z dyszą. Przenieś kulturę przetrwalników do wlotu płynu dyszy i rozpocznij opryskiwanie po 0,15 sekundy pod ciśnieniem 1,3 bara. Rozpylona zawiesina zarodników tworzy cienką warstwę na mikroskopijnym szkiełku, która szybko wysycha w ciągu kilku sekund, tworząc równomiernie rozłożoną monowarstwę zarodników.

Nośniki próbek poddanych działaniu substancji należy przechowywać w sterylnym pojemniku w temperaturze pokojowej. Aby oczyścić i rozgrzać wszystkie powierzchnie w systemie plazmowym, zainicjuj system z prędkością pięciu paskali za pomocą plazmy argonowej o mocy 500 watów przez pięć minut. Obróbka wstępna zmniejsza przywieranie cząsteczek z otaczającego powietrza, takich jak azot, tlen i woda podczas wentylacji komory.

Po odpowietrzeniu komory ostrożnie umieść próbki na szklanych stojakach pośrodku zbiornika reaktora. Zamknij komorę i opróżnij ją. Następnie użyj żądanego gazu procesowego do napełnienia komory i wyreguluj ciśnienie w systemie do pięciu paskalów.

Następnie rozpocznij proces plazmowy. Po upływie określonego czasu procesu należy wyłączyć zasilanie i dopływ gazu oraz ostrożnie odpowietrzyć system, aby zapobiec wydmuchiwaniu próbek z uchwytu na próbki. Po wentylacji wyjmij próbki i przechowuj je w sterylnym pojemniku.

W przypadku kontroli bez plazmy, próbki należy wystawiać na działanie próżni tylko w obecności gazu procesowego odpowiadającego najdłuższemu zastosowanemu czasowi plazmy. Przygotować roztwór autoklawowanego 10% polioctanu winylu lub PVA i użyć 500 mikrolitrów do ostrożnego przykrycia nośników próbki. Po pozostawieniu ich do wyschnięcia na powietrzu przez cztery godziny, użyj sterylnych kleszczyków, aby usunąć wysuszoną warstwę PVA, która teraz zawiera próbkę zarodników i przenieś ją do 2-mililitrowej probówki reakcyjnej.

Dodaj jeden mililitr sterylnej wody do probówki i wymieszaj ją, aby rozpuścić warstwę PVA, aby odzyskać ponad 95% zarodników zdolnych do kiełkowania. Użyj sterylnej wody, aby seryjnie rozcieńczyć próbkę w ilości od 1 do 10 w 96-dołkowej płytce. Po posianiu 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na agarze LB i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, policz liczbę kolonii i określ CFU na mililitr.

Do eksperymentów z kiełkowaniem przygotuj podkładkę agarową o grubości jednego milimetra i wadze 1,5 funta, gotując 700 mikrolitrów pożywki i pipetując ją do sterylnej petrydyszy mikroskopowej. Po 10 minutach za pomocą sterylnego skalpela wyciąć podkładkę agarową LB o wymiarach osiem milimetrów na osiem milimetrów na jeden milimetr i ostrożnie przenieść agar na monowarstwy zarodników, które spoczywają na 25-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są już zamontowane w komorze obrazowania. Metoda agar put łączy w sobie dwie specyficzne funkcje.

Stabilizuje próbki w płaszczyźnie optycznej podczas mikroskopii laserowej i ogranicza boczny ruch komórek. Oprócz wykorzystania jej do esejów o kiełkowaniu, metoda ta może być stosowana do innych mikroorganizmów, a także do komórek eukariotycznych. Po pokryciu próbki agarem należy szybko przenieść szkiełko ze szklanej pokrywy do komory obrazowania.

Utrzymuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na podgrzewanym stoliku podczas całego procesu obrazowania. Dla każdego warunku należy użyć co najmniej trzech powtórzeń biologicznych. Po zobrazowaniu próbek za pomocą zautomatyzowanego konfokalnego skaningu laserowego i mikroskopii jasnego pola, nagraj serię poklatkową z mocą lasera 2,6% i ustaw aperturę konfokalną na pięć jednostek aer i częstotliwość próbkowania jednej klatki na 30 sekund od zera do pięciu godzin, w zależności od eksperymentu.

Zastosowanie wysokich dawek światła monochromatycznego może całkowicie zahamować kiełkowanie zarodników podczas mikroskopii laserowej. Dlatego należy wykorzystać intensywność lasera i po prostu dłuższe interwały uzyskiwania pojedynczych klatek. W przypadku agregacji zarodników, wielowarstwowego rozmieszczenia zarodników lub zanieczyszczenia cząstkami pyłu, może dojść do zablokowania obróbki plazmowej lub zacienienia i umożliwienia kiełkowania zacienionych zarodników.

Aby przeprowadzić skaningową mikroskopię elektronową, po napyleniu monowarstw zarodników złotym palladem, zobrazuj próbki z emisją pola SEM działającą przy napięciu przyspieszenia pięciu kilowoltów, w tym detektorem elektronów wtórnych inlan, aby ujawnić kontrast topograficzny. Jak pokazano na tym wykresie, leczenie plazmą zarodników B.subtilis powoduje zmniejszenie przeżywalności wraz ze wzrostem czasu trwania leczenia osoczem. Te obrazy SEM ujawniają charakterystyczne podłużne struktury przypominające grzbiety, które są stale widoczne we wszystkich leczonych i nieleczonych zarodnikach.

Obróbka plazmowa do 30 sekund nie wywołuje istotnych zmian w morfologii powierzchni zarodników w porównaniu z kontrolami. Wydłużający się czas trwania obróbki plazmowej prowadzi do bardziej ziarnistej powierzchni, a małe pęknięcia i szczeliny można zaobserwować w zarodnikach traktowanych przez 120 lub 240 sekund. W tym czasie rozwiązane eksperymenty z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, prawie wszystkie zarodniki traktowane próżnią jako kontrola kiełkują i rozwijają morfologię komórek w kształcie pręcików z raczej jednolitą długością pojedynczych komórek.

W przeciwieństwie do tego, zarodniki traktowane przez 15 sekund osoczem wykazują już zmniejszoną zdolność kiełkowania poniżej 75 plus minus cztery procent. Ponadto komórki wyrastają albo na bardzo długie pręciki, albo pozostają małe i wbijają się w otoczkę zarodników. Po 30 sekundach leczenia osoczem kiełkuje tylko 25 plus minus sześć procent zarodników, a komórki wegetatywne są wyraźnie opóźnione w wzroście i różnią się długością.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby potwierdzić jakość monowarstw zarodników za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że nie ma zarodników nakładających się na siebie lub kiełkujących. Po jej opracowaniu, metoda podkładki agarowej do stabilizacji obrazu, utorowała drogę naukowcom w zakresie sterylizacji plazmowej i mikroskopii żywych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak przygotować monowarstwy zarodników na szkiełkach podstawowych, określić użycie zabiegów plazmowych do inaktywacji zarodników oraz przeprowadzić żywą komórkę i skaningową mikroskopię elektronową.

W przeciwieństwie do innych metod odkażania, na przykład tlenku etylenu lub promieniowania gamma, sterylizacja plazmowa jest skutecznym i bezpiecznym podejściem do redukcji wielu niepożądanych mikroorganizmów na prawie każdym rodzaju powierzchni.