Name: Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę przewlekłej przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u szczurów do badania wpływu na aktywność mózgu. Technika ta umożliwia terapię epilepsji i depresji poprzez modulację sieci neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez EU-FP7-ERC-2013-Starting grant (No.337075), program 'Momentum' Węgierskiej Akademii Nauk (LP2013-62) oraz grant GINOP-2.3.2-15-2016-00018. Dziękujemy Máté Kozákowi za udokumentowanie elektrod stymulacyjnych i rejestrujących oraz Mihály'emu Vöröslakosowi za owocne dyskusje podczas projektowania protokołu.

Wszystkie opisane tutaj metody są zgodne z dyrektywami Rady Wspólnot Europejskich (86/609 ECC) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach w Centrum Medycznym i Farmaceutycznym Alberta Szent-Györgyi Uniwersytetu w Segedynie (XIV/218/2016).
1. Produkcja elektrod stymulacyjnych
<ol>
	<li>Aby wykonać jedną elektrodę stymulacyjną, odetnij sześć kawałków miniaturowych przewodów połączeniowych o długości 10 cm, usuń 2 cm okładziny z jednego końca i 1 cm z drugiego końca.</li>
	<li>Skręć ze sobą dwa i je po krótszej, oderwanej stronie.</li>
	<li>Zdobądź pakiet trzech taśm z dowolnego układu scalonego z obudową SOT-353.</li>
	<li>Zszyj skręcone druty przez trzy otwory w opakowaniu. Dłuższy oderwany odcinek drutów powinien znajdować się we wnękach opakowania. Ułóż tak, aby koniec izolacji znajdował się w jednej linii z krawędzią otworów.</li>
	<li>Nałóż cement dentystyczny na otwory, aby przymocować przewody. 
	Uwaga: Cement dentystyczny musi być wystarczająco gęsty, aby uniknąć przeciekania do wnęki opakowania.</li>
	<li>Gdy cement zastygnie (minimum 10 minut), odwróć opakowanie i włóż cienką warstwę kleju superglue do otworu, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie w kierunku porowatego cementu. Unikaj klejenia obranych drutów.</li>
	<li>Skręć razem po krótszej, oderwanej stronie i je (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Chwyć dłuższy, obrany fragment drutów końcówką cienkiej pęsety, zwiń go i zawiń w zagłębienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). W razie potrzeby odetnij nadmiar.</li>
</ol>
2. Produkcja elektrod rejestrujących
<ol>
	<li>Aby wykonać jedną elektrodę trypletową do nagrywania (<klasa silna="xfig">Rysunek 1C-D), wytnij kawałek rury ze stali nierdzewnej o długości jednego centymetra za pomocą szybkoobrotowej piły obrotowej. Zdejmij płetwę z końców rurki za pomocą ostrej igły i upewnij się, że rurka jest czysta z zanieczyszczeń i całkowicie przepuszczalna. 
	UWAGA: Nie używaj szczypiec, ponieważ mogą one zniekształcić rurkę.</li>
	<li>Zegnij pozłacany kołek dystansowy do deski o minimalnej długości 3 cm, aby utworzyć uchwyt w kształcie litery J. Wytnij dłuższą nogę w kształcie litery "J" i ją razem, aby odzyskać oryginalny kształt, aby utworzyć odłączalne połączenie między długą częścią liniową, która będzie utrzymywana przez urządzenie stereotaktyczne, a kształtem "U", który będzie utrzymywał elektrodę i służył jako punkt kotwiczenia. Sklej ze sobą rurkę i krótszą nogę uchwytu "J". W razie potrzeby przyklej kilka dodatkowych prętów o długości 1 cm, aby zapewnić stabilność.</li>
	<li>Wytnij 3 kawałki drutów elektrodowych o długości 2,5 cm ultracienkimi nożyczkami ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że jest to wyraźne i ostre cięcie, a izolacja jest nienaruszona na okrągłej powierzchni drutu elektrody. Upewnij się również, że przycięta końcówka nie jest wygięta z powodu przyłożonej siły. Zegnij 1 lub 2 mm na jednym końcu każdego z drutów pod różnymi kątami (np. jeden w lewo prosty, jeden pod kątem 45° i jeden pod kątem prostym), aby były rozróżnialne.</li>
	<li>Napełnij rurkę drutami, wybierz odpowiedni rozstaw elektrod do eksperymentu (np. dla rejestracji potencjału lokalnego pola korowego (LFP) i gęstości źródła prądu (CSD), zalecane wysunięcie końcówek przewodów od otworu rurki: odpowiednio 4,5 mm, 4,1 mm i 3,7 mm). Zwróć uwagę, który drut odpowiada której głębokości, aby utrzymać właściwą kolejność kanałów.</li>
	<li>Gdy druty ustawią się tuż obok siebie i będą równoległe do rurki, aby zamocować druty elektrody, umieść pojedynczą kroplę płynnego kleju superglue na obu końcach rurki za pomocą ostrej igły. Upewnij się, że klej spływa do rurki ze względu na efekt kapilarny, ale nie w kierunku miejsc nagrywania na wystających końcach.</li>
	<li>Przygotuj płytkę interfejsu elektrody z odpowiednim mikrozłączem kompatybilnym z systemem nagrywania, który ma być używany.</li>
	<li>Wprowadź nienagrywające, zagięte końce przewodów do otworów płytki interfejsu elektrody odpowiadających żądanemu kanałowi nagrywania. Gdy wszystkie przewody znajdą się na swoim miejscu, wepchnij złote szpilki w otwory za pomocą pęsety. 
	UWAGA: Złote kołki można przymocować za pomocą cementu dentystycznego, ale w większości przypadków jest on wystarczająco stabilny nawet bez tego stopnia bezpieczeństwa.</li>
</ol>
3. Znieczulenie
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w szczelnie zamkniętej komorze indukcyjnej znieczulenia i napełnij ją 4 - 5% izofluranu w 2 l/min powietrza medycznego.</li>
	<li>Gdy szczur jest w pozycji leżącej, wyjmij zwierzę z komory i umieść je w stereotaktycznej ramce z odpowiednią częścią wentylacyjną.</li>
	<li>Ustaw poziom izofluranu na 2%, chociaż szybkość przepływu powietrza powinna pozostać taka sama. Sprawdź poziom znieczulenia. Jeśli nie ma odruchu wycofania łapy w odpowiedzi na szczypanie, kontynuuj, w przeciwnym razie zwiększ głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj i utrzymuj temperaturę ciała szczura na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą homeotermicznego systemu monitorowania. Nałóż kroplę maści parafinowej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. W razie potrzeby powtórz tę procedurę podczas zabiegu kilka razy.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć 0,3 mg/kg atropiny, aby uniknąć tworzenia się śluzu w drogach oddechowych. Powtarzaj to co cztery godziny w przypadku dłuższych operacji. Monitoruj oddech i dostosuj waporyzator, jeśli to konieczne.</li>
</ol>
4. Implantacja elektrod stymulujących i rejestrujących
UWAGA: Autoklawuj wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne i dokładnie przestrzegaj ogólnych zasad aseptyki i antyseptyki podczas całego zabiegu. Unikaj dotykania niesterylnych obszarów poza obszarem operacyjnym. Zanurz elektrody w alkoholu etylowym (70%) na 30 minut przed implantacją.
<ol>
	<li>Usuń większość włosów ze skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Nałóż krem do depilacji na skórę głowy, rozprowadź go równomiernie na powierzchni i odczekaj kilka minut. Użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć krem i pozostałe włosy. Spłucz skórę wodą, a następnie środkiem dezynfekującym.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 - 2% lidokainy (nie przekraczać całkowitej dawki 7 mg/kg) podskórnie w celu znieczulenia skóry. Nałóż jedną kroplę maści weterynaryjnej na oczy (np. parafiny).</li>
	<li>Wykonaj dokładne i długie (~2 cm) strzałkowe nacięcie w linii środkowej za pomocą skalpela, od czoła do szyi. Wypreparuj tkanki, w tym okostną, z czaszki, a następnie za pomocą dłuta lub pęsety do zębów oczyść obszar między grzebieniami dwóch kości skroniowych. Utrzymuj czaszkę odsłoniętą, chowając wyciętą skórę za pomocą czterech buldogów.</li>
	<li>Delikatnie umieść cienką pęsetę między stromą krawędzią kości skroniowej a mięśniami i rozdziel je. Wykonuj ruchy jigowowe, aby odsłonić jak największą powierzchnię kości skroniowej, najlepiej od krawędzi kości potylicznej do płaszczyzny szwów koronalnych, nie uszkadzając przy tym mięśni.</li>
	<li>Umieść zwijacze dwuskroniowo, aby kości skroniowe były odsłonięte.</li>
	<li>Spłucz powierzchnię czaszki 1 - 2 ml 3% H2O2 , a następnie umyj ją 1 - 2 ml wody.</li>
	<li>Bardzo ostrożnie osusz powierzchnię kości skroniowych na powietrzu, zetrzyj wilgoć patyczkami do oczu. Sprawdź, czy elektrody stymulacyjne przylegają do oczyszczonej pionowej powierzchni czaszki (górna krawędź elektrody stymulacyjnej powinna znajdować się w jednej linii z krawędzią kości skroniowej). W razie potrzeby ponownie wyreguluj buldogi i zwijacze lub uformuj elektrody stymulacyjne nożyczkami.</li>
	<li>Wypełnij wnęki elektrod stymulacyjnych żelem elektroprzewodzącym i nałóż cienką warstwę kleju na krawędź elektrod.</li>
	<li>Umieść elektrodę stymulacyjną na suchej powierzchni kości skroniowej jednym dokładnym ruchem i przytrzymaj ją mocno przez minutę za pomocą cienkiej pęsety. Upewnij się, że wilgoć nie ma kontaktu z klejem. W razie potrzeby wytrzyj patyczkami do oczu. 
	Ostrzeżenie: W przypadku wystąpienia jakiejkolwiek niestabilności elektrody należy ją usunąć. Po oczyszczeniu kości powtórz ten krok z nową elektrodą stymulacyjną.</li>
	<li>Umieść cement dentystyczny na krawędziach elektrody stymulującej, podczas gdy wyciekająca wilgoć z tkanek jest stale suszona za pomocą patyczków ocznych. Przykryj całą elektrodę stymulacyjną cementem.</li>
	<li>Po całkowitym stwardnieniu cementu powtórz te czynności po stronie przeciwnej.</li>
	<li>Wywierć kilka otworów w całej czaszce do zakotwiczenia. Wkręć miniaturowe w otwory i nałóż na nie cement dentystyczny. Użyj głowicy wiertarskiej o średnicy ~10% mniejszej w porównaniu ze średnicą.</li>
	<li>W zależności od celu eksperymentów, albo złącze do końców, umieść je na powierzchni i przykryj cementem, albo kontynuuj wszczepianie elektrod rejestrujących i światłowodów, albo przygotuj okno czaszkowe nad czaszką. W tym drugim przypadku złącza i zakotwicź je do konstrukcji dopiero na końcu. W przypadku konieczności długotrwałych jednoczesnych zapisów TES i LFP, należy wszczepić w/w trójki elektrod zamiast pojedynczych przewodów. 
	UWAGA: Ta konfiguracja pozwala na usunięcie artefaktów stymulacji w trybie wspólnym8. Szczegółowe informacje na temat rejestrowania implantacji elektrody można znaleźć w poprzednich protokołach14,15.</li>
	<li>Odsłonięte tkanki obficie umyć środkiem dezynfekującym. Wstrzyknąć 1 - 2% lidokainy (nie przekraczać całkowitej dawki 7 mg/kg) podskórnie.</li>
	<li>Oczyścić brzegi rany i zamknąć je prostymi, przerwanymi szwami wokół łącznika/implantu. Zdezynfekuj ranę jodonem powidonu.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu. Powtórz to, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Można stosować wszelkie inne leki przeciwbólowe spełniające wymagania określone przez lokalną komisję ds. pozwoleń etycznych.</li>
	<li>Zawiesić znieczulenie, zwolnić kolczyki uszne i końcówkę nosa, a następnie umieścić zwierzę w klatce pooperacyjnej, aby odzyskać przytomność.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę jest pod ścisłym nadzorem w pierwszych godzinach po operacji. Kontynuuj okresowe monitorowanie obszaru implantu. 
	UWAGA: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzę należy trzymać indywidualnie do czasu pełnego wyzdrowienia po zabiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Ozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Ali, M. M., Sellers, K. K., Frohlich, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+alternating+current+stimulation+modulates+large-scale+cortical+network+activity+by+network+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial alternating current stimulation modulates large-scale cortical network activity by network resonance.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (27), 11262-11275 (2013).</li>
<li>Helfrich, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+brain+oscillations+by+transcranial+alternating+current+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Entrainment of brain oscillations by transcranial alternating current stimulation.</a> Current biology : CB. 24 (3), 333-339 (2014).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+direct+current+stimulation+for+major+depression%3A+a+general+system+for+quantifying+transcranial+electrotherapy+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+treatment+options+in+neurology%22%5BJournal%5D)">Transcranial direct current stimulation for major depression: a general system for quantifying transcranial electrotherapy dosage.</a> Current treatment options in neurology. 10 (5), 377-385 (2008).</li>
<li>Lefaucheur, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+guidelines+on+the+therapeutic+use+of+transcranial+direct+current+stimulation+%28tDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+neurophysiology+%3A+official+journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based guidelines on the therapeutic use of transcranial direct current stimulation (tDCS).</a> Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 128 (1), 56-92 (2017).</li>
<li>Kuo, M. F., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transcranial+electrical+stimulation+on+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+EEG+and+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of transcranial electrical stimulation on cognition.</a> Clinical EEG and neuroscience. 43 (3), 192-199 (2012).</li>
<li>Sandrini, M., Fertonani, A., Cohen, L. G., Miniussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+dissociation+of+working+memory+load+effects+induced+by+bilateral+parietal+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychologia%22%5BJournal%5D)">Double dissociation of working memory load effects induced by bilateral parietal modulation.</a> Neuropsychologia. 50 (3), 396-402 (2012).</li>
<li>Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-loop+control+of+epilepsy+by+transcranial+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation.</a> Science. 337 (6095), New York, N.Y. 735-737 (2012).</li>
<li>Kozak, G., Berenyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+efficacy+of+closed+loop+electrical+stimulation+for+long-term+treatment+of+absence+epilepsy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Sustained efficacy of closed loop electrical stimulation for long-term treatment of absence epilepsy in rats.</a> Scientific reports. 7 (1), 6300(2017).</li>
<li>Fertonani, A., Ferrari, C., Miniussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+feel+if+I+apply+transcranial+electric+stimulation%3F+Safety%2C+sensations+and+secondary+induced+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+neurophysiology+%3A+official+journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">What do you feel if I apply transcranial electric stimulation? Safety, sensations and secondary induced effects.</a> Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 126 (11), 2181-2188 (2015).</li>
<li>Marshall, L., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+transcranial+oscillatory+stimulation+to+research+on+neural+networks%3A+an+emphasis+on+hippocampo-neocortical+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+human+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of transcranial oscillatory stimulation to research on neural networks: an emphasis on hippocampo-neocortical rhythms.</a> Frontiers in human neuroscience. 7, 614(2013).</li>
<li>Reato, D., Rahman, A., Bikson, M., Parra, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+weak+transcranial+alternating+current+stimulation+on+brain+activity-a+review+of+known+mechanisms+from+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+human+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of weak transcranial alternating current stimulation on brain activity-a review of known mechanisms from animal studies.</a> Frontiers in human neuroscience. 7, 687(2013).</li>
<li>Thut, G., Miniussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+rhythmic+brain+activity+from+TMS-EEG+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cognitive+sciences%22%5BJournal%5D)">New insights into rhythmic brain activity from TMS-EEG studies.</a> Trends in cognitive sciences. 13 (4), 182-189 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+chronic+neural+electrodes+for+recording+single+unit+activity+and+electrocorticographic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (61), e3568(2012).</li>
<li>Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Continuous+EEG+Monitoring+in+Small+Rodent+Models+of+Human+Disease+Using+the+Epoch+Wireless+Transmitter+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52554(2015).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e50004(2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (12), (2008).</li>
</ol>

Antal Berényi jest właścicielem i założycielem Amplipex Ltd, firmy produkującej wielkoskalowe wzmacniacze biosygnałów multipleksowych. Gábor Kozák i Tamás Földi nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym etapem tego protokołu jest przyklejenie pakietu elektrod do powierzchni kości. W przypadku niewłaściwego uszczelnienia między elektrodami a kością tworzy się szczelina, a wtórna tkanka bliznowata może wrosnąć w tę szczelinę, co obniża jakość stymulacji. Powierzchnia kości musi być całkowicie sucha podczas etapów naklejania na opakowanie, a w przypadku wystąpienia niestabilności elektrod należy ją usunąć i zastąpić nowym pakietem, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
Ograniczeniem te...

Przezczaszkowa stymulacja elektryczna (TES) jest cennym podejściem metodologicznym do wpływania na aktywność mózgu w ograniczony czasowo sposób. W zależności od wielkości i umiejscowienia elektrod stymulacyjnych, TES może wpływać na dużą objętość mózgu i rozpraszać populacje neuronów1,2,3. Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym jest już medycznie zatwierdzona do leczenia poważnych zaburzeń depresyjnych4,5, a wiele badań koncentruje się na pokazaniu poznawczych efektów stymulacji przezczaszkowej u ludzi6,7. Ponadto przedstawiono obiecujące wyniki dotyczące potencjału TES w kontrolowaniu napadów padaczkowych8,9.
Pomimo intensywnych badań, wciąż istnieje wiele otwartych pytań dotyczących szczegółowego mechanizmu działania, potencjalnych skutków ubocznych i długoterminowych wyników zastosowania tej metody10,11,12. Dlatego niezwykle ważne jest posiadanie solidnego, powtarzalnego protokołu do badania wpływu TES na modele zwierzęce. Biorąc pod uwagę, że wiele zaburzeń (np. depresja, padaczka i schizofrenia) można dokładnie zbadać tylko u przytomnych zwierząt, a charakter tych schorzeń zwykle wymaga długotrwałego leczenia, przedstawiamy protokół przewlekłej implantacji elektrod przezczaszkowych u szczurów. Przedstawiona tutaj metoda może być stosowana do badań behawioralnych lub może być połączona z implantacją elektrod rejestrujących (tj. drutów, sond silikonowych, zestawionych elektrod komórkowych) lub z przewlekłymi oknami czaszkowymi odpowiednio do eksperymentów elektrofizjologicznych i badań obrazowych. W zależności od projektu eksperymentalnego, czas bodźców może być losowy lub wyzwalany przez zdarzenie w zależności od określonych sygnałów behawioralnych lub elektrofizjologicznych cech charakterystycznych poszczególnych stanów mózgu (drgawki, oscylacje theta)8,11,13.
Ważne jest, aby wspomnieć, że w przeciwieństwie do obecnie stosowanego podejścia ludzkiego, które wykorzystuje ucieleśnienie elektrod umieszczonych na skórze, tutaj pokazujemy metodę, która wykorzystuje podskórną implantację bezpośrednio na powierzchni kości skroniowej, ponieważ szczury ledwo tolerują wszystko, co jest łatwo dostępne za pomocą ich łap.
Zgodnie z zasadami Wymiany, Redukcji i Udoskonalenia, ze względu na przewlekły charakter implantacji, ta metoda pomaga zmniejszyć liczbę zwierząt, ponieważ każde zwierzę może być rekrutowane w różnych warunkach eksperymentalnych przez miesiące, co pozwala na użycie mniejszej liczby zwierząt do testowania różnych hipotez.
W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy, krok po kroku protokół produkcji elektrod do stymulacji przezczaszkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-B) i demonstrujemy chroniczne wszczepianie tych elektrod w kości skroniowe sześciomiesięcznego samca szczura Long-Evans.

<table><tbody><tr><td>Płyn cyjanoakrylowy</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Żel cyjanoakrylowy</td><td>Henkel</td><td>Loctite 454</td><td></td></tr><tr><td>Drut do elektrod stymulacyjnych</td><td>Phoenix Wire Inc.</td><td>36744MHW - PTFE Mikrominiaturowe złącze kablowe</td><td></td></tr><tr><td>dystansowe</td><td>E-tec Interconnect</td><td>SP1-020-S378/01-55</td><td></td></tr><tr><td>Złącze</td><td>E-tec Interconnect</td><td>P2510I-02</td><td></td></tr><tr><td>Opakowanie taśmowe do elektrod stymulacyjnych</td><td>Nexperia</td><td>74HC1G00GW</td><td>Można zastosować opakowanie taśmowe dowolnego układu scalonego z obudową SOT-353</td></tr><tr><td>Grip Cement klasy przemysłowej</td><td>Dentsply</td><td>675571 (proszek) 675572 (rozpuszczalnik)</td><td></td></tr><tr><td>Żel elektroprzewodzący</td><td>Rextra</td><td>ECG Żel</td><td></td></tr><tr><td>Drut elektrody rejestrującej</td><td>California Fine Wire Co.</td><td>.002 (50 mikronów) Wolfram 99,95% (Materiał CFW #: 100-211), HMl-Naturalny, cięty na kawałki 3,0 cala, Okrągły, Długość cięcia drutu</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienkie nożyczki</td><td>Hammacher Instrumente</td><td>Stainless HSB 544-09</td><td></td></tr><tr><td>Rura ze stali nierdzewnej</td><td>Vita Needle Company</td><td>29 RW, 304SS Rury, T.I.G. Spawane i wtykowe</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa piła obrotowa</td><td>Dremel</td><td>Model # 395</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt piły obrotowej</td><td>Dremel</td><td>Model # 220</td><td></td></tr><tr><td>Piła obrotowa tarcza do cięcia</td><td>Dremel</td><td>Model # 409</td><td></td></tr><tr><td>Pałeczki do okularów</td><td>Lohmann-Rauscher</td><td>Pro-ophta Pałeczki do okularów</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do dezynfekcji na mokro</td><td>Egis</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Suchy środek dezynfekujący</td><td>Wagner Pharma</td><td>Wiertarka septylowo-mocznikowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NSK-Nakanishi Wielka Brytania</td><td>Vmax35RV Pakiet</td><td></td></tr><tr><td>kotwiące</td><td>Antrin Miniature Specialties, Inc.</td><td>000-120x1/16 WIĄZANIE SL MS SS</td><td></td></tr></tbody></table>

przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Przezczaszkowa stymulacja elektryczna (TES) to potężne i stosunkowo proste podejście do dyfuzyjnego wpływania na aktywność mózgu, czy to losowo, czy w sposób wyzwalany zdarzeniami w pętli zamkniętej. Chociaż wiele badań koncentruje się na możliwych korzyściach i skutkach ubocznych TES w zdrowych i patologicznych mózgach, nadal istnieje wiele fundamentalnych otwartych pytań dotyczących mechanizmu działania stymulacji. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba opracowania solidnej i powtarzalnej metody badania ostrych i przewlekłych skutków TES u gryzoni. TES można łączyć ze zwykłymi technikami behawioralnymi, elektrofizjologicznymi i obrazowania w celu zbadania sieci neuronalnych in vivo. Wszczepienie elektrod do stymulacji przezczaszkowej nie nakłada dodatkowych ograniczeń na projekt eksperymentalny, a jednocześnie oferuje wszechstronne, elastyczne narzędzie do manipulowania aktywnością mózgu. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku do wytwarzania i wszczepiania elektrod do stymulacji przezczaszkowej, aby wpływać na aktywność mózgu w sposób ograniczony czasowo przez wiele miesięcy.

Implantację chronicznych elektrod stymulacyjnych (Rysunek 1B) można połączyć z dodatkową implantacją elektrod rejestrujących (Rysunek 1C-D). Takie ustawienia pozwalają na stworzenie systemów rejestracji i stymulacji uruchamianych na żądanie w celu interferencji z konkretnymi aktywnościami mózgu. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki działania systemu detekcji i interwencji w zamkniętej pętli w przypadku epil...

Ten szczegółowy protokół opisuje umieszczanie elektrod stymulacji przezczaszkowej na kości skroniowej w celu zbadania krótko- i długoterminowych efektów przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u swobodnie poruszających się szczurów.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie krok po kroku protokołu wytwarzania i wszczepiania elektrod do przewlekłej stymulacji przezczaszkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurostymulacji, takie jak długoterminowe skutki czasowo ukierunkowanej rozproszonej przezczaszkowej stymulacji elektrycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że niewielki rozmiar implantu sprawia, że metoda ta nadaje się do łączenia z regularnymi elektrofizjologicznymi technikami optogenetycznymi i obrazowania u swobodnie poruszających się zwierząt.Implikacje tej techniki koncentrują się na terapii padaczki, depresji i innych zaburzeń neuropsychologicznych, ponieważ jest ona w stanie szybko wpływać na sieci mózgowe na dużą skalę. Aby wykonać elektrodę stymulacyjną, wytnij sześć 10-centymetrowych kawałków miniaturowych przewodów połączeniowych. Usuń dwa centymetry okładziny z jednej strony i jeden centymetr z drugiego końca.Następnie skręć ze sobą dwa i je krótszą oderwaną stroną. Następnie zdobądź pasek trzech taśm pakujących dowolny układ scalony z obudową SOT-353. Zszyj skręcone druty przez trzy otwory w opakowaniu.Dłuższy oderwany odcinek drutów powinien znajdować się we wnękach opakowania. Ułóż tak, aby koniec izolacji znajdował się w jednej linii z krawędzią otworów. Następnie nałóż cement dentystyczny na otwory, aby przymocować przewody.Gdy cement zastygnie, odwróć opakowanie, aby wprowadzić cienką warstwę super kleju do otworu, aby utworzyć uszczelnienie typu wodnego w kierunku porowatego cementu. Unikaj klejenia obranych drutów. Następnie skręć razem po krótszej, oderwanej stronie i je.Chwyć dłuższy, obrany odcinek drutów końcówką cienkiej pęsety. Zwiń je i zawiń w wgłębienia. W razie potrzeby odetnij nadmiar.Aby wykonać elektrodę trypletową do nagrywania, wytnij centymetrowy kawałek rurki ze stali nierdzewnej za pomocą szybkoobrotowej piły obrotowej. Zdejmij płetwę z końców rurki za pomocą ostrej igły i upewnij się, że rurka jest wolna od zanieczyszczeń i całkowicie przepuszczalna. Zegnij pozłacany kołek dystansowy do deski o minimalnej długości trzech centymetrów, aby utworzyć uchwyt w kształcie litery J.Wytnij dłuższą nogę w kształcie litery J i ją razem, aby odzyskać oryginalny kształt, aby utworzyć odłączane połączenie między długą częścią liniową, która będzie utrzymywana przez urządzenie stereotaktyczne, a kształtem litery U, który będzie utrzymywał elektrodę i służył jako punkt kotwiczenia. Następnie sklej ze sobą rurkę i krótszą nogę uchwytu J. W razie potrzeby przyklej kilka dodatkowych prętów o długości jednego centymetra, aby zapewnić stabilność.Następnie wytnij trzy kawałki drutów elektrodowych o długości 2,5 centymetra za pomocą ultracienkich nożyczek ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że jest to wyraźne i ostre cięcie, a izolacja jest nienaruszona na okrągłej powierzchni drutu elektrody. Upewnij się również, że przycięta końcówka nie jest wygięta pod wpływem przyłożonej siły.Zegnij jeden lub dwa milimetry na jednym końcu każdego z drutów pod różnymi kątami, aby można je było odróżnić. Następnie napełnij rurkę drutami i wybierz odpowiedni rozstaw elektrod do eksperymentu. Zwróć uwagę, który drut odpowiada której głębokości, aby utrzymać właściwą kolejność kanałów.Gdy druty ustawią się tuż obok siebie i będą równoległe do rurki, przymocuj druty elektrody, umieszczając pojedynczą kroplę płynnego super kleju na obu końcach rurki za pomocą ostrej igły. Upewnij się, że klej spływa do rurki ze względu na efekt kapilarny, ale nie w kierunku miejsc nagrywania na wystających końcach. Przygotuj płytkę interfejsu elektrody z odpowiednim mikrozłączem kompatybilnym z systemem nagrywania, który ma być używany.Następnie wprowadź zagięte końce przewodów do otworów płytki interfejsu elektrody odpowiadających żądanemu kanałowi nagrywania. Gdy wszystkie druty znajdą się na swoim miejscu, wepchnij złote szpilki w otwory pęsetą. W tej procedurze usuń większość włosów ze skóry głowy zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia włosów.Następnie nałóż krem do depilacji na skórę głowy. Rozprowadź go równomiernie na powierzchni i odczekaj kilka minut. Użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć krem i pozostałe włosy.Spłucz skórę środkiem dezynfekującym. Wstrzyknij 1 do 2% lidokainy podskórnie, aby znieczulić skórę. Następnie nałóż jedną kroplę maści weterynaryjnej na każde oko.Wykonaj dokładne i długie nacięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej skalpelem od czoła do szyi. Następnie wypreparuj tkanki, w tym okostną z czaszki. Następnie za pomocą dłuta lub pęsety do zębów oczyść obszar między grzebieniami dwóch kości skroniowych.Utrzymuj czaszkę odsłoniętą, chowając wyciętą skórę za pomocą czterech buldogów. Delikatnie umieść cienką pęsetę między stromą krawędzią kości skroniowej a mięśniami i rozdziel je. Wykonuj ruchy drgające, aby odsłonić jak największą powierzchnię kości skroniowej, najlepiej od krawędzi kości potylicznej do płaszczyzny szwów koronalnych, nie uszkadzając przy tym mięśni.Następnie umieść zwijacze dwuczasowo, aby kości skroniowe były odsłonięte. Spłucz powierzchnię czaszki jednym do dwóch mililitrów 3% nadtlenku wodoru. Następnie bardzo dokładnie umyj go jednym do dwóch mililitrów wody i pozostaw powierzchnię kości skroniowych, aby zetrzeć wilgoć patyczkami do oczu.Następnie sprawdź, czy elektrody stymulacyjne przylegają do oczyszczonej pionowej powierzchni czaszki. Górna krawędź elektrody stymulacyjnej powinna znajdować się w jednej linii z krawędzią kości skroniowej. Wyreguluj buldogi i zwijacze lub w razie potrzeby uformuj elektrody stymulacyjne nożyczkami.Następnie wypełnij wnęki elektrod stymulacyjnych żelem przewodzącym prąd elektryczny. I nałóż cienką warstwę kleju na krawędź elektrod. Umieść elektrodę stymulacyjną na suchej powierzchni kości skroniowej jednym dokładnym ruchem i przytrzymaj ją mocno przez minutę za pomocą cienkiej pęsety.Upewnij się, że klej nie ma kontaktu z wilgocią i w razie potrzeby wytrzyj patyczkami do oczu. Upewnij się, że elektroda stymulująca jest równomiernie przyklejona do suchej kości skroniowej. Często wycieraj wilgoć i ostrożnie otaczające tkanki.W razie potrzeby poproś o pomoc. Następnie nałóż cement dentystyczny na krawędzie elektrody stymulującej, podczas gdy wyciekająca wilgoć z tkanek jest stale suszona za pomocą patyczków do oczu. Przykryj całą elektrodę stymulacyjną cementem.Po całkowitym stwardnieniu cementu powtórz te czynności po stronie przeciwnej. Następnie, używając głowicy wiertarskiej o średnicy mniejszej o 10% w porównaniu ze średnicą, wywierć kilka otworów w całej czaszce do zakotwienia. Wkręć miniaturowe w otwory i nałóż na nie cement dentystyczny.Następnie kontynuuj wszczepianie elektrod rejestrujących. złącza i zakotwicź je do konstrukcji na końcu. Następnie obficie umyj odsłonięte tkanki środkiem dezynfekującym.Wstrzyknąć 1 do 2% lidokainy podskórnie. Następnie, aby rozmnożyć brzegi rany, należy je objąć prostymi, przerwanymi szwami wokół implantu łącznika. Następnie zdezynfekuj ranę jodem powidonu.W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki systemu wykrywania i interwencji napadów padaczkowych w pętli zamkniętej, zastosowanego u szczurów Long-Evans, wyrażających napady spontaniczne. Wiadomo, że ten pociąg wykazuje objawy behawioralne w elektrograficznych wzorcach padaczki nieobecności, zwanej wyładowaniem kolczastym i falowym. Przedstawiono tutaj ślady LFP interwencji napadowej, wykazujące stabilną skuteczność czasowo ukierunkowanych bodźców w przerywaniu napadów przez 16 tygodni.Świadczy to o solidności i niezawodności wszczepionych elektrod stymulacyjnych. Aby umieścić te wyniki w kontekście, oto nagranie przerwanego eksperymentu, w którym tkanka wtórna rosła między kością skroniową a powierzchnią elektrody, z powodu niewłaściwego uszczelnienia i zacementowania elektrod. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepić elektrody do stymulacji przezczaszkowej.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wszczepienie elektrod rejestrujących lub okien czaszkowych, w celu zarejestrowania różnych modalności podczas stymulacji.

chronic-transcranial-electrical-stimulation-intracortical-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy przydatne informacje dla chirurgów uczących się procesu implantacji chronicznych elektrod do rejestracji sygnałów neuronalnych. Opisano techniki stosowane dla systemów elektrod penetrujących oraz powierzchniowych w modelu gryzoni.

Chirurgiczna implantacja chronicznych elektrod neuronowych do rejestracji aktywności pojedynczych jednostek i sygnałów elektrokortykograficznych

Ten film demonstruje metodę wszczepienia systemu elektrod na głowę znieczulonemu szczurowi w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym. Zabieg polega na umieszczeniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących, zabezpieczeniu ich cementem dentystycznym oraz podłączeniu do wzmacniacza montowanego na głowie.

Implantacja systemu elektrod na głowie w modelu szczurzym w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym

Źródło: Fritsch, B. et al. Przezczaszkowa elektryczna stymulacja mózgu u czujnych gryzoni. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wszczepianie elektrod i zastosowanie przezczaszkowej stymulacji elektrycznej (tES) do kory ruchowej czujnych szczurów. Przedstawiono w nim etapy związane z umieszczeniem elektrod, dostarczaniem stymulacji i wynikającą z tego aktywacją neuronów i mikrogleju, podkreślając jej potencjał neuroterapeutyczny.

Przezczaszkowa stymulacja elektryczna kory ruchowej u obudzonego szczura

Źródło: Beom, J., et al. Powtarzająca się przezczaszkowa stymulacja magnetyczna do jednostronnej półkuli mózgu szczura. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje zastosowanie powtarzalnej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej (rTMS) u znieczulonych szczurów w celu modulacji pobudliwości kory mózgowej. Procedura polega na określeniu progu motorycznego (MT) w celu ustalenia stymulacji wyjściowej, a następnie zastosowaniu rTMS o intensywności powyżej MT w celu wywołania depolaryzacji neuronów.

Modulowanie pobudliwości korowej u szczura za pomocą powtarzalnej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Ten protokół opisuje chirurgiczną konfigurację stałego leja elektrody oczaszkowej i wszczepionej elektrody klatki piersiowej u gryzoni. Umieszczając drugą elektrodę w gnieździe, różne rodzaje przezczaszkowej elektrycznej stymulacji mózgu mogą być dostarczane do układu motorycznego u zwierząt czujnych przez nienaruszoną czaszkę.

Przezczaszkowa elektryczna stymulacja mózgu u czujnych gryzoni

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.

Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę przewlekłej przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u szczurów do badania wpływu na aktywność mózgu. Technika ta umożliwia terapię epilepsji i depresji poprzez modulację sieci neuronalnych.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Przeglądaj więcej filmów