Name: Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę pobierania nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiaru upłynnienia nasienia u myszy. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów wyzwalania plemników z koagulum nasiennego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez fundusz startowy College of Veterinary Medicine (WSU) dla WW. Autorzy dziękują Sierra Olsen (WSU) za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Wszystkie zwierzęta i procedury użyte w tym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Waszyngton (WSU) oraz zgodnie z zatwierdzonymi przez WSU protokołami dla zwierząt #4702 i #4735.
1. Myszy
<ol>
	<li>Użyj standardowych dorosłych myszy płci męskiej C57BL/6J lub innych interesujących szczepów. Utrzymuj zwierzęta w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
	<ol>
		<li>Używaj samców w wieku od 8 tygodni do 10 miesięcy. W eksperymentach używaj tylko sprawdzonych hodowców.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy użyć dorosłych samic myszy z tkankową selektywną delecją α receptora estrogenowego układu rozrodczego (kodowanego przez gen Esr1) w komórkach nabłonkowych10 (Wnt7aCre/+;Esr1f/f, zwany nokautem lub "KO") i kontrolny rodzeństwo z miotu (Esr1f/f, zwany "CTRL") w tym badaniu.
	<ol>
		<li>Użyj 8 tygodniowych samic. Wiek kobiet różnił się w zależności od eksperymentu, który był przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ etapy cyklu rujowego rano o godzinie 08:00. Używaj tylko samic na etapie rui cyklu. Szczegółowe metody rozmazywania pochwy i analizy cytologicznej można znaleźć w wcześniej opublikowanych procedurach11.</li>
</ol>
2. Łączenie i ocena zatyczek kopulacyjnych
<ol>
	<li>W dniu rui (16:00) umieść samicę w klatce samca.</li>
	<li>Następnego ranka (08:00) oddziel samicę od samca myszy.</li>
	<li>Użyj adaptacji wcześniej opublikowanej metody12, aby uzyskać dostęp do obecności lub braku czopa dopochwowego lub kopulacyjnego jako wskaźnika krycia.</li>
	<li>Przytrzymaj samicę myszy od nasady ogona, aby na krótko unieść tylne kończyny.</li>
	<li>Znajdź czop kopulacyjny na podstawie obecności białawego skrzepu nasiennego przy otworze pochwy za pomocą wykałaczki. Jeśli czop kopulacyjny jest obecny, wykałaczka nie będzie mogła zostać wprowadzona do kanału pochwy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przed pobraniem tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj 10 ml pożywki L-15 Leibovitz, uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą (zwaną pożywką L15 + 1% FBS) w probówce o pojemności 15 ml. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej.</li>
	<li>W celu zachowania żywotności tkanek i plemników do dalszych zastosowań, podwielokrotność 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki L15 + 1% FBS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml w celu pobrania tkanek.</li>
	<li>Rozgrzać stolik mikroskopu stereoskopowego do 37 °C. Ustawić blok grzewczy na 37 °C i umieścić w nim pustą probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Jeśli dalsze zastosowania wymagają obrazowania ruchliwości plemników, należy ogrzać szkiełko do temperatury 37 °C.</li>
</ol>
4. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Przynieś wstępnie ogrzaną pożywkę L15 + 1% podwielokrotność FBS do obszaru pobierania tkanek.</li>
	<li>Poddaj kobietę eutanazji (~08:30h) za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. 
	UWAGA: Jest to około 8 godzin po kryciu, przy założeniu, że krycie odbywa się o północy.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, aby odsłonić obszar brzucha.</li>
	<li>Spryskaj 70% alkoholem brzuch w pobliżu kończyn tylnych.</li>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać małe nacięcie (~1 cm) na skórze dolnej części brzucha.</li>
	<li>Użyj ręki dominującej, aby pociągnąć za ogon (i kończyny tylne, jeśli to konieczne), podczas gdy ręka niedominująca ciągnie skórę w przeciwnym kierunku (w kierunku głowy), aby odsłonić mięśnie brzucha. Ta metoda jest stosowana w celu zminimalizowania ilości zanieczyszczenia narządów trzewnych włosami.</li>
	<li>Przetnij mięsień brzucha w kształcie litery V u podstawy brzucha, w sąsiedztwie pochwy, aby odsłonić narządy trzewne.</li>
	<li>Przesuń jelita i tłuszcz brzuszny na bok, aby odsłonić układ rozrodczy.</li>
	<li>Odetnij pęcherz moczowy i inne tkanki powyżej obszaru pochwy.</li>
	<li>Rozetnij spojenie łonowe, aby uzyskać dostęp do tkanki pochwy.</li>
	<li>Podnieś tkankę pochwy przy wejściu do pochwy i za pomocą nożyczek oddziel kanał pochwy od tkanki odbytnicy.</li>
	<li>Ostrożnie odetnij tłuszcz krezkowy z obu stron macicy za pomocą nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Macica jest bardzo delikatna z nasieniem w środku. Uważaj, aby nie przebić macicy, w przeciwnym razie nasienie zostanie utracone.</li>
	<li>Podnieś dolny układ rozrodczy i odetnij poduszeczkę tłuszczową jajnika z obu stron.</li>
	<li>Przenieść cały układ rozrodczy do probówki z podgrzaną pożywką L-15 firmy Leibovitz + 1% FBS.</li>
</ol>
5. Pomiar upłynnienia nasienia (lepkości) z kolekcji zawartości macicy
<ol>
	<li>Na podgrzewanym stoliku mikroskopu stereoskopowego przenieś tkanki do sterylnego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm wypełnionego 3,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki L-15 + 1% FBS, aby oczyścić tkanki z krwi i innych zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Podczas mycia chwyć chusteczki za tłuszcz, a nie za macicę. W tym momencie oczekuje się, że nasienie będzie nienaruszone w macicy.</li>
	<li>Osusz tkanki z nadmiaru pożywki za pomocą chusteczek laboratoryjnych.</li>
	<li>Przytrzymaj tkankę na końcu pochwy, jednocześnie umieszczając końce jajników w podgrzanej probówce do mikrowirówki. Trzymając koniec pochwy, odetnij rogi macicy u podstawy macicy, pozwalając rogom macicy wpaść do probówki mikrowirówki.</li>
	<li>Pozwól nasieniu wypłynąć z rogów macicy do rurki. Użyj bezzębnych kleszczy, aby delikatnie ścisnąć rogi macicy od końca jajnika do końca pochwy, wydalając resztki nasienia.</li>
	<li>Wyrzuć tkanki do torby na zagrożenia biologiczne i sspalaj.</li>
	<li>Krótko odwiruj nasienie w miniwirówce (~1-2 s).</li>
	<li>Połóż rurkę równolegle do podgrzanego etapu - nasienie nie wyleje się.</li>
	<li>Przygotuj minutnik i ustaw go na "odliczanie".</li>
	<li>Wprowadzić rurkę kapilarną o pojemności 25 μl do próbki nasienia pod kątem 180° (równolegle do ścianki probówki). Ma to na celu zminimalizowanie zmienności między każdym badaczem wynikającej z trzymania rurki kapilarnej pod różnymi kątami.</li>
	<li>Naciśnij timer, gdy tylko rurka kapilarna zetknie się z nasieniem.</li>
	<li>Zapisać czas (s) potrzebny do osiągnięcia przez nasienie objętości 25 μl.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru natychmiast umieść probówkę zawierającą nasienie z powrotem w bloku suchego ciepła w celu dalszej analizy funkcjonalnej, takiej jak obrazowanie wideo ruchliwości plemników.</li>
	<li>Zdezynfekuj rurkę kapilarną zawierającą nasienie, zanurzając probówkę w 10% roztworze wybielacza na 20 minut i wyrzuć rurkę kapilarną do pojemnika na ostre przedmioty.</li>
</ol>
6. Obrazowanie wideo ruchliwości plemników
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i oprogramowanie do obrazowania wideo.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl pozostałego nasienia na wstępnie podgrzane szkiełko podstawowe, podczas gdy szkiełko umieszczono na podgrzewanym stoliku.</li>
	<li>Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na mikroskopie.</li>
	<li>Użyj obiektywu 20X, aby znaleźć obszar zainteresowania.</li>
	<li>Zmień obiektyw na 100X do obrazowania wideo.</li>
	<li>Nagrywaj wideo z prędkością 12 klatek/s (fps) przez 30 s.</li>
	<li>Losowo nagrywaj filmy w co najmniej 3 różnych obszarach na zwierzę.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie szybko i zminimalizuj ekspozycję na światło na szkiełko, aby zachować ruchliwość i żywotność plemników. 
	UWAGA: Ta procedura obrazowania powinna być wykonana w ciągu 2-3 minut.</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania ImageJ, jak opisano wcześniej8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pobieranie nasienia z macicy myszy może mieć przewagę nad analizą nasienia in vitro , ponieważ ta pierwsza może zilustrować fizjologiczne interakcje między nasieniem a wydzielinami z żeńskiego układu rozrodczego. Techniki przedstawione w tym badaniu pozwalają naukowcom określić jakość nasienia, a także żywotność i ruchliwość plemników w idealnych warunkach fizjologicznych. Ponadto istnieją różne dalsze analizy, które można przeprowadzić przy użyciu nasienia pobranego z macicy, na przykład plemniki można...

Żeński układ rozrodczy składa się z górnego i dolnego odcinka. Górny układ rozrodczy obejmuje jajowody, macicę i szyjkę macicy. Dolny układ rozrodczy obejmuje szyjkę macicy i pochwę. U ludzi wytrysk nasienia odkłada się na przedniej ścianie pochwy, w sąsiedztwie ectocervivix1. Jednak u myszy nasienie jest zamiatane do macicy w ciągu kilku minut po kryciu2.
Nasienie zawiera żel nasienny, który krzepnie w ciągu kilku sekund od wytrysku, powodując uwięzienie i unieruchomienie plemników3. Upłynnienie uwalnia unieruchomione plemniki poprzez zmianę konsystencji z żelowej na wodnistą. Proces ten ma zasadnicze znaczenie dla ruchliwości plemników i reprodukcji ssaków. Wiedza na temat upłynniania nasienia opiera się głównie na badaniach in vitro, w których nasienie ulega upłynnieniu w naczyniu hodowlanym. U ludzi aktywność enzymatyczna antygenu swoistego dla prostaty lub PSA (znanego również jako peptydaza 3 związana z kalikreiną lub KLK3) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do upłynnienia poprzez hydrolizę semenogelin (białek tworzących żel obecnych w nasieniu)4,5,6. Degradacja semenogelin uwalnia plemniki z krzepu nasiennego, zwiększając ruchliwość plemników. Uwolnione plemniki płyną w kierunku jajowodu, aby zapłodnić komórkę jajową. Testy upłynniania (lub lepkości nasienia) są jednym ze standardowych wstępnych badań przesiewowych do analizy nasienia w klinikach leczenia niepłodności w celu oceny męskiej płodności7.
Niedawno opublikowany artykuł pokazuje, że analiza płynu nasiennego pobranego z układu rozrodczego samicy myszy po kryciu może być wykorzystana do zilustrowania niedoboru upłynnienia, który może następnie powodować zaburzenia płodności8. Wadliwe upłynnienie, takie jak nadmierna lepkość nasienia, przyczynia się do 11,8-32,3% przypadków niepłodności u mężczyzn9, co sugeruje, że normalne upłynnienie jest niezbędne do reprodukcji ssaków. Jednak badania i leczenie wad upłynniania koncentrowały się wyłącznie na male7. Możliwość, że żeński układ rozrodczy odgrywa rolę w upłynnianiu nasienia, nie została zbadana. W związku z tym metody pobierania nasienia i pomiaru czasu skraplania dostarczą naukowcom nowatorskiego narzędzia diagnostycznego do określenia, czy upłynnienie może być jedną z przyczyn niepłodności w organizmie modelowym, który jest przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Wykałaczka</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoklawizowana sterylna, użyj wykałaczki. Nie używaj</td></tr><tr><td>nożyczek preparacyjnych</td> z końcówką punktową <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; L szklana rurka kapilarna</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Suplement z 1% FBS</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2-ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha nagrzewnica blokowa</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Do podgrzewania probówki mikrowirówki przed pobraniem nasienia</td></tr><tr><td>Miniwirówka</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynie hodowlane</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polipropylenowa probówka wirówkowa</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Precyzyjna</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Aby utrzymać ciepło tkanki przed pobieranie nasienia</td></tr><tr><td>Mikroskop Brightfield</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>opcjonalna. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>podstawowe Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td>rozcieńczyć w stężeniu dH2O do stężenia 10%</td></tr></tbody></table>

pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

U myszy wytrysk nasienia deponuje się w macicy. Po wytrysku nasienie zmienia konsystencję z żelowej na wodnistą, w procesie zwanym upłynnieniem. W tym badaniu pokazujemy, jak pobrać nasienie po wytrysku z żeńskiego układu rozrodczego w modelu mysim. Po pierwsze, dorosłe samice myszy w stadium rui były trzymane na noc w klatce samca. Następnego ranka kopulacja została potwierdzona przez obecność czopa kopulacyjnego przy wejściu do pochwy. Samice myszy z czopami kopulacyjnymi poddano eutanazji, a każdy układ rozrodczy pobrano jako całość (pochwę, macicę, jajowody, jajniki), zapewniając zamknięty system zatrzymujący nasienie. Układ rozrodczy umieszczono w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a pochwę odcięto, aby uwolnić nasienie do probówki. Aby zapewnić maksymalną objętość nasienia do analizy, użyto bezzębnych kleszczy do ściskania rogów macicy od końca jajnika do końca pochwy, usuwając pozostałe nasienie. Cały układ rozrodczy został wtedy wyrzucony. Rurka zawierająca nasienie została na krótko odwirowana. Pipetę kapilarną o pojemności 25 μl umieszczono w probówce pod kątem 180° (równolegle do ścianki probówki). Zarejestrowano czas potrzebny na napełnienie rurki kapilarnej do linii o pojemności 25 μl. Nasienie od sprawdzonego hodowcy płci męskiej zwykle potrzebuje około 60-180 s, aby wypełnić rurkę kapilarną o pojemności 25 μl. Ta technika pobierania nasienia może być również wykorzystywana w innych dalszych zastosowaniach, takich jak obrazowanie plemników i analiza ruchliwości.

Nasienie pobrano od samic CTRL i KO około 8 h po kopulacji z płodnymi samcami CTRL. Upłynnienie (lub lepkość nasienia) określono na podstawie czasu potrzebnego do wypełnienia kapilary o pojemności 25 μL nasieniem. Nasienie pobrane z macic CTRL wypełniło kapilarę w czasie 2,06 ±0,12 min (średnia±S.E.M, n = 5) (Rycina 1). Natomiast w przypadku nasienia pobranego z macic KO czas ten przekroczył 60 min (60,0 ±0,0, średnia±S.E.M, n = 5) czasu eksperymentalnego. Dane te sugerują,...

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Celem tego badania jest określenie, w jaki sposób pobierać nasienie po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego oraz jak mierzyć upłynnienie nasienia u myszy. Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanu Waszyngton oraz zgodnie z zatwierdzonymi przez WSU protokołami dla zwierząt 4702 i 4735. U człowieka wytrysk nasienia odkłada się na przedniej ścianie pochwy przylegającej do szyjki macicy.Jednak u myszy nasienie jest zamiatane do macicy w ciągu kilku minut po kryciu. Nasienie zawiera żel nasienny, który zestala się w ciągu kilku sekund od wytrysku, powodując unieruchomienie plemników. Proces upłynniania zmienia konsystencję nasienia z żelowej na wodnistą.Proces ten ma zasadnicze znaczenie dla ruchliwości plemników i reprodukcji ssaków. Aktywność enzymatyczna swoistego antygenu swoistego dla prostaty lub PSA jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do upłynnienia poprzez hydrolizę żelu nasiennego lub białka tworzącego żel obecnego w nasieniu. Degradacja białka tworzącego żel uwalnia plemniki z krzepnięcia nasienia, zwiększając ruchliwość plemników, dzięki czemu plemniki płyną w kierunku górnego żeńskiego układu rozrodczego w celu zapłodnienia komórki jajowej w jajowodzie.Metoda pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar czasu upłynnienia obecne w tym badaniu dostarczą naukowcom nowego narzędzia diagnostycznego do ustalenia, czy upłynnienie może być jedną z przyczyn niepłodności w badanym organizmie modelowym. Dalej są procedury, w których myszy są kojarzone i określa się czop pochwowy. Można użyć standardowych dorosłych samców myszy C57BL/6 lub innych interesujących szczepów.Wykorzystano tylko samice w fazie rui cyklu. Szczegółowa metoda rozmazu z pochwy i analizy cytologicznej znajduje się w wcześniej opublikowanych procedurach. O czwartej po południu.W dniu rui samica była trzymana w klatce samca. Następnego ranka o godzinie ósmej samica zostaje oddzielona od klatki samca. Za pomocą sterylnej płaskiej wykałaczki oceniono obecność lub brak osadzenia się czopa dopochwowego lub kopulacyjnego jako wskazanie krycia przy użyciu procedury zaadaptowanej z wcześniej opublikowanej metody.Następna jest procedura przygotowania przed pobraniem tkanki. Przygotuj 10 mililitrów pożywki L-15 Leibovitz uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą lub pożywką L-15 plus 1% FBS w 15-mililitrowej probówce. Podgrzej podłoże w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.W celu zachowania żywotności tkanki i plemników do dalszych zastosowań, należy podać dwa mililitry pożywki w dwumililitrowej probówce do pobrania tkanek. Rozgrzej stolik mikroskopu stereoskopowego do 37 stopni Celsjusza. Ustaw blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza.Umieść pustą rurkę w bloku grzewczym. Ogrzej również szkiełko do 37 stopni Celsjusza, jeśli dalsza aplikacja wymaga obrazowania ruchliwości plemników. Dalej są procedury pobierania tkanek.Oto narzędzia, które będą używane do pobierania tkanek. Poddaj samicę eutanazji natychmiast po sprawdzeniu czopa za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, aby odsłonić obszar brzucha.Rozpyl 70% etanolu na brzuch. Wykonaj małe nacięcie około jednego centymetra na skórze w dolnej części brzucha. Pociągnij ogon i skórę w przeciwnych kierunkach, aby odsłonić mięsień brzucha.Przetnij mięsień brzucha w kształcie litery V u podstawy brzucha. Przesuń jelita i tłuszcz brzuszny na bok, aby odsłonić układ rozrodczy. Odetnij pęcherz moczowy i inne tkanki powyżej obszaru pochwy.Rozetnij spojenie łonowe, aby uzyskać dostęp do tkanek pochwy. Pociągnij część związaną spojeniem łonowym za pomocą kleszczy rurkowych, aby odsłonić kanał pochwy. Podnieś tkankę pochwy przy otworze pochwy i użyj nożyczek, aby oddzielić kanał pochwy od tkanki odbytnicy poniżej.Ostrożnie odetnij tłuszcz krezkowy z obu stron macicy za pomocą nożyczek sprężynowych. Macica jest bardzo delikatna, a nasienie znajduje się w środku. Dlatego badacz powinien uważać, aby nie przebić macicy, w przeciwnym razie nasienie zostanie utracone.Odetnij poduszeczkę tłuszczową jajnika po obu stronach jajników. Przenieś cały układ rozrodczy do probówki z podgrzanym podłożem. Następna jest metoda pomiaru upłynnienia nasienia.Oto narzędzia do pobierania nasienia. Przenieś trzy mililitry ciepłego podłoża do 3,5-centymetrowego naczynia. Przenieś tkankę do naczynia.Umyj chusteczkę kilka razy, chwytając za poduszeczkę tłuszczową. W tym momencie nasienie powinno być nadal nienaruszone w macicy. Osusz tkankę na chusteczkach Kimwipes, aby pozbyć się nadmiaru podłoża.Przytrzymaj tkankę na końcu pochwy i umieść ją we wstępnie podgrzanej rurce, unosząc końce jajnika do pustej rurki. Przetnij oba rogi macicy między pochwą a macicą. Pozwól nasieniu wypłynąć z rogów macicy do rurki.Użyj bezzębnych kleszczy, aby delikatnie wycisnąć i wydalić resztki nasienia z rogów macicy. Krótko odwiruj nasienie na jedną do dwóch sekund. Ułóż rurkę równolegle do podgrzewanego stage'u.Włóż rurkę kapilarną o pojemności 25 mikrolitrów do próbki nasienia pod kątem 180 stopni. Ma to na celu zminimalizowanie zmienności między każdym badaczem wynikającej z trzymania rurki kapilarnej pod różnymi kątami. Zapisz czas potrzebny na osiągnięcie przez nasienie linii o pojemności 25 mikrolitrów.Czas skraplania określa się na podstawie czasu potrzebnego do napełnienia 25-mikrolitrowej rurki kapilarnej nasieniem. Nasienie pobrane z macicy kontrolnej potrzebowało około dwóch minut, aby wypełnić rurkę kapilarną. Jednak nasienie pobrane z nokautującej macicy zajęło więcej niż 60 minut czasu eksperymentalnego.Dane te sugerują, że nasienie jest znacznie bardziej upłynnione w grupie kontrolnej w porównaniu z macicą z nokautem. Oto jeden z przykładów dalszego zastosowania z wykorzystaniem obrazowania wideo ruchliwości plemników. Za pomocą końcówki pipety odpipetuj 25 mikrolitrów pozostałego nasienia na wstępnie podgrzane szkiełko podstawowe, podczas gdy szkiełko jest umieszczone na grzałce.Szkiełko nakrywkowe za pomocą szkiełka nakrywkowego. Przenieś szkiełko do mikroskopu, kładąc szkiełko nakrywkowe w dół. Użyj soczewki obiektywu 20X, aby znaleźć plemniki.Następnie zmień obiektyw na 100X do obrazowania wideo. Nagrywaj wideo z prędkością 12 klatek na sekundę przez 30 sekund. Nasienie pobrane z macicy kontrolnej wykazuje swobodnie pływające plemniki w polu mikroskopowym.Jednak nasienie pobrane z macicy z nokautem wykazało, że większość plemników była skupiona razem z minimalną ruchliwością. Odkrycia te sugerują, że nasienie pobrane z żeńskiego układu rozrodczego osiem godzin po kryciu można wykorzystać do dalszej analizy. Oprócz tych dalszych zastosowań, badacze mogą również ocenić wpływ inhibitorów lub związków będących przedmiotem zainteresowania, które zakłócają różne procesy transportu plemników, procesy takie jak upłynnianie plemników, liczba plemników w przewodzie pokarmowym, ruchliwość plemników lub migracja plemników w różnych obszarach żeńskiego układu rozrodczego.Związki te mogą być stosowane w żeńskim układzie rozrodczym przed kryciem. Następnie wpływ tych inhibitorów lub związków można ocenić na podstawie próbki nasienia po kryciu. Metody te mogą być przydatne do testowania praktyczności leków antykoncepcyjnych, które hamują transport plemników.

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół przedstawia metody ekstrakcji plemników z jąder samców oraz następującą po niej inseminację samic myszy. Procedura ta jest przydatna w badaniach rozwojowych wymagających precyzyjnego określenia czasu, a także w pracach nad organizmami transgenicznymi.

Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Wiele zabiegów i mutacji genetycznych wpływa na czas dojrzałości płciowej i płodności. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę oceny początku dojrzewania u myszy i szczurów przed rozpoczęciem badania płodności u zwierząt dojrzałych płciowo.

Określenie kompetencji rozrodczych poprzez potwierdzenie początku dojrzewania i przeprowadzenie testu płodności u myszy i szczurów

Skurcze macicy są ważne dla dobrego samopoczucia kobiet. Jednak patologicznie zwiększona kurczliwość może powodować bolesne miesiączkowanie, szczególnie u młodszych kobiet. W tym miejscu opisujemy prosty preparat ex vivo, pozwalający na szybką ocenę skuteczności leków zwiotczających mięśnie gładkie, które mogą być stosowane w leczeniu bolesnego miesiączkowania.

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzać testy zachowań seksualnych u samców myszy.

Ocena zachowań seksualnych samców myszy

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Procedura ta ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami za pomocą 2H2O lub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Buhaje znakowane deuterem są kojarzone z matkami nieoznakowanymi. Pobrane zarodki przedimplantacyjne są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oddzielenia metabolitów ojcowskich (deuterowanych) od matczynych (niedeuterowanych).

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

Poznaj metodę pobierania nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiaru upłynnienia nasienia u myszy. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów wyzwalania plemników z koagulum nasiennego.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Przeglądaj więcej filmów