Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero
17 listopada 2017
Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie genetycznej mozaiki w korze mózgowej myszy poprzez indukcję rekombinacji Cre-Lox poprzez elektroporację in utero. Ta metoda generowania mozaik genetycznych może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii. Na przykład określenie, czy gen jest niezbędny dla danego fenotypu neuronalnego w sposób autonomiczny dla komórki.
Główną zaletą tej techniki jest to, że skuteczny system rekombinacji Cre-Lox jest połączony z równie skuteczną techniką dostarczania genów w elektroporacji macicy. Chociaż metoda ta koncentruje się na celowaniu w neurony korowe warstwy drugiej-trzeciej, może być stosowana do celowania w neurony na innych głębokościach warstw korowych. Kiedy próbowaliśmy stworzyć mozaikę genetyczną w naszej tkance mózgowej, napotkaliśmy kilka problemów z zapewnieniem naszym zwierzętom doświadczalnym przetrwania po urodzeniu, więc wprowadziliśmy kilka uproszczeń i udoskonaleń do naszej techniki.
Przygotować pipetę z bardzo długim stożkiem i bardzo cienką końcówką, typową dla pipet do wstrzykiwania embrionalnych komórek macierzystych lub transferu jądra, najpierw wkładając szklaną kapilarnę do ściągacza pipet. Po zamocowaniu zacisków aktywuj program do protokołu ciągnięcia, tworząc stożek na szklanej kapilarze. Upewnij się, że długość stożka wynosi od 10 do 15 mm za pomocą mikroskopu światła złożonego.
Następnie, aby złamać końcówkę środka pipety, jednowarstwową zlewkę należy przetrzeć zlewką o pojemności 50 ml i rozciągnąć ją jedną ręką. Drugą ręką popchnij wyciągniętą pipetę stożkiem w dół, prostopadle przez środek chusteczki, powodując czystą przerwę w stożku. Sprawdź rozmiar otworu pod złożonym mikroskopem świetlnym.
Następnie skalibrować pipetę, odsysając 1 ml 0,4% błękitu trypanowego i PBS do częściowo napełnionej pipety i wyskalować pipetę z oznaczeniami 1 mcL na podstawie wysokości 1 mcL w pipecie. Użyj skalibrowanej pipety, aby wyskalować inne wyciągnięte pipety przed wyrzuceniem. Umieść pipety w uchwycie na pipety, nie gromadząc kurzu i innych cząstek.
Po głębokim znieczuleniu ciężarnej myszy w E-15.5, przetestuj odruch prostowania, delikatnie przechylając komorę indukcyjną i zwracając uwagę na reakcję myszy. Jeśli odruch prostowania jest nieobecny, przenieś mysz do obszaru przygotowania chirurgicznego i podawaj wziewny izofluran przez stożek nosowy, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Użyj kleszczyków, aby przetestować odruch pedałowania, aby zweryfikować znieczulenie.
Monitoruj częstość oddechów podczas wysiłku, szukając głębokiego, regularnego oddechu i tego, czy błony śluzowe są różowe i wilgotne. Nałóż na oczy wystarczającą ilość weterynaryjnej maści okulistycznej, aby całkowicie je zakryć w celu ochrony przed wysuszeniem. Wmasuj krem do depilacji w okolicę brzucha wacikami, aż sierść na brzuchu się rozpuści.
Następnie zetrzyj sierść na brzuchu. Ostrożnie usuń wszelkie pozostałości i krem do depilacji za pomocą 70% etanolu i bawełnianych wacików. Nałóż roztwór peelingu na bazie jodu na okolice brzucha okrężnymi ruchami.
Następnie użyj serwety chirurgicznej, aby odizolować obszar operacyjny i utrzymać sterylne warunki. Po wykonaniu 2-centymetrowego brzusznego nacięcia linii środkowej w skórze, znajdź linię białą, aby uwidocznić linię środkową mięśnia prostego brzucha. Pociągnij mięsień do góry i odsuń go od brzucha i wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną przy użyciu technik aseptycznych.
Za pomocą sterylnej końcówki mikropipety o pojemności 10 mcl dozuj karprofen do jamy brzusznej w celu znieczulenia. Następnie zaciśnij jeden kleszczyk komarów Hartmanna na lewej krawędzi nacięcia mięśnia prostego brzucha. Oprzyj kleszcze na przewróconej szalce Petriego po lewej stronie nacięcia, pozostawiając lewą stronę nacięcia otwartą.
Po zaciśnięciu prawej strony nacięcia w podobny sposób, umieść gąbkę z gazy wokół miejsca nacięcia. Używając kleszczy pierścieniowych bez dołączonej ograniczającej, pociągnij za macicę między dowolnymi dwoma sąsiednimi zarodkami bez zgniatania lub uszkadzania jakiejkolwiek tkanki. Zacznij wyciągać wszystkie zarodki przez nacięcie, kładąc je na gąbce z gazy.
Podłączyć skalibrowaną pipetę do zespołu rurki aspiratora i wstrzyknąć dokładnie 1 mcl roztworu DNA przygotowanego przez ścianę macicy do bocznej komory każdego zarodka. Za pomocą kciuka i palca wskazującego manipuluj zarodkami, co pozwala na delikatne dociśnięcie zarodków do ściany macicy podczas wstrzyknięcia. Komory boczne pojawiają się jako dwie ciemniejsze plamy na grzbietowej kresomózgowiu zarodka.
Potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia, obserwując, że błękit trypana wypełnia komorę boczną. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieść katodę elektrod typu pęseta na macicy, bezpośrednio nad korą przyśrodkową i ogonową, aby celować w korę wzrokową. Umieść anodę nieco poniżej i przed głową zarodka.
Za pomocą pedału nożnego wyzwolić dostarczanie impulsów o długości 550 ms o napięciu 50 woltów oddzielonych interwałem 950 ms. Po elektroporacji wszystkich zarodków należy przywrócić macicę do jamy brzusznej w tej samej orientacji, w jakiej została znaleziona. Użyj soli fizjologicznej do smarowania macicy, prowadząc ją ręcznie i bardzo delikatnie, uważając, aby nie przesunąć zarodków z ich pozycji w macicy.
Zamknij mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnych szwów. Użyj prostego przerwanego ściegu, wiążąc końce węzłem chirurgicznym. Zamknij warstwę skóry za pomocą wchłanialnych szwów.
Nałóż niewielką ilość kleju tkankowego, aby uszczelnić ranę. Nałóż klej tkankowy na węzły, aby zapobiec rozpinaniu. Użyj mikropipety, aby usunąć klej tkankowy otaczający ranę, który można odessać.
Po wyschnięciu kleju tkankowego należy usunąć zwierzę z izofluranu i pozwolić samicy dojść do siebie w ciepłej klatce. Kontynuuj monitorowanie myszy, aż w pełni odzyska sprawność i będzie zachowywać się normalnie. Po wyjęciu umieść samicę z powrotem w klatce z samcem.
Umieść czaszkę na płaskiej powierzchni za pomocą jednowarstwowych chusteczek zwilżonych 1-x PBS. Za pomocą pęsety najpierw usuń kość potyliczną. Następnie ostrożnie usuń kości ciemieniowe, wyjmując pęsetę i odsuwając ją od powierzchni mózgu.
Ostrożnie usuń wszelkie opony mózgowe, aby zapobiec uszkodzeniu kory. Wciśnij tylną część pęsety pod mózg wzdłuż czaszki, aby przeciąć nerwy czaszkowe i usunąć mózg. Użyj jednoostrzowej żyletki, aby wykonać cięcie koronalne około 0,5 mm rostral do bregma, a drugie cięcie koronalne około 0,5 mm ogonowo do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Blok tkankowy jest teraz gotowy do cięcia. Wstrzyknięcie 1 mcL lub 2 mg/ml GFP Cre powoduje rzadki rozkład znakowanych komórek, z których niektóre mogą być jasne. Ponieważ tkanka jest cięta na 100 mikronów, większość altan dendrytycznych jest zachowana.
Kiedy elektroporacja in utero jest wykonywana w 15,5 dniu embrionalnym, znakowanie następuje w drugiej i trzeciej warstwie kory mózgowej. Kolce dendrytyczne można obserwować przy dużych powiększeniach. Wstrzyknięcie 1,5 mcL lub 2 mg/ml GFP Cre powoduje bardzo gęste znakowanie, które może być nieoptymalne, ponieważ trudno jest śledzić źródło neurytów i kolców dendrytycznych.
Jednak wybierając jasną komórkę na obrzeżach oznaczonego obszaru, nadal możliwe jest zobrazowanie neuronu i jego procesów. Alternatywnie, wstrzyknięcie konstruktów SuperNova powoduje rzadki rozkład neuronów warstwy drugiej-trzeciej, które są bardzo jasno oznaczone. Po opanowaniu operacja elektroporacji in utero zajmie mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując tej procedury z innymi konstruktami DNA, ważne jest, aby pamiętać, aby wypróbować różne stężenia i objętości, co pomoże osiągnąć pożądaną rzadkość znakowania wymaganą do analizy mozaikowej. W naszych reprezentatywnych wynikach wykorzystaliśmy albo pojedynczy konstrukt, albo niedawno wynaleziony konstrukt SuperNova. W tym ostatnim przypadku odkryliśmy, że możemy osiągnąć doskonałe znakowanie rzadkie, jednocześnie maksymalizując jasność neuronów.
Technika ta może być zaadaptowana do tworzenia mozaiki tkanki mózgowej w inny sposób. Na przykład edycję genów CRISPR i Cas9 można połączyć z elektroporacją in utero, a rekombinację Cre-Lox można połączyć z dokomorowym wstrzyknięciem wektorów wirusowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć kilka uproszczonych i wyrafinowanych technik stosowanych w celu uzyskania rzadkiej mozaiki genetycznej, dzięki czemu możesz połączyć rekombinację Cre-Lox i elektroporację in utero.
Życzymy powodzenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół wykorzystujący elektroporację in utero w celu indukcji rekombinacji Cre-Lox w rzadkich populacjach neuronów kory mózgu u myszy. Technika ta ma na celu zbadanie funkcji autonomicznych komórkowo genów w korze mózgu myszy, co w ostateczności pomaga w zrozumieniu fenotypów neuronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- inżynieria genetyczna
- biologia rozwoju
Wprowadzenie
- Podejście to umożliwia ukierunkowane modyfikacje genetyczne w rozwijającym się mózgu.
- Ułatwia ono tworzenie mozaik genetycznych w modelu żywym.
- Celowanie w konkretne warstwy neuronalne zwiększa rozdzielczość badań funkcjonalnych.
- Metodę tę udoskonalono, aby rozwiązać problemy związane z przeżywalnością embrionów.
Cel badania
- Aby określić, czy konkretne geny są niezbędne dla określonych fenotypów neuronalnych.
- Aby zbadać wpływy genetyczne w obrębie zdefiniowanej, niewielkiej populacji neuronów.
- Aby zwiększyć przeżywalność embrionów w trakcie i po przeprowadzeniu eksperymentów.
Zastosowane metody
- W celu wprowadzenia rekombinazy Cre do rozwijających się zarodków zastosowano elektroporację in utero.
- Główny model biologiczny obejmował neurony korowe kory mózgu zarodków myszy.
- Kluczowe etapy obejmują przygotowanie pipety, iniekcję do zarodka oraz konfigurację elektroporacji.
- Kładzie się nacisk na opiekę pooperacyjną oraz monitorowanie stanu zdrowia matki i zarodków.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywne badania utraty funkcji in vivo.
- Specyficzne zmiany w funkcji genów mogą wyjaśnić rolę genów w określaniu tożsamości neuronów.
- Protokół ma na celu zwiększenie żywotności i przeżywalności wstrzykniętych embrionów, co jest kluczowe dla pomyślnych wyników eksperymentu.
Wnioski
- Badanie demonstruje niezawodną metodę indukowania zmian genetycznych w docelowych populacjach neuronalnych.
- Podejście to dostarcza wiedzy na temat funkcji genów w neurobiologii, co jest niezbędne do zrozumienia procesów neuronalnych oraz potencjalnych modeli chorób.
- Wnioski mają zastosowanie w różnych dziedzinach, w tym w badaniach genetycznych oraz neuronauce rozwojowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia analizę autonomicznej funkcji genów w rzadkich mozaikach neuronalnych, wspierając walidację celów w procesie odkrywania leków w neurologii. Dzięki połączeniu rekombinacji Cre-lox z elektroporacją in utero zapewnia ona powtarzalny system oceny konieczności i wystarczalności genów in vivo. Podejście to wspomaga mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację efektów genetycznych w określonych populacjach korowych, co pozwala na zwiększenie pewności co do wyboru celu na wczesnym etapie badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych poprzez rzadką analizę mozaikową funkcji genów w neuronach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie efektów autonomicznych komórkowo od nieautonomicznych komórkowo.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez walidację fenotypów genowych in vivo z wykorzystaniem rzadkiego znakowania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generowanie zwalidowanych mozaik neuronalnych do późniejszego screeningu fenotypowego perturbacji genowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja rzadkiego znakowania poprzez dostarczanie Cre o określonym mianie, co zwiększa powtarzalność eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Umożliwienie skalowalnego przygotowania systemów neuronalnych istotnych dla chorób do screeningu związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych dla chorób modeli korowych do badania funkcji genów w warstwowych architekturach neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od embrionalnej manipulacji genetycznej po postnatalną analizę morfologiczną za pomocą obrazowania konfokalnego.
- Wartość strategiczna: Ułatwia predykcyjne ograniczanie ryzyka poprzez powiązanie modulacji celu w okresie embrionalnym z neuronalnymi efektami strukturalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając walidację funkcji genów przed etapami opracowywania testów i identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących konieczności i wystarczalności genów w neuronach korowych za pomocą analizy mozaikowej.
- Przesiewanie: Dostarcza rzadkich populacji neuronów gotowych do analizy z etykietowaniem fluorescencyjnym dla odczytów opartych na obrazowaniu.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę morfologii arboryzacji dendrytycznej i aksonalnej oraz gęstości kolców jako wyników funkcjonalnych.
- Badania translacyjne: Łączy embrionalne celowanie genowe z postnatalnymi fenotypami strukturalnymi, wspierając walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do generowania mozaik genetycznych dla wielu celów genowych i konstruktów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki autonomicznemu fenotypowaniu komórkowemu in vivo.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja elektroporacji i kalibracji pipet poprawia powtarzalność oraz wskaźniki przeżywalności.
- Wartość strategiczna: Redukcja wyników fałszywie dodatnich w wyborze celu poprzez izolację efektów genowych w rzadkich mozaikach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane fenotypy neuronalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii embrionalnej, mikrochirurgii oraz pracy z tkanką nerwową.
- Zależność od skalibrowanych pipet szklanych, elektroporatorów oraz systemów obrazowania fluorescencyjnego.
- Konieczność standaryzacji mian konstruktów DNA oraz objętości wstrzykiwania w celu zapewnienia spójnego rozproszenia.
- Wymaga dostosowania do różnych warstw kory oraz etapów embrionalnych w celu zapewnienia szerokiej możliwości zastosowania w różnych obszarach docelowych.
- Ograniczone przez zmienność przeżywalności embrionów, co niweluje się poprzez udoskonalone protokoły chirurgiczne i elektroporacyjne.
