Name: Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę indukowania rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w neuronach kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za hojne wsparcie Wydziału Biologii Uniwersytetu Jamesa Madisona oraz Ośrodka Mikroskopii i Obrazowania Światła Uniwersytetu Jamesa Madisona. Dr Markowi L. Gabriele za pomocne porady dotyczące przygotowania młodych tkanek po porodzie, oraz dr Justinowi W. Brownowi i Coreyowi L. Clelandowi za hojną koordynację materiałów chirurgicznych i przestrzeni. Badania te zostały częściowo sfinansowane z grantu badawczego 4-VA, partnerstwa na rzecz rozwoju Wspólnoty Wirginii (G.S.V.) oraz z grantu badawczego Virginia Academy of Science Small Project Research Grant (GSV). Wsparcie zostało hojnie udzielone przez stypendium Betty Jo Loving Butler '58 Endowment for Undergraduate Research Scholarship (dla K.M.B.), stypendium Farrell Summer Research Scholarship (dla KMB), stypendium James Madison University Second Century Scholarship (dla KMB), stypendium James Madison University Centennial Scholarship (dla C.J.H.), stypendium James Madison University Lucy Robinson Search '30 Memorial Scholarship (dla Z.L.H.), oraz stypendium na pomoc wydziałowi James Madison University College of Science and Mathematics (dla GSV).

<ol><li>Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+plasticity+induced+by+inhibitory+neuron+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation.</a> Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Target+Cell-Specific+Role+for+Presynaptic+Fmr1+in+Regulating+Glutamate+Release+onto+Neocortical+Fast-Spiking+Inhibitory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons.</a> J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li>
<li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li>
<li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Copy+Number+Variation+in+Human+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons.</a> Science. 342 (6158), 632-637 (2013).</li>
<li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+diverse+neuronal+genomes+and+neuropsychiatric+disease%3A+The+Brain+Somatic+Mosaicism+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network.</a> Science. 356 (6336), eaal1641(2017).</li>
<li>Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+a+DNA+polymerase+beta+gene+segment+in+T+cells+using+cell+type-specific+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting.</a> Science. 265 (5168), 103-106 (1994).</li>
<li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Contributions+to+Synaptic+and+Learning+Abnormalities+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).</li>
<li>Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+with+inducible+cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).</li>
<li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Analysis+with+Double+Markers+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic Analysis with Double Markers in Mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+Lis1+and+Ndel1+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration.</a> Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).</li>
<li>De la Rossa, A., Jabaudon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+rapid+gene+delivery+into+postmitotic+neocortical+neurons+using+iontoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation.</a> Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).</li>
<li>Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-autonomous+role+of+excitatory+synaptic+transmission+in+the+regulation+of+neuronal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function.</a> Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+5A+inhibits+synaptogenesis+in+early+postnatal-+and+adult-born+hippocampal+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells.</a> eLife. 3, 1-24 (2014).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+Approaches+to+Study+the+Excitability+of+Neuronal+Subpopulations+and+Single-cell+Connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+In+utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-Regulated+Dynamics+of+Layer+4+Neuronal+Dendrites+during+Thalamocortical+Reorganization+in+Neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supernova%3A+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 35747(2016).</li>
<li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).</li>
<li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).</li>
<li>Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ars2+maintains+neural+stem-cell+identity+through+direct+transcriptional+activation+of+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2.</a> Nature. 481, 195-198 (2011).</li>
<li>Scotto-Lomassese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+new+neuron+differentiation+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://moodle2.units.it/pluginfile.php/145932/mod_resource/content/0/Plasmids%20101%20eBook%203rd%20Ed%20Final.pdf">Plasmids 101: A Desktop Resource</a>. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">Pipette Cookbook</a>. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).</li>
<li>Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+of+the+Cotton+Rat+in+Studies+for+the+Pre-clinical+Evaluation+of+Oncolytic+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses.</a> J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeary%2C+S+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).</li>
<li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Migration+from+Basal+Forebrain+to+Neocortex%3A+Dependence+on+Dlx+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes.</a> Science. 28 (5337), 474-476 (1997).</li>
<li>Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Multimodal+Analgesia+on+the+Success+of+Mouse+Embryo+Transfer+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).</li>
<li>Kim, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23347239">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Tutaj wprowadzamy połączenie elektroporacji in utero z rekombinazą Cre u myszy z klapami w celu wytworzenia mozaiki tkanki mózgowej. Zaletą tego podejścia jest to, że nowa linia myszy nie musi być generowana za każdym razem, gdy celem ma być inny podtyp komórkowy: elektroporacja in utero może być stosowana do celowania w neurony pobudzające, neurony hamujące lub glej, w zależności od czasu i miejsca elektroporacji 15,16,17,18,19,20,21...

Generowanie genetycznej mozaiki to klasyczny eksperymentalny paradygmat do zrozumienia funkcji interesującego genu. Aby ustalić, czy gen jest niezbędny dla fenotypu komórkowego, najprostszym podejściem jest spowodowanie utraty funkcji genu w całym organizmie (np. nokaut). Jednakże, aby określić, czy gen jest wymagany specyficznie w określonym typie komórki, nokaut genu w całym organizmie nie jest prawidłowym podejściem. Zamiast tego potrzebna jest metoda, która spowoduje utratę funkcji genu w danej komórce, podczas gdy jest ona otoczona tkanką typu dzikiego (tj. genetycznie niezaburzoną) – innymi słowy, tworząc tkankę mozaikową. Jeśli zmutowana komórka wykazuje zmutowany fenotyp, ale otaczające ją komórki typu dzikiego nie, gen działa w sposób autonomiczny dla komórki. Analiza tkanki mozaikowej, w której zmutowane komórki są otoczone tkanką typu dzikiego, jest idealna do zrozumienia autonomicznych funkcji genów w komórkach, zwłaszcza w mózgu, gdzie neurony i komórki glejowe tworzą rozległą sieć połączonych ze sobą tkanek.
Kilka form mozaikowej tkanki mózgowej dostarczyło potężnych modeli do badania autonomicznych funkcji genów w komórkach. Badania skoncentrowane na transplantacji neuronów1, kobiecej mozaikowości sprzężonej z chromosomem X2,3,4 i endogennej mozaiki somatycznej5,6 wyciągnęły swoje wnioski na podstawie mozaiki tkanki mózgowej. Warunkowa delecja genu za pomocą systemu rekombinacji Cre-lox jest metodą, która w pełni wykorzystuje dużą dostępność transgenicznych linii myszy. W tej metodzie dwa miejsca loxP są wprowadzane po obu stronach wymaganej sekwencji genu (takiej jak ekson), pozostawiając go otoczonym przez miejsca loxP, które są skierowane w tym samym kierunku ("floxed"). Rekombinaza Cre wycina sekwencję między miejscami loxP7. Rekombinację za pośrednictwem Cre można osiągnąć poprzez skrzyżowanie myszy z floksami z inną linią myszy wykazującą ekspresję rekombinazy Cre wraz z markerem fluorescencyjnym w podzbiorze komórek ("linia reporterowa Cre"). Wykazano to na wiele sposobów, aby odkryć funkcje genu w podzbiorach komórek, takich jak neurony pobudzające lub astrocyty8. Linie reporterowe Cre mogą wyrażać CreERT2, aby umożliwić rekombinację za pośrednictwem Cre indukowaną lekiem (znakowanie pojedynczego neuronu z indukowalnym nokautem za pośrednictwem Cre lub SLICK)9. W innej strategii zwanej analizą mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)10,11, rekombinacja międzychromosomowa za pośrednictwem Cre umożliwia utworzenie homozygotycznego mutanta wraz z tkanką heterozygotyczną. W tych podejściach nowa linia myszy musi być produkowana za każdym razem dla każdego testowanego genu kandydującego lub podtypu komórkowego. Alternatywnie, rekombinaza Cre może być wprowadzana po urodzeniu przez jonoforezę12 lub przez wektory wirusowe (np. wirusy związane z adenowirusami13 lub lentiwirusy14 przenoszące promotory specyficzne dla podtypu komórkowego). Ta strategia tworzy silne i postnatalne etykietowanie. Aby celować w rozwijające się neurony kory mózgowej rzadko i prenatalnie, idealną strategią jest elektroporacja rekombinazy Cre w macicy za pomocą markera fluorescencyjnego.
Oprócz łączenia rekombinacji Cre-lox poprzez elektroporację in utero w celu wytworzenia tkanki mozaikowej in vivo, wprowadzamy kilka adaptacji do procedur z innych opublikowanych protokołów15,16,17,18,19,20,21. Dostarczamy informacji, które pomogą nam odnieść sukces w hodowli samic w ciąży w czasie. Przedstawiamy również nasze dwie strategie wprowadzania rzadkiego i jasnego znakowania neuronów w tkance korowej: Jedną ze strategii jest miareczkowanie poziomów pojedynczego konstruktu kodującego rekombinazę Cre i markera fluorescencyjnego22. Inną strategią jest użycie systemu "Supernova", zaprojektowanego specjalnie z myślą o tych parametrach23,24. Ponadto oferujemy ulepszenia w zakresie produkcji spójnych pipet do mikroiniekcji i uproszczenia w chirurgii elektroporacji in utero. Na koniec przedstawiamy krytyczne etapy uproszczonego preparatu histologicznego, który umożliwia analizę kolców dendrytycznych oraz altan dendrytycznych i aksonalnych, bez dalszego barwienia lub immunohistochemii.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>#000664</td><td>Patrz "1. Konfiguracja myszy" (krok 1.1, "myszy typu dzikiego")</td></tr><tr><td>GFP. Cre pusty wektor</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>Zobacz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.1 "pojedynczy konstrukt DNA kodujący rekombinazę Cre oraz marker fluorescencyjny"). Dobra praktyka rolnicza. Cre pusty wektor był prezentem od Tylera Jacksa.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) był prezentem od Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) była prezentem od Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) był prezentem od Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.3 "zestaw do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn")</td></tr><tr><td>Trypan Blue w proszku, klasa BioReagent</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "błękit trypanowy")</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, ACS, 2,5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2,5 kg</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>Chlorek potasu, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "KCl")</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>Kwas solny, odczynnik ACS, 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Patrz "3. Konfiguracja pipety" (krok 3.1 "ściągacz do szklanych kapil")</td></tr><tr><td>Filament z włóknem o szerokości 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>Patrz "3. Konfiguracja pipet" (krok 3.1 "ściągacz do szklanych kapil")</td></tr><tr><td>Szklane kapilary cienkościenne, 4", 1 / 0,75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Patrz "3. Konfiguracja pipety" (krok 3.1.1 "szklana kapilara")</td></tr><tr><td>Jednowarstwowe chusteczki Soft-Tech, 4,5"</td> <td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>Patrz "3. Konfiguracja pipet" (krok 3.2.1 "jednowarstwowe wycieranie zadaniowe"); Można stosować inne chusteczki jednowarstwowe (np. Kimwipes).</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, 7 cm, proste, 0,7 mm 1x2 zęby</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>Zobacz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Kleszcze Graefe")</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa, 11,5 cm, proste, 12-pak</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "nożyczki do tęczówki")</td></tr><tr><td>Kleszcze do komarów Hartman, 9 cm, proste, 12-pak</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Kleszcze komarów Hartmana")</td></tr><tr><td>Gąbki włókninowe ogólnego przeznaczenia, 2" x 2", 4-warstwowe</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "gąbki z włókniny")</td></tr><tr><td>Kleszcze z końcówką pierścieniową, 10 cm, proste, 2,2 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.1 "kleszcze z pierścieniową końcówką")</td></tr><tr><td>Płytki Petriego z Pyrexu kompletne, OD i razy; H 100 mm i razy; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Szalki Petriego")</td></tr><tr><td>Płaska taca na instrumenty, stal nierdzewna, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>Zobacz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "taca ze stali nierdzewnej")</td></tr><tr><td>Pęseta platynowa, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.3 i 4.16 "elektrody typu pęseta")</td></tr><tr><td>ECM 830 Pedał nożny</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.3 i 4.17 "pedał nożny")</td></tr><tr><td>Generator ECM 830</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.3 "generator")</td></tr><tr><td>System znieczulenia izofluranem dla pojedynczych zwierząt z małą skrzynką indukcyjną</td><td>Aparat Harvard</td>#<td>72-6468</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.4 i 4.6 "stożek nosa", krok 4.4 "komora indukcyjna")</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.7 "weterynaryjna maść okulistyczna")</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.8 "szczelnie zamknięta torebka wypełniona przesyconym roztworem soli")</td></tr><tr><td>Żel do depilacji w kremie, formuła wrażliwa</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.9 "krem do depilacji")</td></tr><tr><td>10ul Rozrusznik końcówki o niskiej retencji (960 końcówek / pk)</td> <td>Produkty badawcze Phenix</td><td>TSP-10LKIT</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.12 "sterylne 10 & mikro; L końcówka do mikropipet</td></tr><tr><td>")Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.15 "Zespół rurki aspiratora")</td></tr><tr><td>Pleciony szew wchłanialny, 4-0, Igła NFS-2(FS-2), 27"</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.19 "szwy wchłanialne")"</td></tr><tr><td> LiquiVet Rapid" Klej tkankowy</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.20 "klej tkankowy")</td></tr><tr><td>Strzykawki podskórne, polipropylen, końcówka Luer lock, pojemność 1,0 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.21 "Strzykawka 1 ml")</td></tr><tr><td>Igły do strzykawek BD Precisionglide o grubości 26, L 1/2 cala.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.21 "26G, &frac12; &rdquo; igła")</td></tr><tr><td>Gniazda Materiał zagnieżdżający</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.24 "Materiały do gniazdowania")</td></tr><tr><td>Nasiona słonecznika, olej, sterylny</td><td>Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.24 "nasiona słonecznika")</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>Pęseta ekonomiczna #3, końcówki 11 cm, 0,2 x 0,4 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.5 "pęseta")</td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.8.1 "agar")</td></tr><tr><td>Ostrza do golenia z pojedynczą krawędzią, ostrze #9</td><td>Stanley Tools</td><td>#11-515</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.9 "żyletka jednoostrzowa")</td></tr><tr><td>Tarcza z próbką S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.9 "wibrujący krążek z próbką mikrotomu")</td></tr><tr><td>Taca buforowa Zespół S</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "taca buforowa")</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "wibrujący mikrotom")</td></tr><tr><td>Żyletki z podwójną krawędzią</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "ostrze")</td></tr><tr><td>Uchwyt noża S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "uchwyt na nóż")</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon Zestaw okrągłych szczotek z krótką rączką</td><td>Amazon</td><td>B0089KU6XE</td><td>Zobacz "5. Histologia" (krok 5.12.1 "pędzel z cienką końcówką")</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>#71869-11</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.1 "szkiełko mikroskopowe")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.3-5.12.4 "mocowanie")</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, 24 x 50 mm, nr 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.4 "szkiełko nakrywkowe")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.13.1 "DAPI")</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Olympus</td><td></td><td>BX51WI</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.15 "mikroskop świetlny")</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.15 "mikroskop konfokalny")4x</td></tr> <tr><td>obiektyw, NA = 0,20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw małej mocy")obiektyw</td></tr> <tr><td>20x, NA = 0,75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw średniej mocy")</td></tr><tr><td>Obiektyw 60x, NA = 1.40</td><td>Olej Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X</td><td>Patrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw o dużej mocy")</td></tr></tbody></table>

indukowanie rekombinacji cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Autonomiczne funkcje neuronalne genów mogą zostać ujawnione poprzez spowodowanie utraty lub utraty funkcji genu w małej i nielicznej populacji neuronów. W tym celu konieczne jest stworzenie mozaiki, w której neurony z utratą lub utratą funkcji genu są otoczone genetycznie niezaburzoną tkanką. W tym przypadku łączymy system rekombinacji Cre-lox z elektroporacją in utero w celu wygenerowania mozaiki tkanki mózgowej, którą można wykorzystać do badania autonomicznej funkcji genów w neuronach. Konstrukty DNA (dostępne za pośrednictwem repozytoriów), kodujące znacznik fluorescencyjny i rekombinazę Cre, są wprowadzane do rozwijających się neuronów korowych zawierających geny otoczone miejscami loxP w mózgach zarodków myszy za pomocą elektroporacji in utero. Dodatkowo opisujemy różne adaptacje metody elektroporacji in utero, które zwiększają przeżywalność i odtwarzalność. Metoda ta obejmuje również ustalenie miana dla rekombinacji za pośrednictwem Cre w rzadkiej lub gęstej populacji neuronów. Preparaty histologiczne znakowanej tkanki mózgowej nie wymagają (ale mogą być dostosowane do) immunohistochemii. Zastosowane konstrukty gwarantują, że znakowane fluorescencyjnie neurony są nosicielami genu rekombinazy Cre. Preparaty histologiczne umożliwiają analizę morfologiczną neuronów poprzez obrazowanie konfokalne altanek dendrytycznych i aksonalnych oraz kolców dendrytycznych. Ponieważ utrata lub wzrost funkcji jest osiągany w rzadkiej tkance mozaikowej, metoda ta pozwala na badanie autonomicznej potrzeby i wystarczalności produktów genowych in vivo.

Pojedynczy konstrukt GFP.Cre (patrz lista materiałów) został wprowadzony metodą elektroporacji w dniu E15.5 i zwizualizowany w dniu P14. W zależności od stężenia konstruktu oraz objętości iniekcji można uzyskać wynik rzadki lub gęsty2,26. Na przykład iniekcja 1 µL GFP.Cre o stężeniu 2 mg/mL skutkuje rzadkim rozkładem znakowanych komórek, z których niektóre mogą być jasne (Rycina 1A) i zlokalizowane w ...

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie genetycznej mozaiki w korze mózgowej myszy poprzez indukcję rekombinacji Cre-Lox poprzez elektroporację in utero. Ta metoda generowania mozaik genetycznych może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii. Na przykład określenie, czy gen jest niezbędny dla danego fenotypu neuronalnego w sposób autonomiczny dla komórki.Główną zaletą tej techniki jest to, że skuteczny system rekombinacji Cre-Lox jest połączony z równie skuteczną techniką dostarczania genów w elektroporacji macicy. Chociaż metoda ta koncentruje się na celowaniu w neurony korowe warstwy drugiej-trzeciej, może być stosowana do celowania w neurony na innych głębokościach warstw korowych. Kiedy próbowaliśmy stworzyć mozaikę genetyczną w naszej tkance mózgowej, napotkaliśmy kilka problemów z zapewnieniem naszym zwierzętom doświadczalnym przetrwania po urodzeniu, więc wprowadziliśmy kilka uproszczeń i udoskonaleń do naszej techniki.Przygotować pipetę z bardzo długim stożkiem i bardzo cienką końcówką, typową dla pipet do wstrzykiwania embrionalnych komórek macierzystych lub transferu jądra, najpierw wkładając szklaną kapilarnę do ściągacza pipet. Po zamocowaniu zacisków aktywuj program do protokołu ciągnięcia, tworząc stożek na szklanej kapilarze. Upewnij się, że długość stożka wynosi od 10 do 15 mm za pomocą mikroskopu światła złożonego.Następnie, aby złamać końcówkę środka pipety, jednowarstwową zlewkę należy przetrzeć zlewką o pojemności 50 ml i rozciągnąć ją jedną ręką. Drugą ręką popchnij wyciągniętą pipetę stożkiem w dół, prostopadle przez środek chusteczki, powodując czystą przerwę w stożku. Sprawdź rozmiar otworu pod złożonym mikroskopem świetlnym.Następnie skalibrować pipetę, odsysając 1 ml 0,4% błękitu trypanowego i PBS do częściowo napełnionej pipety i wyskalować pipetę z oznaczeniami 1 mcL na podstawie wysokości 1 mcL w pipecie. Użyj skalibrowanej pipety, aby wyskalować inne wyciągnięte pipety przed wyrzuceniem. Umieść pipety w uchwycie na pipety, nie gromadząc kurzu i innych cząstek.Po głębokim znieczuleniu ciężarnej myszy w E-15.5, przetestuj odruch prostowania, delikatnie przechylając komorę indukcyjną i zwracając uwagę na reakcję myszy. Jeśli odruch prostowania jest nieobecny, przenieś mysz do obszaru przygotowania chirurgicznego i podawaj wziewny izofluran przez stożek nosowy, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Użyj kleszczyków, aby przetestować odruch pedałowania, aby zweryfikować znieczulenie.Monitoruj częstość oddechów podczas wysiłku, szukając głębokiego, regularnego oddechu i tego, czy błony śluzowe są różowe i wilgotne. Nałóż na oczy wystarczającą ilość weterynaryjnej maści okulistycznej, aby całkowicie je zakryć w celu ochrony przed wysuszeniem. Wmasuj krem do depilacji w okolicę brzucha wacikami, aż sierść na brzuchu się rozpuści.Następnie zetrzyj sierść na brzuchu. Ostrożnie usuń wszelkie pozostałości i krem do depilacji za pomocą 70% etanolu i bawełnianych wacików. Nałóż roztwór peelingu na bazie jodu na okolice brzucha okrężnymi ruchami.Następnie użyj serwety chirurgicznej, aby odizolować obszar operacyjny i utrzymać sterylne warunki. Po wykonaniu 2-centymetrowego brzusznego nacięcia linii środkowej w skórze, znajdź linię białą, aby uwidocznić linię środkową mięśnia prostego brzucha. Pociągnij mięsień do góry i odsuń go od brzucha i wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną przy użyciu technik aseptycznych.Za pomocą sterylnej końcówki mikropipety o pojemności 10 mcl dozuj karprofen do jamy brzusznej w celu znieczulenia. Następnie zaciśnij jeden kleszczyk komarów Hartmanna na lewej krawędzi nacięcia mięśnia prostego brzucha. Oprzyj kleszcze na przewróconej szalce Petriego po lewej stronie nacięcia, pozostawiając lewą stronę nacięcia otwartą.Po zaciśnięciu prawej strony nacięcia w podobny sposób, umieść gąbkę z gazy wokół miejsca nacięcia. Używając kleszczy pierścieniowych bez dołączonej ograniczającej, pociągnij za macicę między dowolnymi dwoma sąsiednimi zarodkami bez zgniatania lub uszkadzania jakiejkolwiek tkanki. Zacznij wyciągać wszystkie zarodki przez nacięcie, kładąc je na gąbce z gazy.Podłączyć skalibrowaną pipetę do zespołu rurki aspiratora i wstrzyknąć dokładnie 1 mcl roztworu DNA przygotowanego przez ścianę macicy do bocznej komory każdego zarodka. Za pomocą kciuka i palca wskazującego manipuluj zarodkami, co pozwala na delikatne dociśnięcie zarodków do ściany macicy podczas wstrzyknięcia. Komory boczne pojawiają się jako dwie ciemniejsze plamy na grzbietowej kresomózgowiu zarodka.Potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia, obserwując, że błękit trypana wypełnia komorę boczną. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieść katodę elektrod typu pęseta na macicy, bezpośrednio nad korą przyśrodkową i ogonową, aby celować w korę wzrokową. Umieść anodę nieco poniżej i przed głową zarodka.Za pomocą pedału nożnego wyzwolić dostarczanie impulsów o długości 550 ms o napięciu 50 woltów oddzielonych interwałem 950 ms. Po elektroporacji wszystkich zarodków należy przywrócić macicę do jamy brzusznej w tej samej orientacji, w jakiej została znaleziona. Użyj soli fizjologicznej do smarowania macicy, prowadząc ją ręcznie i bardzo delikatnie, uważając, aby nie przesunąć zarodków z ich pozycji w macicy.Zamknij mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnych szwów. Użyj prostego przerwanego ściegu, wiążąc końce węzłem chirurgicznym. Zamknij warstwę skóry za pomocą wchłanialnych szwów.Nałóż niewielką ilość kleju tkankowego, aby uszczelnić ranę. Nałóż klej tkankowy na węzły, aby zapobiec rozpinaniu. Użyj mikropipety, aby usunąć klej tkankowy otaczający ranę, który można odessać.Po wyschnięciu kleju tkankowego należy usunąć zwierzę z izofluranu i pozwolić samicy dojść do siebie w ciepłej klatce. Kontynuuj monitorowanie myszy, aż w pełni odzyska sprawność i będzie zachowywać się normalnie. Po wyjęciu umieść samicę z powrotem w klatce z samcem.Umieść czaszkę na płaskiej powierzchni za pomocą jednowarstwowych chusteczek zwilżonych 1-x PBS. Za pomocą pęsety najpierw usuń kość potyliczną. Następnie ostrożnie usuń kości ciemieniowe, wyjmując pęsetę i odsuwając ją od powierzchni mózgu.Ostrożnie usuń wszelkie opony mózgowe, aby zapobiec uszkodzeniu kory. Wciśnij tylną część pęsety pod mózg wzdłuż czaszki, aby przeciąć nerwy czaszkowe i usunąć mózg. Użyj jednoostrzowej żyletki, aby wykonać cięcie koronalne około 0,5 mm rostral do bregma, a drugie cięcie koronalne około 0,5 mm ogonowo do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.Blok tkankowy jest teraz gotowy do cięcia. Wstrzyknięcie 1 mcL lub 2 mg/ml GFP Cre powoduje rzadki rozkład znakowanych komórek, z których niektóre mogą być jasne. Ponieważ tkanka jest cięta na 100 mikronów, większość altan dendrytycznych jest zachowana.Kiedy elektroporacja in utero jest wykonywana w 15,5 dniu embrionalnym, znakowanie następuje w drugiej i trzeciej warstwie kory mózgowej. Kolce dendrytyczne można obserwować przy dużych powiększeniach. Wstrzyknięcie 1,5 mcL lub 2 mg/ml GFP Cre powoduje bardzo gęste znakowanie, które może być nieoptymalne, ponieważ trudno jest śledzić źródło neurytów i kolców dendrytycznych.Jednak wybierając jasną komórkę na obrzeżach oznaczonego obszaru, nadal możliwe jest zobrazowanie neuronu i jego procesów. Alternatywnie, wstrzyknięcie konstruktów SuperNova powoduje rzadki rozkład neuronów warstwy drugiej-trzeciej, które są bardzo jasno oznaczone. Po opanowaniu operacja elektroporacji in utero zajmie mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując tej procedury z innymi konstruktami DNA, ważne jest, aby pamiętać, aby wypróbować różne stężenia i objętości, co pomoże osiągnąć pożądaną rzadkość znakowania wymaganą do analizy mozaikowej. W naszych reprezentatywnych wynikach wykorzystaliśmy albo pojedynczy konstrukt, albo niedawno wynaleziony konstrukt SuperNova. W tym ostatnim przypadku odkryliśmy, że możemy osiągnąć doskonałe znakowanie rzadkie, jednocześnie maksymalizując jasność neuronów.Technika ta może być zaadaptowana do tworzenia mozaiki tkanki mózgowej w inny sposób. Na przykład edycję genów CRISPR i Cas9 można połączyć z elektroporacją in utero, a rekombinację Cre-Lox można połączyć z dokomorowym wstrzyknięciem wektorów wirusowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć kilka uproszczonych i wyrafinowanych technik stosowanych w celu uzyskania rzadkiej mozaiki genetycznej, dzięki czemu możesz połączyć rekombinację Cre-Lox i elektroporację in utero.Życzymy powodzenia.

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

W tym filmie, genetycznie zmodyfikowane mysie szczenię z genem Ccm2 otoczonym miejscami loxP i rekombinazą Cre połączonej z receptorem estrogenowym jest używane do wywoływania mózgowych malformacji jamistych (CCM). Podanie 4-hydroksytamoksyfenu aktywuje Cre w komórkach śródbłonka, prowadząc do delecji Ccm2 i powstania CCM w mózgu.

Indukcja wad rozwojowych jamistych mózgu za pośrednictwem Cre-LoxP w modelu mysim

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Migracja neuronów jest regulowana przez liczne czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórki.  Protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać elektroporację in utero do określenia, czy fenotyp u myszy transgenicznej jest spowodowany zakłóceniem wewnętrznego mechanizmu komórki lub upośledzeniem interakcji między neuronem a jego środowiskiem.

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

Poznaj metodę indukowania rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w neuronach kory mózgowej.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Przeglądaj więcej filmów