Name: Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj prostą metodę immunofluorescencyjną opartą na komórkach HEK293 do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Medyczną Chang Gung (grant numer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 i CMRPG3E0633).

Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital w Linkuo, Taoyuan, Tajwan (102-2577A3).
1. Przygotowanie plazmidu ekspresyjnego NR1-GFP
<ol>
	<li>Wymieszaj 10 ng plazmidu NR1-GFP ze 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli, przecedź DH5α w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół 4-6 razy i inkubuj probówkę na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 42 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej, wyjąć probówkę z łaźni wodnej, dodać 1 ml bulionu lizogenicznego (LB) do probówki i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozprowadzić 50 μl mieszaniny na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (0,1 mg/ml) i inkubować płytkę agarową LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej końcówki wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB na noc i zakręć końcówką w probówce do hodowli bakteryjnej zawierającej 5 ml pożywki LB i ampicyliny (0,1 mg / ml). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze, wytrząsając przez noc.</li>
	<li>Podać 3 ml nocnej hodowli bakteryjnej do kolby o pojemności 500 ml, która zawiera 250 ml sterylnej pożywki LB i ampicylinę (0,1 mg/ml). Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, wstrząsając. Regularnie sprawdzaj gęstość optyczną (OD) kultury bakteryjnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrometru, aż OD600 osiągnie 0,6-1,0, 
	UWAGA: Dobrze wymieszaj 800 μl nocnej kultury bakteryjnej z 200 μl glicerolu w celu przygotowania bulionu glicerolowego i przechowuj zapas glicerolu w temperaturze poniżej -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przygotować plazmid ekspresji NR1-GFP z 250 ml kultury bakteryjnej
	<ol>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego RNazę; dokładnie przetrząsać, aż nie będzie widać grudki.</li>
		<li>Dodać 10 ml buforu do lizy do zawiesiny bakteryjnej, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy i inkubować lizat w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego buforu strącającego do lizatu, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy.</li>
		<li>Wlej lizat do cylindra wkładu filtracyjnego z założoną nakrętką; odczekaj 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zdjąć nasadkę z dyszy wylotowej wkładu, włożyć tłok do wkładu i delikatnie nacisnąć tłok. Zebrać przefiltrowany lizat do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Do przefiltrowanego lizatu dodać 2,5 ml zastrzeżonego buforu od producenta, wymieszać mieszaninę, odwracając probówkę około 10 razy i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Przefiltrowaną mieszaninę lizatu nanieść na kolumnę filtracyjną, która została wstępnie zrównoważona 10 ml buforu równoważącego. Pozwól kolumnie spłynąć grawitacyjnie.</li>
		<li>Przemyć kolumnę dwukrotnie 30 ml buforu do przemywania wodą, a następnie wymyć DNA z kolumny za pomocą 15 ml buforu elucyjnego.</li>
		<li>Dodać 10,5 ml (0,7 objętości) izopropanolu do eluowanego buforu DNA, dobrze wymieszać i odwirować mieszaninę przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować supernatant, przemyć osad DNA 5 ml 70% etanolu wolnego od endotoksyn i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Zdekantować sklarant, suszyć osad przez 5-10 minut w okapie chemicznym i rozpuścić osad w 300-500 μl buforu wolnego od endotoksyn</li>.
		<li>Oznaczyć stężenie plazmidu, mierząc absorpcję roztworu w promieniowaniu UV 260/280 nm za pomocą spektrofotometru. 
		UWAGA: Przygotuj ekspresję plazmidu GFP przy użyciu tego samego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek HEK293 z plazmidem ekspresyjnym NR1-GFP
<ol>
	<li>Podamy 200 μl 2% roztworu żelatyny do każdego dołka na 48-dołkowej płytce hodowlanej i inkubujemy płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Odessać roztwór żelatyny z dołka i wysiać 5 x 104 komórek HEK293 w 200 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w każdym dołku. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% CO2 przez noc. 
	UWAGA: Komórki policzono za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp zużytą pożywkę hodowlaną 200 μl świeżej pożywki zawierającej 10% FBS na studzienkę.</li>
	<li>Dla każdej pojedynczej studzienki przygotować roztwór A, mieszając 100 ng plazmidu NR1-tGFP z 20 μl pożywki hodowlanej, a roztwór B mieszając 0,8 μl odczynnika do transfekcji z 20 μl pożywki hodowlanej. Pomnóż liczbę studzienek potrzebnych do przygotowania całkowitej objętości dla każdego eksperymentu.</li>
	<li>Przygotować roztwór C, mieszając roztwór A i roztwór B, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.</li>
	<li>Porcję 40 μl roztworu C do każdej studzienki zawierającej komórki HEK293, delikatnie zakręcić płytką i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Sprawdź ekspresję rekombinowanego białka NR1-GFP w komórkach gospodarza pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 40X-200X (wzbudzenie/emisja: 482/502 nm) i przejdź do testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach. 
	UWAGA: Transfekować ekspresję plazmidu GFP do komórek HEK293 przy użyciu tego samego protokołu.</li>
</ol>
3. Test immunofluorescencyjny oparty na komórkach
<ol>
	<li>Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, a następnie przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Dodać 200 μl 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki; inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odessać roztwór paraformaldehydu ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBS.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl 10% odtłuszczonego mleka w roztworze PBST (0,1% Tween-20 w PBS) i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Odessać 10% odtłuszczone mleko w roztworze PBST ze studzienki, a następnie przemyć studzienki 200 μl PBST raz.</li>
	<li>Inkubować studzienki z rozcieńczonym osoczem (1:100 w PBST) jako przeciwciałem pierwszorzędowym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 h, 
	UWAGA: Osocze uzyskuje się z krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu.</li>
	<li>Odessać rozcieńczone osocze ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.</li>
	<li>Dodać 200 μl koziej antyludzkiej IgG sprzężonej z Alexa Fluor 594 (rozcieńczenie 1:1,000 w PBST) do każdej studzienki i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać kozę anty-ludzką IgG sprzężoną z roztworem Alexa Fluor 594 i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu glicerolu (50% glicerolu w PBS i 1:100 000 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)) do każdego dołka.</li>
	<li>Obserwuj i obrazuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą okularu 10X oraz obiektywów 4X, 10X i 20X. 
	UWAGA: Do każdego barwnika należy stosować odpowiedni filtr: dla NR1-GFP (wzbudzenie/emisja = 482/502 nm), dla Alexa Fluor 594 (wzbudzenie/emisja = 561/594 nm), dla DAPI (wzbudzenie/emisja = 358/461 nm). Przeprowadzić kontrolę ujemną przy użyciu komórek HEK wykazujących ekspresję GFP w ten sam sposób.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W literaturze opisano kilka testów immunologicznych opartych na komórkach w celu zbadania obecności autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA, w tym test immunofluorescencji opartej na żywych komórkach11, test immunofluorescencyjny oparty na stałych komórkach9 i test oparty na cytometrii przepływowej14. Test immunofluorescencyjny na żywych komórkach powinien być wykonany wkrótce po przygotowaniu komórek eksprymujących ektopowo białko NR1, podczas gd...

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA jest nowo rozpoznaną jednostką chorobową, która może wystąpić u pacjentów w każdym wieku i dotyka głównie pacjentki płci żeńskiej1,2. Jest to jedno z najczęściej diagnozowanych zapaleń mózgu wśród pacjentów z początkową nieznaną etiologią zapalenia mózgu3. Pacjenci dotknięci zapaleniem mózgu z receptorem anty-NMDA zwykle mają objawy prodromalne w postaci bólu głowy lub gorączki, po których następuje szybki rozwój zmiany poziomu świadomości i różne ostre objawy neuropsychiatryczne, w tym pobudzenie, drażliwość, lęk, bezsenność, halucynacje, urojenia, agresja, dziwaczne zachowania, nieprawidłowości ruchowe, dysregulacja autonomiczna i napady padaczkowe4,5. Wczesne rozpoznanie tego stanu i terminowe leczenie immunoterapią są ważne dla lepszych wyników, a nawet pełnego wyzdrowienia u pacjentów dotkniętych chorobą6. W związku z tym sugeruje się, że autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA powinno być brane pod uwagę jako ważna diagnostyka różnicowa u pacjentów z ostrymi lub nowo pojawiającymi się cechami psychotycznymi7,8.
Oprócz cech klinicznych, wykrycie autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym jest niezbędne do dokładnej diagnozy autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA9. Większość testów immunologicznych wykrywających autoprzeciwciało przeciwko receptorowi anty-NMDA jest dostępna w kilku laboratoriach badawczych10,11, a na rynku dostępny jest tylko jeden test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do badania przesiewowego autoprzeciwciał receptora anty-NMDA12. Celem tego badania jest opracowanie prostego, wewnętrznego testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach, który może być wygodnie stosowany w laboratorium do badania przesiewowego obecności autoprzeciwciał receptora anty-NMDA, aby ułatwić badania kliniczne autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA. Receptor NMDA jest heterotetramerowym kompleksem białkowym kanałów jonowych, specyficznie wyrażanym w mózgu. Składa się z dwóch obowiązkowych podjednostek NR1 oraz kombinacji jednej lub dwóch podjednostek NR2A, NR2B, NR2C lub NR2D13. Poprzednie badanie wykazało, że główny epitop, w który celowane są przeciwciała, znajdował się w zewnątrzkomórkowej domenie N-końcowej podjednostki NR15. W związku z tym w tym protokole wyrażamy ludzkie rekombinowane białko podjednostkowe NR1 receptora NMDA znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w ludzkiej linii komórek nabłonka nerki embrionalnej (HEK293) i opracowujemy komórkowy test immunofluorescencyjny w celu wykrycia klasy IgG autoprzeciwciał receptora anty-NMDA we krwi.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (znakowany GFP) - Ludzki receptor glutaminianu, jonotropowy, N-metylo-D-asparaginian 1 (GRIN1), wariant transkryptu NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA</td> <td>RG219368</td><td>Klon cDNA NR1 znakowany C-końcowymi sekwencjami tGFP</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA</td> <td>PS100010</td><td>wektor ssaków z C-końcowym znacznikiem tGFP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden, Niemcy)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Obniżona surowica</td><td>Medium Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Charakterystyka płodowej surowicy bydlęcej, pochodzenie z USA</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola pozytywna: receptor antyglutaminianu (typ NMDA)</td><td>Euroimmun AG, L&uuml; beck, Niemcy</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr>Zestaw <td></td><td></td><td></td><td>do oznaczania Euroimmun</td></tr></tbody></table>

prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi n-metylo-d-asparaginianu (nmda) we krwi

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

Obecność autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA może powodować różne objawy neuropsychiatryczne u dotkniętych chorobą, określane jako autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA. Wykrycie swoistego autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA we krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) jest niezbędne do dokładnej diagnozy tego schorzenia. Receptor NMDA jest kompleksem białkowym kanału jonowego, który zawiera cztery podjednostki, w tym dwie obowiązkowe podjednostki receptora NMDA 1 (NR1) i jedną lub dwie podjednostki receptora NMDA 2A (NR2A), podjednostkę receptora NMDA 2B (NR2B), podjednostkę receptora NMDA 2C (NR2C) lub podjednostkę receptora NMDA 2D (NR2D). Doniesiono, że epitop autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA jest obecny w zewnątrzkomórkowej domenie N-końcowej podjednostki NR1 receptora NMDA. Celem tego badania jest opracowanie prostego testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach, który może być stosowany jako test przesiewowy do wykrywania obecności autoprzeciwciał przeciwko podjednostce NR1 receptora NMDA we krwi, aby ułatwić badania kliniczne i podstawowe autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA.

Średnio udało nam się uzyskać 20-300 µg pozbawiony endotoksyn plazmid ekspresyjny NR1-GFP oraz białko GFP z 250 ml kultury bakteryjnej zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 1 protokołu. Do transfekcji komórek HEK293 hodowanych na płytce 48-dołkowej, zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu, zastosowano 10 ng plazmidu ekspresyjnego na dołek. Od 24 do 30 godzin po transfekcji komórki wyeksponowały NR1-GFP, a rekombinowane białka GFP można było wykryć pod mikroskopem fluorescencyjnym. <stron...

Ektopowo wyraziliśmy podjednostkę NR1 receptora NMDA oznaczoną zielonym białkiem fluorescencyjnym w ludzkich komórkach embrionalnych (HEK293) jako antygen do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Ta prosta metoda może być odpowiednia do celów przesiewowych w warunkach klinicznych.

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Ogólnym celem tego testu jest wykrycie autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Zabieg ten pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w diagnostyce różnicowej pacjentów z ostrymi objawami neuropsychiatrycznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i niezawodny środek przesiewowy.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania płytek hodowlanych pokrytych żelatyną. Porcję 200 mikrolitrów 2% roztworu żelatyny do każdego dołka 48-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po 30 minutach odessać roztwór żelatyny z dołków.Wysiewaj w każdym dołku 5 razy 10 do 4 komórek HEK293 w 200 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych, zawierającej 10% FBS. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp zużytą pożywkę hodowlaną w każdym dołku 200 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej, zawierającej 10% FBS.Skalując w górę zgodnie z całkowitą liczbą studzienek w eksperymencie, przygotuj roztwór A, mieszając plazmid NR1-GFP z pożywką hodowlaną. Przygotować roztwór B, mieszając odczynnik do transfekcji z pożywką hodowlaną. Przygotować roztwór C, mieszając roztwór A i roztwór B i inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut.Następnie podwielokrotność 40 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki zawierającej komórki HEK293. Delikatnie zakręć płytką i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla przez noc. Sprawdź ekspresję białka rekombinowanego NR1-GFP w komórkach gospodarza pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem od 40 do 200 razy, przed przystąpieniem do testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach.Aby rozpocząć ten test, najpierw odessaj zużytą pożywkę z dołków płytki hodowlanej, a następnie umyj każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 200 mikrolitrów 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odessać roztwór paraformaldehydu ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS.Następnie dodaj 200 mikrolitrów 10% odtłuszczonego mleka w roztworze PBST do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem przez godzinę. Odessać 10% odtłuszczone mleko w roztworze PBST ze studzienek i umyć studzienki 200 mikrolitrami PBST raz. Inkubować studzienki z osoczem rozcieńczonym w stosunku 1 do 100 w PBST jako przeciwciało pierwszorzędowe, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po godzinie odessać rozcieńczone osocze ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST. Do każdej studzienki dodaj 200 mikrolitrów koziej anty-ludzkiej IgG, sprzężonej z Alexa Fluor 594 i inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez godzinę. Następnie odessać kozę anty-ludzką IgG sprzężoną z roztworem Alexa Fluor 594 i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST.Po trzecim płukaniu PBST dodaj 100 mikrolitrów roztworu glicerolu zawierającego DAPI do każdej studzienki. Obserwuj i obrazuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając odpowiedniego filtra dla każdego barwnika i 10-krotnego okularu z czterokrotnymi, 10 i 20-krotnymi obiektywami. Te reprezentatywne obrazy wykonane od 24 do 30 godzin po transfekcji pokazują komórki HEK293, które wyrażają NR1-GFP.Około 30% komórek miało zielony sygnał pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na odpowiednich obrazach Alexa Fluor 594 czerwony sygnał w panelu B wskazuje na wiązanie autoprzeciwciał receptora anty-NMDA z NR1 ulegającym ekspresji w komórkach HEK293. Słaby czerwony sygnał w panelu E wskazuje szum tła obrazów Alexa Fluor 594.Komórki wykazujące ekspresję NR1-GFP wykorzystano do badania przesiewowego obecności autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA w próbce ludzkiego osocza. Na tych połączonych obrazach żółty kolor wskazuje na kolokalizację autoprzeciwciał receptora NR1-GFP i anty-NMDA. Strzałki wskazują przykłady komórek z wyraźną kolokalizacją.Próbka osocza, która wykazuje większe niż 30% nakładanie się sygnałów zielonych i czerwonych, zostanie w tym przypadku zinterpretowana jako pozytywna. W scalonym obrazie kontroli ujemnej występuje niewielkie nakładanie się sygnałów zielonych i czerwonych, co potwierdza specyficzne wiązanie autoprzeciwciał receptora anty-NMDA z NR1-GFP w teście. Po opanowaniu techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując tej techniki, należy pamiętać, że jest to tylko środek przesiewowy. Po tych procedurach można wykonać inne środki, takie jak analiza western blot i analiza tkankowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak swoistość pozytywnych przypadków. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie psychiatrii do zbadania diagnostyki różnicowej pacjentów z ostrymi stanami zagrożenia zdrowia psychicznego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test w celu wykrycia autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi.

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę identyfikacji przeciwciał przeciwko określonym antygenom w próbce za pomocą hodowli neuronów hipokampa szczura. Poprzez wystawienie hodowanych neuronów na próbki pacjentów zawierające autoprzeciwciała skierowane przeciwko receptorom N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR), obecność autoprzeciwciał związanych z powierzchnią neuronu ujawnia się poprzez barwienie immunologiczne.

Test do wykrywania autoprzeciwciał w surowicy ludzkiej przy użyciu hodowli neuronów hipokampa

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Test komórkowy jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w surowicy. Metoda ta może być stosowana w diagnostyce klinicznej i badaniach naukowych nad zaburzeniami spektrum optycznego zapalenia nerwu i szpiku.

Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu to nowa kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez przeciwciała. Neurony hipokampa mogą być wykorzystane do odkrycia i scharakteryzowania tych przeciwciał. W artykule przedstawiono protokół pierwotnej hodowli komórek i barwienia immunologicznego w celu określenia autoprzeciwciał w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów.

Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Oferujemy metodologię immunocytochemii (ICC) krok po kroku do wykrywania anty-MDA5. Podejście to obejmuje utrwalanie komórek, permeabilizację, inkubację przeciwciał oraz techniki obrazowania, które pozwalają na dokładne wykrywanie autoprzeciwciał przeciw MDA5, wspomagając diagnozę szybko postępującej śródmiąższowej choroby płuc u pacjentów z zapaleniem mięśnia.

Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Poznaj prostą metodę immunofluorescencyjną opartą na komórkach HEK293 do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu.

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi (Wideo) | JoVE Journal

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Przeglądaj więcej filmów