Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Ogólnym celem tego testu jest wykrycie autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Zabieg ten pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w diagnostyce różnicowej pacjentów z ostrymi objawami neuropsychiatrycznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i niezawodny środek przesiewowy.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania płytek hodowlanych pokrytych żelatyną. Porcję 200 mikrolitrów 2% roztworu żelatyny do każdego dołka 48-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po 30 minutach odessać roztwór żelatyny z dołków.

Wysiewaj w każdym dołku 5 razy 10 do 4 komórek HEK293 w 200 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych, zawierającej 10% FBS. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp zużytą pożywkę hodowlaną w każdym dołku 200 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej, zawierającej 10% FBS.

Skalując w górę zgodnie z całkowitą liczbą studzienek w eksperymencie, przygotuj roztwór A, mieszając plazmid NR1-GFP z pożywką hodowlaną. Przygotować roztwór B, mieszając odczynnik do transfekcji z pożywką hodowlaną. Przygotować roztwór C, mieszając roztwór A i roztwór B i inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut.

Następnie podwielokrotność 40 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki zawierającej komórki HEK293. Delikatnie zakręć płytką i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% dwutlenkiem węgla przez noc. Sprawdź ekspresję białka rekombinowanego NR1-GFP w komórkach gospodarza pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem od 40 do 200 razy, przed przystąpieniem do testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach.

Aby rozpocząć ten test, najpierw odessaj zużytą pożywkę z dołków płytki hodowlanej, a następnie umyj każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 200 mikrolitrów 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odessać roztwór paraformaldehydu ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów 10% odtłuszczonego mleka w roztworze PBST do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem przez godzinę. Odessać 10% odtłuszczone mleko w roztworze PBST ze studzienek i umyć studzienki 200 mikrolitrami PBST raz. Inkubować studzienki z osoczem rozcieńczonym w stosunku 1 do 100 w PBST jako przeciwciało pierwszorzędowe, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po godzinie odessać rozcieńczone osocze ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST. Do każdej studzienki dodaj 200 mikrolitrów koziej anty-ludzkiej IgG, sprzężonej z Alexa Fluor 594 i inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez godzinę. Następnie odessać kozę anty-ludzką IgG sprzężoną z roztworem Alexa Fluor 594 i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST.

Po trzecim płukaniu PBST dodaj 100 mikrolitrów roztworu glicerolu zawierającego DAPI do każdej studzienki. Obserwuj i obrazuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając odpowiedniego filtra dla każdego barwnika i 10-krotnego okularu z czterokrotnymi, 10 i 20-krotnymi obiektywami. Te reprezentatywne obrazy wykonane od 24 do 30 godzin po transfekcji pokazują komórki HEK293, które wyrażają NR1-GFP.

Około 30% komórek miało zielony sygnał pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na odpowiednich obrazach Alexa Fluor 594 czerwony sygnał w panelu B wskazuje na wiązanie autoprzeciwciał receptora anty-NMDA z NR1 ulegającym ekspresji w komórkach HEK293. Słaby czerwony sygnał w panelu E wskazuje szum tła obrazów Alexa Fluor 594.

Komórki wykazujące ekspresję NR1-GFP wykorzystano do badania przesiewowego obecności autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA w próbce ludzkiego osocza. Na tych połączonych obrazach żółty kolor wskazuje na kolokalizację autoprzeciwciał receptora NR1-GFP i anty-NMDA. Strzałki wskazują przykłady komórek z wyraźną kolokalizacją.

Próbka osocza, która wykazuje większe niż 30% nakładanie się sygnałów zielonych i czerwonych, zostanie w tym przypadku zinterpretowana jako pozytywna. W scalonym obrazie kontroli ujemnej występuje niewielkie nakładanie się sygnałów zielonych i czerwonych, co potwierdza specyficzne wiązanie autoprzeciwciał receptora anty-NMDA z NR1-GFP w teście. Po opanowaniu techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując tej techniki, należy pamiętać, że jest to tylko środek przesiewowy. Po tych procedurach można wykonać inne środki, takie jak analiza western blot i analiza tkankowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak swoistość pozytywnych przypadków. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie psychiatrii do zbadania diagnostyki różnicowej pacjentów z ostrymi stanami zagrożenia zdrowia psychicznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test w celu wykrycia autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi.