Name: In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę oceny rozwoju kalusa złamania u myszy za pomocą MRI z wykorzystaniem zewnętrznego stabilizatora. Technika umożliwia długoterminowe, nieinwazyjne monitorowanie gojenia kości w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verenie Fischer, Katji Prystaz, Yvonne Hägele i Anne Subgang za doskonałe wsparcie techniczne. Dziękujemy również Niemieckiej Fundacji Badawczej (CRC1149, INST40/499-1) oraz Niemieckiej Fundacji AO Trauma za sfinansowanie tego badania.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z międzynarodowymi przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez regionalne organy regulacyjne (nr 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Niemcy). Wszystkie myszy utrzymywano w grupach od dwóch do pięciu zwierząt w klatce w 14-godzinnym jasnym, 10-godzinnym ciemnym rytmie okołodobowym z wodą i jedzeniem dostarczanym ad libitum.
1. Przygotowanie materiału chirurgicznego i wstępne leczenie myszy
<ol>
	<li>Wysterylizuj cały materiał chirurgiczny. Stosować w autoklawie o temperaturze 120-135 °C przez 20-30 minut sterylizacji.</li>
	<li>Kup myszy C57BL/6 lub myszy z innego szczepu, które mają od 19 do 35 g masy ciała. Postępuj zgodnie z odpowiednimi protokołami opieki nad zwierzętami i protokołami eksperymentalnymi zgodnie z krajowymi wytycznymi, które zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt. Przed rozpoczęciem zabiegu należy odczekać co najmniej 7 dni na okres aklimatyzacji.</li>
	<li>Zapewnij znieczulenie wszystkim myszom za pośrednictwem wody pitnej na jeden dzień przed zabiegiem do trzeciego dnia po operacji.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny i zastosowanie stabilizatora zewnętrznego
<ol>
	<li>Umieść mysz w probówce z fabrycznie załadowanym 5-7% izofluranem i 60 ml/min tlenu. Po utracie odruchów posturalnych wyjmij mysz z rurki indukcyjnej znieczulenia i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski inhalacyjnej dostarczającej 1-3% izofluranu i 60 ml/min tlenu.
	<ol>
		<li>Monitoruj wzorzec oddychania i odruch tylnej łapy podczas znieczulenia. Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około 100 cykli/min, a odruch tylnej łapy jest nieobecny. 
		UWAGA: Ilość potrzebnego gazu zależy od wieku, płci, masy ciała i wysiłku myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed zabiegiem chirurgicznym należy wstrzyknąć myszowi pojedynczą dawkę antybiotyków podskórnie (klindamycyna, 45 mg/kg). Ponadto, w celu utrzymania fizjologicznej równowagi płynów, wstrzyknij myszowi podskórny magazyn płynów w postaci 500 μl soli fizjologicznej (0,9% NaCl).</li>
	<li>Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, nałóż maść do oczu myszy. Podczas znieczulenia i zabiegu chirurgicznego umieść mysz na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, aby utrzymać fizjologiczną temperaturę ciała.</li>
	<li>Usuń sierść z prawej tylnej kończyny i wyszoruj obszar operacyjny środkiem dezynfekującym na bazie alkoholu. Zakryj prawą tylną łapę niewielką częścią sterylnej rękawicy, aby uniknąć niesterylnych obszarów. Zdezynfekuj prawą tylną kończynę trzy razy. Umieść sterylną serwetkę na całej myszy z wyjątkiem obszaru operacyjnego.</li>
	<li>Naciąć skórę na około 1 cm wzdłużnie wzdłuż przedniej strony prawej kości udowej za pomocą skalpela. Oddziel tępo m. mięsień dwugłowy udowy i m. obszerny boczny za pomocą mikronożyczek i kleszczy. Przeciąć stronę początkową ścięgna przy krętarzu kości udowej za pomocą mikronożyczek, aby umożliwić swobodny dostęp do przednio-bocznej części kości. Upewnij się, że nerw kulszowy jest zachowany.</li>
	<li>Ustaw stabilizator zewnętrzny (sztywność osiowa 3 N/mm, <klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1A) równolegle do kości udowej. Ręcznie wywierć otwory przez korę za pomocą wiertła 0,45 mm i umieść ceramiczne kołki montażowe w otworach. Zacznij od najbardziej proksymalnego szpilki, następnie najbardziej dystalnej szpilki i dwóch szpilek pomiędzy.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że podczas procedury montażu na stabilizatorze nie ma naprężeń rozciągających, ściskających ani ścinających, w przeciwnym razie uzyskana szczelina osteotomijna nie będzie wystarczająca ze względu na rozluźnienie stabilizatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawilż kość niewielką ilością sterylnego NaCl, aby uniknąć odwodnienia podczas zabiegu piłowania.</li>
	<li>Wykonać osteotomię o średnicy 0,4 mm przez całą kość między dwoma wewnętrznymi szpilkami za pomocą piły drucianej gigli 0,4 mm. 
	UWAGA: Opcjonalnie do wykonania osteotomii można użyć oscylacyjnej mikropiły. Upewnij się, że nie ma żadnych metalowych wiórów z piły w obszarze osteotomii.</li>
	<li>Ostrożnie przepłucz szczelinę osteotomii 2 ml sterylnego NaCl, aby usunąć wióry kostne między dwiema złamanymi korami.</li>
	<li>Dostosuj mięśnie, stosując szew ciągły z szwem wchłanialnym (patrz Tabela materiałów). Następnie dostosuj skórę za pomocą przerywanych, niewchłanialnych szwów (patrz Tabela materiałów). Aby uniknąć gryzienia rany, nie należy zakładać szwu w części czaszkowej rany. 
	UWAGA: Nie używaj kleju do skóry ani klipsów, ponieważ myszy zwykle usuwają je z rany, powodując dalsze uszkodzenia skóry.</li>
	<li>Oczyść obszar operacyjny środkiem dezynfekującym i umieść mysz w klatce. Monitoruj mysz i dostarczaj wystarczającą ilość ciepła (np. za pomocą światła podczerwonego), aż całkowicie się obudzi. Monitoruj wodę, spożycie pokarmu i masę ciała po operacji, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu i stresu. Wszystkim myszom należy zapewnić środek przeciwbólowy za pośrednictwem wody pitnej do trzeciego dnia po operacji. 
	UWAGA: Myszy mogą być trzymane w grupach do czterech zwierząt.</li>
	<li>Monitoruj aktywność myszy w dniach od 1 do 5 po zabiegu. W tym czasie mysz powinna przenosić ciężar na operowaną kończynę. W przeciwnym razie mysz musi zostać wykluczona z dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Procedura MRI i analiza obrazu
<ol>
	<li>Przed procedurą rezonansu magnetycznego znieczulij mysz zgodnie z protokołem w krokach 2.1 i 2.3 i utrzymuj częstość oddechów na poziomie około 100 cykli/min. Ostrożnie włóż zewnętrzny stabilizator na prawej tylnej kończynie myszy do specjalnie przygotowanego urządzenia montażowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że na tym etapie nie zgina ani nie ściskasz stabilizatora, ponieważ może to zakłócić gojenie się złamań. 
		Uwaga: Skany MRI można przeprowadzić już 3 dni po zabiegu, w zależności od opieki nad zwierzętami i protokołu eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz na podstawce o kontrolowanej temperaturze w celu wprowadzenia do urządzenia do rezonansu magnetycznego. Przymocuj urządzenie montażowe sztywno do czteroelementowej cewki głowicy.</li>
	<li>Pozyskiwanie danych MRI za pomocą dedykowanego systemu MRI dla małych zwierząt o wysokim polu działającego na poziomie 11,7 T. 
	UWAGA: Geometria akwizycji danych MRI jest wyrównana z kością udową, prostopadle do.
	<ol>
		<li>Pozyskaj dane, stosując wielorzędową sekwencję TSE O STŁUMIONEJ GĘSTOŚCI PROTONÓW (PD-TSE) przy użyciu parametrów akwizycji: czas echa/powtarzania TE = 5,8 ms/TR = 2 500 ms, rozdzielczość Δr = 52 × 52 × 350 μm³, pole widzenia (FOV) = 20 × 20 mm² i szerokość pasma Δω = 150 KHz.</li>
		<li>UWAGA: Całkowity czas akwizycji dla 22 plasterków wynosi 36 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz pozyskane dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Wprowadź rozmiar woksela jako 0,05 x 0,05 x 0,35 mm3. Podziel na segmenty różne tkanki w kalusie złamania (kość, chrząstka, tkanka włóknista/szpik kostny) na podstawie ich intensywności z półautomatycznym progowaniem w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Kliknij "Edytuj nowe pole etykiety", kliknij "Dodaj materiał" i zmień nazwę materiału na "kalus". Odróżnij obszar kalusa od otaczających tkanek na podstawie hipointensywnego sygnału z okostnej za pomocą narzędzia "Lasso".</li>
		<li>Kliknij "dodaj do materiału". Kliknij "Dodaj materiał" i zmień nazwę materiału na "chrząstka". Podziel chrząstkę na segmenty za pomocą narzędzia "próg" i "Wybierz tylko bieżący materiał" z "kalusa". Kliknij "chrząstka" i "dodaj do materiału". Powtórz te kroki z "kością" i "szpikiem kostnym/tkanką włóknistą".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj rekonstrukcje 3D złamanych kości udowych na podstawie danych segmentacji tkanek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Kliknij "Generuj powierzchnię", zastosuj "Brak" dla "Typu wygładzania" i kliknij "Widok powierzchni". 
	UWAGA: Bardzo małe, nadmiernie intensywne obszary otaczające końce złamanej kory mózgowej mogą być artefaktami spowodowanymi przejściem od tkanki kostnej do miękkiej. Obszary te powinny zostać wyłączone z dalszej analizy. Nadmiernie intensywne obszary w środku modzela złamania podczas śródchrzęstnej fazy gojenia się złamania reprezentują tkankę chrzęstną. Hipointensywne obszary na złamaniu modzel dystalny od szczeliny osteotomii w fazie kostnienia śródchrzęstnego oraz obszary o tej samej intensywności na całej długości złamania modzela na późniejszych etapach gojenia reprezentują nowo powstałą tkankę modzela kostnego. Chociaż obszary te mają sygnał hipointensywny, intensywność sygnału z dojrzałej kości (kory) jest jeszcze niższa. Po progowaniu intensywności sygnału dla tkanki kostnej i tkanki chrzęstnej w kalusie złamania, należy oznaczyć pozostałą tkankę jako szpik kostny i tkankę włóknistą. Wartości segmentacji tkanek to: tkanka kostna (w tym dojrzała kora, kość beleczkowa i tkanka kalusa kostnego) jest segmentowana w zakresie 1-3,3 (znormalizowane natężenie sygnału do dojrzałej kory), szpik kostny/tkanka włóknista w zakresie 3,4-5,4 i chrzęstna tkanka kalusa w zakresie 5,5-6,2.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz badanie MRI wzdłużnie podczas procesu gojenia się złamania. Aby monitorować rozwój modzela chrzęstnego, skanuj myszy w 10, 14 i 21 dniu po operacji. 
	UWAGA: Punkty czasowe mogą zależeć od opieki nad zwierzętami i protokołu eksperymentalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing+under+healthy+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Fracture healing under healthy and inflammatory conditions.</a> Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).</li>
<li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+and+molecular+biology+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">The cell and molecular biology of fracture healing.</a> Clin Orthop Relat Res. (355), Suppl S7-S21 (1998).</li>
<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Augat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+properties+in+bone+healing%3A+influence+of+size+and+stability+of+the+osteotomy+gap%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Local tissue properties in bone healing: influence of size and stability of the osteotomy gap.</a> J Orthop Res. 16 (4), 475-481 (1998).</li>
<li>Claes, L. E., Heigele, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitudes+of+local+stress+and+strain+along+bony+surfaces+predict+the+course+and+type+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Magnitudes of local stress and strain along bony surfaces predict the course and type of fracture healing.</a> J Biomech. 32 (3), 255-266 (1999).</li>
<li>Claes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+factors+on+the+fracture+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical factors on the fracture healing process.</a> Clin Orthop Relat Res. (355), Suppl 132-147 (1998).</li>
<li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development. 144 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Hankenson, K. D., Zimmerman, G., Marcucio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+perspectives+of+delayed+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Biological perspectives of delayed fracture healing.</a> Injury. 45, Suppl 2 8-15 (2014).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+ovariectomy+impair+both+the+normalization+of+mechanical+properties+and+the+accretion+of+mineral+by+the+fracture+callus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Age and ovariectomy impair both the normalization of mechanical properties and the accretion of mineral by the fracture callus in rats.</a> J Orthop Res. 19 (3), 428-435 (2001).</li>
<li>Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+osteoporosis+in+femoral+fracture+healing+time%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time.</a> Injury. 40 (6), 663-668 (2009).</li>
<li>Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40610-016-0037-3">Mouse Models in Bone Fracture Healing Research.</a> Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-14 (2013).</li>
<li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+bone+healing+models%3A+standards%2C+tips%2C+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49 (4), 591-599 (2011).</li>
<li>Zachos, T. A., Bertone, A. L., Wassenaar, P. A., Weisbrode, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+the+study+of+articular+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Rodent models for the study of articular fracture healing.</a> J Invest Surg. 20 (2), 87-95 (2007).</li>
<li>Taha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+MRI+for+detection+of+changes+in+bone+morphology+in+a+mouse+model+of+bone+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of MRI for detection of changes in bone morphology in a mouse model of bone injury.</a> J Magn Reson Imaging. 38 (1), 231-237 (2013).</li>
<li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+high-resolution+In+Vivo+MRI+for+longitudinal+analysis+of+endochondral+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of high-resolution In Vivo MRI for longitudinal analysis of endochondral fracture healing in mice.</a> PLoS One. 12 (3), 0174283(2017).</li>
<li>Beckmann, N., Falk, R., Zurbrugg, S., Dawson, J., Engelhardt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+infiltration+into+the+rat+knee+detected+by+MRI+in+a+model+of+antigen-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Macrophage infiltration into the rat knee detected by MRI in a model of antigen-induced arthritis.</a> Magn Reson Med. 49 (6), 1047-1055 (2003).</li>
<li>Al Faraj,, Shaik A, S. ultana, Pureza, A., A, M., Alnafea, M., Halwani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+macrophage+recruitment+and+polarization+in+LPS-induced+animal+model+for+COPD%3A+noninvasive+tracking+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preferential macrophage recruitment and polarization in LPS-induced animal model for COPD: noninvasive tracking using MRI.</a> PLoS One. 9 (3), 90829(2014).</li>
<li>Rolle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImmunoPET%2FMR+imaging+allows+specific+detection+of+Aspergillus+fumigatus+lung+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ImmunoPET/MR imaging allows specific detection of Aspergillus fumigatus lung infection in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 1026-1033 (2016).</li>
<li>Niemeyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+tracking+of+human+haemopoietic+CD34%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+in+immunodeficient+mice+by+using+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive tracking of human haemopoietic CD34(+) stem cells in vivo in immunodeficient mice by using magnetic resonance imaging.</a> Eur Radiol. 20 (9), 2184-2193 (2010).</li>
</ol>

Autor Romano Matthys jest pracownikiem firmy RISystem AG Davos w Szwajcarii, która produkuje implanty i instrumenty specyficzne dla implantów użyte w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Głównym celem tego badania było opisanie protokołu stosowania stabilizatora zewnętrznego zgodnego z MRI do osteotomii kości udowej u myszy z możliwością wzdłużnego monitorowania rozwoju tkanki kalusa podczas procesu gojenia złamań śródchrzęstnych. Konstrukcja wykonanego na zamówienie urządzenia montażowego do wkładania zewnętrznego stabilizatora zapewniła ustandaryzowaną pozycję podczas wielokrotnych skanów. Półautomatyczna segmentacja tk...

Wtórne gojenie złamań jest najczęstszą formą gojenia kości. Jest to złożony proces naśladujący określone aspekty ontogennego kostnienia śródchrzęstnego1,2,3. Krwiak wczesnego złamania składa się głównie z komórek odpornościowych, ziarniny i tkanki włóknistej. Niskie ciśnienie tlenu i wysokie obciążenia biomechaniczne utrudniają różnicowanie osteoblastów w szczelinie złamania, ale sprzyjają różnicowaniu komórek progenitorowych w chondrocyty4,5,6. Komórki te zaczynają się namnażać w miejscu urazu, tworząc macierz chrzęstną zapewniającą początkową stabilność złamanej kości. Podczas dojrzewania kalusa chondrocyty stają się przerostowe, ulegają apoptozie lub różnicują się w osteoblasty. Neowaskularyzacja w strefie przejściowej między chrząstką a kością zapewnia podwyższony poziom tlenu, umożliwiając tworzenie tkanki kostnej7. Po kostnym zmostkowaniu szczeliny złamania zwiększa się stabilność biomechaniczna i następuje osteoklastyczna przebudowa zewnętrznego kalusa złamania w celu uzyskania fizjologicznego konturu i struktury kości3. Dlatego ilość tkanki włóknistej, chrzęstnej i kostnej w kalusie złamania dostarcza ważnych informacji na temat procesu gojenia się kości. Zaburzenia lub opóźnione gojenie stają się widoczne w wyniku zmian w rozwoju tkanki kalusa zarówno u ludzi, jak i u myszy8,9,10,11. Dostępne techniki in vivo do wzdłużnego monitorowania rozwoju tkanki kalusa w przedklinicznych badaniach gojenia złamań z wykorzystaniem małych zwierząt, obejmują radiografię cyfrową i obrazowanie μCT12,13. Jednak obie techniki są w stanie rozróżnić tylko tkankę zmineralizowaną i niezmineralizowaną. W przeciwieństwie do tego, MRI zapewnia doskonały kontrast tkanek miękkich i dlatego może być w stanie zidentyfikować tkankę miękką i chrząstkę w złamaniu modzela.
Poprzednie prace wykazały obiecujące wyniki dla pośmiertnego rezonansu magnetycznego u myszy ze złamaniami stawów14 oraz rezonansu magnetycznego in vivo u myszy podczas wewnątrzbłoniastego gojenia się ubytków kostnych15. Jednak oba badania wykazały również ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i kontrast tkankowy. Wcześniej wykazaliśmy wykonalność rezonansu magnetycznego in vivo o wysokiej rozdzielczości do podłużnej oceny powstawania miękkiego kalusa podczas gojenia się złamań śródchrzęstnych u myszy 16. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z MRI do osteotomii kości udowej u myszy w celu monitorowania podłużnego rozwoju tkanki kalusa podczas procesu gojenia złamań śródchrzęstnych. Konstrukcja wykonanego na zamówienie urządzenia montażowego do wkładania zewnętrznego stabilizatora zapewniła ustandaryzowaną pozycję podczas wielokrotnych skanów.

<table><tbody><tr><td>Rurka anestezjologiczna</td><td>FMI, Seeheim, Niemcy</td><td>ZUA-82-ANA-TUB-Mysz Maszyna</td><td></td></tr><tr><td>anestezjologiczna&nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Niemcy</td><td>ZUA-82-GME-MA</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze tętnicze&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>Autoklaw BH104R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Systec, Wettenberg, Niemcy</td><td>DX-150</td><td></td></tr><tr><td>Opakowanie do autoklawowania</td><td>Stericlin, Feuchtwangen, Niemcy</td><td>2301-04/06/10/12/16</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Avizo</td><td>FEI, Burlington, USA-Wersja</td><td></td> <td>8.0.1</td></tr><tr><td>System obrazowania rezonansu magnetycznego BioSpec 117/16</td><td>Bruker Biospin, Ettlingen, Niemcy</td><td>117/16</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Bulldog&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BH 021R</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel ze stali węglowej nr 11/15</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BA211/215</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny trzpień montażowy 0,45 mm&nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Szwajcaria</td><td>HS691490</td><td></td></tr><tr><td>Klindamycyna (300 mg / 2ml)</td><td>Ratiopharm, Ulm,</td> <td>Niemcy-Kleszcze</td><td></td></tr> <tr><td>opatrunkowe 115 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BD210R</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe 130 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BD025R</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło z powłoką 0,45 mm&nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Szwajcaria</td><td>HS820420</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę Durogrip 125 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BM024R</td><td></td></tr><tr><td>Foliodrape&nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Niemcy</td><td>2513026</td><td></td></tr><tr><td>Frekaderm</td><td>Fresenius, Bad Homburg, Niemcy</td><td>4928211</td><td></td></tr><tr><td>Piła Gigli 0,44 mm&nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Szwajcaria</td><td>RIS.590.110.25</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka ręczna</td><td>RISystem, Davos, Szwajcaria</td><td>RIS.390.130-01</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza&nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Niemcy</td><td>Rękawice IOW-3704</td><td></td></tr><tr><td>Hygonorm&nbsp;</td><td>Hygi, Telgte, Niemcy</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot, Londyn, Wielka Brytania</td><td>Kleszczyki Micro Forene</td><td></td></tr><tr><td>155 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki 120 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>FD013R</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FixEx L 0,7 mm&nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Szwajcaria</td><td>RIS.611.300-10</td><td></td></tr><tr><td>Etui na igły do wierteł&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BL911R</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BB078R</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&uuml; lke, Norderstedt, Niemcy</td><td>121403</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Osirix</td><td>Pixmeo SARL, Bernex, Szwajcaria</td> <td>-</td> <td>wersja 4.0</td></tr><tr><td>Tlen, klasa medyczna</td><td>MTI, Ulm, Niemcy</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Resolon 5/0</td><td>Resorba, N&uuml; rnberg, Niemcy</td><td>88143</td><td></td></tr><tr><td>Saline 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Trzonek skalpela 125 mm</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki 150 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BC006R</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka do opakowań autoklawowych&nbsp;</td><td>Hawo GmbH, Obrigheim, Niemcy</td><td>HM500</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 27 g&nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza chirurgiczne nr 11/15&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BB511/515</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne&nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Niemcy</td><td>Peha-mikron 9425712</td><td></td></tr><tr><td>Światło chirurgiczne&nbsp;</td><td>Maquet SA, Ardon, Francja</td><td>Niebieska linia 80</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 5 ml&nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>Injekt 4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek 80 mm&nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Niemcy</td><td>OC091R</td><td></td></tr><tr><td>Tramadol 25 mg/l</td><td>Gr&uuml; nenthal, Akwizgran, Niemcy</td><td>100mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Vasofix Bezpieczeństwo&nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4268113S-01</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0&nbsp;</td><td>Ethicon, Norderstedt, Niemcy</td><td>V30371</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu Visdisic&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb, Berlin, Niemcy</td><td>3099559</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z mri dla kości udowej myszy

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Gojenie złamań śródchrzęstnych to złożony proces obejmujący rozwój tkanki włóknistej, chrzęstnej i kostnej w modzelu złamania. Ilość różnych tkanek w kalusie dostarcza ważnych informacji na temat postępu gojenia się złamań. Dostępne techniki in vivo do podłużnego monitorowania rozwoju tkanki kalusa w przedklinicznych badaniach gojenia złamań na małych zwierzętach obejmują radiografię cyfrową i obrazowanie μCT. Jednak obie techniki są w stanie rozróżnić tylko tkankę zmineralizowaną i niezmineralizowaną. W związku z tym niemożliwe jest odróżnienie chrząstki od tkanki włóknistej. Natomiast obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) wizualizuje struktury anatomiczne na podstawie ich zawartości wody i dlatego może być w stanie nieinwazyjnie zidentyfikować tkanki miękkie i chrząstki w złamaniu modzelowatego. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy, aby umożliwić skany MRI podczas regeneracji kości u myszy. Eksperymenty wykazały, że stabilizator i wykonane na zamówienie urządzenie montażowe umożliwiają powtarzalne skany MRI, umożliwiając w ten sposób podłużną analizę rozwoju tkanki złamania i kalusa.

W pierwszej kolejności sukces procedury chirurgicznej można potwierdzić analizą obrazów MRI (patrz przykład na Rysunku 2). Wszystkie cztery piny powinny znajdować się w połowie trzonu kości udowej. Wielkość szczeliny osteotomii powinna wynosić od 0,3-0,5 mm. Jeśli wielkość szczeliny osteotomii znacznie odbiega od tych wartości, mysz należy wykluczyć z dalszej analizy.
Po drugie, ocena skanów podłużn...

Ocena rozwoju tkanki w złamaniu modzeli podczas gojenia kości śródchrzęstnej jest niezbędna do monitorowania procesu gojenia. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z rezonansem magnetycznym (MRI) dla kości udowej myszy, aby umożliwić skany MRI podczas regeneracji kości u myszy.

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Ogólnym celem tej techniki jest wykorzystanie rezonansu magnetycznego (MRI) do podłużnej oceny rozwoju modzela po złamaniu myszy podczas gojenia kości. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia kości, takie jak to, jak modzele złamań rozwijają się z czasem w różnych modelach mysich. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że rozwój modzela złamania może być monitorowany in vivo w czasie rzeczywistym oraz to, że zastosowany stabilizator zewnętrzny zapewnia wysoce ustandaryzowany model gojenia złamań.Procedurę rezonansu magnetycznego zademonstruje Anne Subgang, technik z ośrodka Small Animal Imaging Core. Przed rozpoczęciem zabiegu należy potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i wstrzyknąć mysz podskórnie pojedynczą dawkę antybiotyków w magazynie płynów dwa razy 250 mikrolitrów 0,9% chlorku sodu. Nałóż maść na oczy zwierzęcia i umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Usuń sierść z prawej tylnej kończyny i wyszoruj obszar operacyjny środkiem dezynfekującym na bazie alkoholu. Umieść sterylną serwetę na zwierzęciu, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne, i przykryj prawą tylną łapę małym kawałkiem sterylnej rękawicy. Wyszoruj obszar operacyjny jeszcze trzy razy środkiem dezynfekującym.Następnie, za pomocą wysterylizowanego w autoklawie skalpela, wykonaj około jednocentymetrowe podłużne nacięcie skóry wzdłuż wewnętrznej strony prawej kości udowej i za pomocą mikronożyczek i kleszczy tępo oddziel mięśnie dwugłowe uda i obszerne boczne. Przeciąć przyczep ścięgna na krętarzu kości udowej, aby umożliwić swobodny dostęp do przednio-bocznej części kości, uważając, aby nerw kulszowy został zachowany, i ustaw zewnętrzny stabilizator równolegle do kości udowej. Za pomocą wiertła 0,45 milimetra ręcznie wywierć otwory przez korę mózgową.Zaczynając od najbardziej proksymalnych i dystalnych końców, umieść w otworach ceramiczne kołki montażowe. Po umieszczeniu wszystkich szpilek nawilż kość niewielką ilością sterylnej soli fizjologicznej i użyj 0,4-milimetrowej piły drucianej Gigli, aby wykonać osteotomię o średnicy 0,4 milimetra przez kość otworu między dwoma wewnętrznymi szpilkami. Ostrożnie przepłucz szczelinę osteotomii dwoma mililitrami sterylnej soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie wióry kostne spomiędzy dwóch złamanych korów i użyj ciągłego wchłanialnego szwu w celu dostosowania mięśni, a następnie adaptacji skóry za pomocą przerwanych szwów niewchłanialnych.Następnie oczyść obszar operacyjny środkiem dezynfekującym i umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Już trzy dni po operacji ostrożnie włóż stabilizator zewnętrzny do specjalnie przygotowanego urządzenia montażowego i umieść znieczuloną mysz na podstawce o kontrolowanej temperaturze w celu wprowadzenia do urządzenia do rezonansu magnetycznego. Sztywno przymocuj zewnętrzny stabilizator do urządzenia montażowego na czteroelementowej cewce głowicy i użyj dedykowanego systemu MRI dla małych zwierząt o wysokim polu, działającego pod ciśnieniem 11,7 tesli, aby zastosować do pęknięcia wielowarstwową sekwencję echa turbospinowego o stłumionej gęstości protonów, tłumionej tłuszczem.Po uzyskaniu wszystkich obrazów otwórz dane w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i wprowadź rozmiar woksela jako 0,05 na 0,05 na 0,35 milimetra sześciennego. Aby podzielić różne tkanki w kalusie złamania z półautomatycznym progowaniem na podstawie ich intensywności, najpierw kliknij pole edycji nowej etykiety, a następnie kliknij Dodaj materiał. Zmień nazwę materiału na kalus i użyj narzędzia lasso, aby odróżnić obszar kalusa od otaczających tkanek na podstawie hipointensywnego sygnału z okostnej.Kliknij Dodaj do materiału, a następnie kliknij Dodaj materiał i zmień nazwę materiału na chrząstka. Za pomocą narzędzia progowego podziel chrząstkę na segmenty i wybierz tylko bieżący materiał z kalusa. Następnie kliknij chrząstkę i Dodaj do materiału.Gdy wszystkie tkanki zostaną podzielone na segmenty, kliknij opcję Generuj powierzchnię, zastosuj Brak dla typu wygładzania i kliknij opcję Widok powierzchni, aby wygenerować rekonstrukcje 3D złamanych kości udowych na podstawie danych segmentacji tkanek. Udany zabieg chirurgiczny można potwierdzić za pomocą rezonansu magnetycznego złamania, na którym widoczne są wszystkie cztery szpilki w środku trzonu kości udowej z przerwą osteotomijną między 0,3 a 0,5 milimetra. W 10 dniu po operacji ocena skanów podłużnych podczas procesu gojenia złamania ujawnia tkankę chrzęstną w środku złamania modzel i tkankę kostną na obrzeżach złamania.Zarówno tkanki chrzęstne, jak i kostne powiększają się do 14 dnia. Tkanka chrzęstna zmniejsza się następnie do 21 dnia, kiedy to można zaobserwować mostkowanie kostne. Po segmentacji różnych tkanek w złamaniu kalusa, jak właśnie pokazano, można wygenerować cały skan 3D kości udowej z dojrzałą korą wyglądającą na szaro, ceramicznymi szpilkami zaznaczonymi na żółto, tkanką miękką kalusa na zielono, tkanką chrzęstną na czerwono i tkanką kostną modzela oznaczoną na fioletowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować zewnętrzny stabilizator do kości udowej myszy, aby utworzyć osteotomię kości udowej i wprowadzić mysz do urządzenia MRI, aby zapewnić ustandaryzowaną pozycję skanowania. Po opanowaniu, aplikacja zewnętrznego stabilizatora i technika osteotomii mogą zostać zakończone w ciągu 20 do 30 minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

in-vivo-evaluation-fracture-callus-development-during-bone-healing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Ten protokół opisuje technikę osteosyntezy wykorzystującą gwóźdź blokujący śródszpikowy do standaryzacji osteotomii kości udowej, która może być używana do analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy.

Śródszpikowy gwóźdź blokujący do standaryzowanego mocowania osteotomii kości udowej w celu analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Ten protokół opisuje metodę wykonywania złamań u dorosłych myszy i monitorowania procesu gojenia.

Złamanie poprzeczne kości udowej myszy ze sworzniem stabilizującym

Mikrotomografia komputerowa (μCT) jest nieniszczącym narzędziem do obrazowania, które jest instrumentalne w ocenie struktury kości w badaniach przedklinicznych, jednak nie ma zgody co do procedur μCT do analizy modzeli gojącej się kości. Badanie to zapewnia krok po kroku protokół μCT, który umożliwia monitorowanie gojenia się złamań.

Ocena gojenia złamań kości za pomocą mikrotomografii komputerowej

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Poznaj metodę oceny rozwoju kalusa złamania u myszy za pomocą MRI z wykorzystaniem zewnętrznego stabilizatora. Technika umożliwia długoterminowe, nieinwazyjne monitorowanie gojenia kości w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy

Przeglądaj więcej filmów