Name: Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metody badania wpływu otyłości na strukturę i czynność płuc u myszy, w tym test tolerancji glukozy, pletyzmografię i zespolenie płuc. Techniki te umożliwiają ocenę roli metabolizmu w patogenezie przewlekłych chorób płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty były wspierane przez Marga and Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Niemcy; Projekt 210-02-16 (MAAA), Projekt 210-03-15 (MAAA) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Niemcy; Centrum Medycyny Molekularnej w Kolonii (CMMC; Szpital Uniwersytecki w Kolonii; Program Awansu Zawodowego; MAAA), Köln Fortune (Wydział Lekarski, Uniwersytet w Kolonii; KD).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez lokalne władze rządowe (Land NRW, AZ: 2012.A424) i były zgodne z niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt oraz przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt wykorzystywanych do eksperymentów lub do innych celów naukowych. Ponieważ analiza czynności płuc może wpływać na strukturę płuc, a tym samym na późniejsze analizy histologiczne, pomiar Res i Cdyn oraz przygotowanie i utrwalenie płuca do histomorfometrii powinny być wykonywane u różnych zwierząt. Możliwy jest jednak pomiar Res i Cdyn zgodnie z ipGTT. Ponieważ stres podczas ipGTT może zakłócać znieczulenie potrzebne do testów czynnościowych płuc, zaleca się okres rekonwalescencji wynoszący około 2 tygodnie po ipGTT, aby umożliwić myszom powrót do zdrowia po utracie masy ciała i zmianach parametrów krwi12.
1. Przygotowanie do dootrzewnowego testu tolerancji glukozy (ipGTT)
UWAGA: Po 12 godzinach postu, pełne ipGTT trwa około 2 godzin.
<ol>
	<li>Ponieważ stres znacząco wpływa na poziom glukozy we krwi, upewnij się, że przeprowadzono zarówno adaptację myszy, jak i szkolenie naukowca.</li>
	<li>Przenieś zwierzęta na obszar doświadczalny w cichych i bezstresowych warunkach.</li>
	<li>Rozważ zastosowanie diety hiperkalorycznej w celu wywołania otyłości u myszy. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać dalsze porady.</li>
	<li>Zwierzęta poszczą przez 12 h w nocy, nie ograniczając dostępu do wody. Następnego dnia, po 12 godzinach postu, przygotuj glukometr zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów), wkładając nowy pasek testowy do portu paska testowego.</li>
	<li>Naciąć końcówkę ogona sterylnymi nożyczkami, delikatnie trzymając mysz za ogon, i natychmiast zmierz poziom glukozy we krwi na czczo, nakładając swobodnie płynącą kroplę krwi (minimalna wielkość próbki 0,5 μl) na pasek testowy glukometru. 
	UWAGA: Odliczanie czasu uruchamia się na ekranie po wystarczającym nałożeniu próbki krwi. Po 4 sekundach na ekranie pojawia się wynik testu.</li>
	<li>Następnie zważ i oznacz zwierzęta pojedynczo za pomocą kolorowego znakowania.</li>
	<li>Podawać 2 g glukozy/kg masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia wynosi 0,1 ml/10 g masy ciała (igła 27 g i strzykawka o pojemności 1 cm3).</li>
	<li>Następnie zmierz poziom glukozy we krwi po 15, 30, 60 i 120 minutach, nakładając kroplę swobodnie płynącej krwi na nowy pasek testowy. 
	UWAGA: Przepływ krwi można zwiększyć poprzez delikatne masowanie czubka ogona w kierunku czubka ogona. Jeśli rana ogonowa zaskorupia, wyczyść ją sterylnym wacikiem nasączonym 0,9% roztworem chlorku sodu.</li>
	<li>Pozwól zwierzętom odpocząć w ich domowych klatkach z nieograniczonym dostępem do wody między pomiarami.</li>
</ol>
2. Analiza funkcji płuc do pomiaru Res i cDyn
UWAGA: Aby pomiar Res i cDyn był niezakłócony, myszy muszą być wentylowane w głębokim znieczuleniu. Niezbędne jest bezstresowe obchodzenie się ze zwierzętami i właściwe monitorowanie znieczulenia. Aby uzyskać ogólne instrukcje dotyczące stosowania technik sterylnych, zapoznaj się z artykułem Hoogstraten-Miller i wsp.15
<ol>
	<li>Skalibruj pletyzmograf przed każdym zestawem eksperymentów i przygotuj ustawienia badania w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przed zabiegiem należy głęboko znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny (10 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) (igła 27 g i strzykawka 1 cm3). Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia wynosi 0,1 ml/10 g na masę ciała. 
	UWAGA: Ponieważ ketamina ma prawidłowe działanie przeciwbólowe u myszy, nie jest konieczne dodatkowe leczenie bólu. Inwazyjny zabieg cewnika tchawicy/pletyzmografu trwa około 5-7 minut, po czym można rozpocząć zbieranie danych.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
	<li>Zakryj oczy maścią, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.</li>
	<li>Stale monitoruj głębokość znieczulenia za pomocą reakcji na szczypanie palca. 
	UWAGA: Dodatkowe podanie środka znieczulającego może być konieczne w celu utrzymania znieczulenia na płaszczyźnie operacyjnej.</li>
	<li>Zwilż sierść pola operacyjnego w okolicy tarczycy 70% etanolem.</li>
	<li>Ostrożnie naciąć skórę w linii środkowej na około 1 cm między wcięciem szyjnym mostka a spojeniem bulwy mostka, unosząc ją kleszczami i przycinając skórę podczas oględzin nożyczkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wizualizuj leżącą pod spodem tkankę tłuszczową i tarczycę.</li>
	<li>Odsłoń tchawicę poprzez ostrożne oddzielenie obu płatów tarczycy na przesmyku i rozcięcie mięśni mostka i mostka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Należy uważać, aby nie uszkodzić żadnych naczyń krwionośnych i nie spowodować krwawienia, ponieważ może to spowodować niekorzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy, a ostatecznie na pomiary.</li>
	<li>Następnie przełóż pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem za pomocą kleszczy. Ostrożnie naciąć tchawicę w pobliżu krtani między chrząstkami tchawicy za pomocą mikronożyczek.</li>
	<li>Zaintubuj rurką dotchawiczą (średnica 0,04 cala / 1,02 mm) pod kontrolą wzrokową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Przymocuj rurkę poprzez podwiązanie do szwu chirurgicznego, aby uniknąć nieszczelności w systemie.</li>
	<li>Następnie przenieś zwierzę do podgrzewanego łóżka komory ciała i podłącz rurkę dotchawiczą do płyty czołowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) i włącz wentylację, naciskając przycisk wentylacji na przednim panelu sterownika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Zbadaj wentylację, obserwując ruch klatki piersiowej równolegle z szybkością wentylacji. Aby potwierdzić prawidłowe ułożenie rurki dotchawiczej, upewnij się, że obie strony klatki piersiowej poruszają się jednocześnie.</li>
	<li>Obserwuj sygnał ciśnienia na ekranie komputera (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Upewnij się, że krzywe wentylacji są jednolite. Jeśli tak nie jest, odczep zwierzę i sprawdź stronę operacyjną. Uważaj na krew lub śluz blokujący rurkę dotchawiczą. 
	UWAGA: Dla dorosłych zwierząt o masie ciała 20-25 g ustawienia respiratora pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 2 są sugerowane zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Aby kontrolować zmiany ciśnienia przezpłucnego podczas wentylacji, włóż rurkę przełykową (0,04 cala / 1,02 mm średnicy) do przełyku na głębokości zbliżonej do poziomu płuc. Obserwuj ekran podczas umieszczania tuby. Umieść rurkę w miejscu, w którym na ekranie widoczne jest maksymalne odchylenie ciśnienia i minimalne artefakty serca.</li>
	<li>Po zabiegu należy przygotować zwierzę do pomiaru. Ponownie wstrzyknąć znieczulenie poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg masy ciała) za pomocą igły 27 G i strzykawki o pojemności 1 cm3. Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia wynosi 0,1 ml/10 g na masę ciała. 
	UWAGA: Aby ocenić nadwrażliwość oskrzeli, nebulizuj metacholinę, nieselektywnego agonistę receptora muskarynowego przywspółczulnego układu nerwowego, który indukuje zwężenie oskrzeli. Akwizycja danych odbywa się w czterech różnych fazach (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję danych zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Oprogramowanie automatycznie prowadzi użytkowników przez proces akwizycji.</li>
	<li>Nanieść 10 μl PBS (nośnika) na nebulizator i rozpocząć nebulizację po 5 minutach od aklimatyzacji. Następnie następuje 3-minutowa faza odpowiedzi, w której mierzy się Res (cmH2O/mL/s) i cDyn (mL/cmH2O). Na koniec zapewnij zwierzęciu 3-minutową fazę rekonwalescencji przed następną nebulizacją.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z oprogramowaniem, stopniowo nakładając 10 μl metacholiny o rosnącym stężeniu (2,5 μg/10 μl, 6,25 μg/10 μl i 12,5 μg/10 μl) na respirator.</li>
	<li>Po wykonaniu i zarejestrowaniu wszystkich pomiarów należy złożyć zwierzę w stan uśmiercenia przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
3. Izolacja płuc do ilościowej analizy histomorfometrycznej dorosłych myszy
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić zwierzę poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny (10 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) (igła 27 g i strzykawka o pojemności 1 cm3). Objętość wstrzyknięcia powinna wynosić 0,1 ml/10 g na masę ciała. 
	UWAGA: Po osiągnięciu stanu tolerancji chirurgicznej przygotowanie trwa około 5 minut, po którym następuje perfuzja narządowa i 30 minut na utrwalenie.</li>
	<li>Gdy zwierzę osiągnie stan tolerancji chirurgicznej (negatywna reakcja na uszczypnięcie palca), zdezynfekuj zwierzę 70% etanolem i przymocuj zwierzę do podkładki za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Złożyć zwierzę w ofierze przez nakłucie serca i krwawienie. Krótko otwórz brzuch z przyśrodkowym nacięciem przez skórę i otrzewną za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Zlokalizuj przeponę w kierunku wątroby i ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w przeponie za pomocą nożyczek i nakłuj lewą komorę serca igłą 20 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 2 ml. Powoli wykrwawić zwierzę. 
	UWAGA: Powolne i ostrożne wykrwawianie jest ważne, aby zapobiec zapadaniu się komór z powodu podciśnienia, hamując niezakłócony przepływ krwi.</li>
	<li>Wypreparuj płuco, delikatnie otwierając klatkę piersiową przez nacięcie przymostkowe na całej długości klatki piersiowej za pomocą zakrzywionych, nożyczek.</li>
	<li>Następnie podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić jamę opłucnowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C). Usuń grasicę, aby zobaczyć serce i płuca. 
	UWAGA: Możliwe jest opcjonalne wstrzyknięcie do prawej komory, a następnie perfuzja układu naczyniowego płuc za pomocą lodowatego PBS, a następnie roztworu utrwalającego [np. 4% (masa/objętość) paraformaldehydu (PFA)]. Należy pamiętać, że istnieje zwiększone ryzyko pęknięcia przegród pęcherzyków płucnych i niekorzystnego wpływu na strukturę płuc przy użyciu tej metody.</li>
	<li>Wypreparuj płuco, najpierw ostrożnie usuwając serce.</li>
	<li>Następnie przełóż pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Następnie ostrożnie naciąć tchawicę w pobliżu krtani między chrząstkami tchawicy, zaintubować kaniulą dożylną (26 G) i nadmuchać płuco przez utrwalenie pod stałym ciśnieniem 20 cmH2Oza pomocą utrwalacza [np. 4% (masa/objętość) PFA].</li>
	<li>W celu utrwalenia PFA pozostaw utrwalacz na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie podwiązaj tchawicę i usuń kaniulę. Następnie należy ostrożnie wyciąć płuco, nie uszkadzając tkanki, i przechowywać je w środku utrwalającym w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Alternatywnie, zgodnie z dokumentem konsensusu ATS/ETS 2,5% buforowanym GA OsO4, roztwór Uracylu jest używany do prawidłowej stabilizacji tkanek. W celu dalszego przygotowania tkanek zobacz artykuł konsensusu autorstwa Hsia i wsp.14</li>
</ol>

<ol><li>Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+obesity+in+2005+and+projections+to+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030.</a> Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).</li>
<li>Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+the+association+between+abdominal+obesity+and+the+incidence+of+type+2+diabetes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes?</a> International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).</li>
<li>Wassink, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waist+circumference+and+metabolic+risk+factors+have+separate+and+additive+effects+on+the+risk+of+future+Type+2+diabetes+in+patients+with+vascular+diseases.+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study.</a> Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).</li>
<li>Oktay, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+of+Cardiorespiratory+Fitness+with+Obesity+and+the+Obesity+Paradox+in+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+cardiovascular+diseases%22%5BJournal%5D)">The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease.</a> Progress in cardiovascular diseases. , (2017).</li>
<li>Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokine+Contribution+to+the+Pathogenesis+of+Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis.</a> Mediators Inflamm. 2017, 5468023(2017).</li>
<li>Koenig, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11307867">Pulmonary complications of obesity.</a> The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).</li>
<li>Stunkard, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8629660">Current views on obesity.</a> The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).</li>
<li>Murugan, A. T., Sharma, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19029235">Obesity and respiratory diseases.</a> Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).</li>
<li>Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2990395/">Obesity and respiratory diseases.</a> International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).</li>
<li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).</li>
<li>McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+obesity-induced+inflammation+and+insulin+resistance%3A+insights+into+the+emerging+role+of+nutritional+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52(2013).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+procedures+for+describing+and+performing+metabolic+tests+of+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice.</a> Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).</li>
<li>Bates, J. H., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lung+function+in+mice%3A+the+phenotyping+uncertainty+principle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle.</a> J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).</li>
<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li>
<li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+aseptic+rodent+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Techniques in aseptic rodent surgery.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).</li>
<li>Heydemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Murine+High+Fat+Diet+as+a+Model+for+Type+2+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus.</a> Journal of diabetes research. 2016, 2902351(2016).</li>
<li>Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mice+are+susceptible+to+high+fat+diet-induced+hyperglycaemia+and+display+increased+circulatory+retinol+binding+protein+4+%28RBP4%29+levels+and+its+expression+in+visceral+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+physiology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots.</a> Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).</li>
<li>Jovicic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Immunometabolic+Phenotype+in+Th1+and+Th2+Dominant+Mouse+Strains+in+Response+to+High-Fat+Feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding.</a> PLoS One. 10, e0134089(2015).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+Background+Strain+Is+Essential+for+Metabolic+Research%3A+C57BL%2F6+and+the+International+Knockout+Mouse+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium.</a> Diabetes. 65, 25-33 (2016).</li>
<li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo%3A+advantages%2C+limitations%2C+and+appropriate+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).</li>
<li>Heijboer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+hours+of+fasting+differentially+affects+hepatic+and+muscle+insulin+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice.</a> Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).</li>
<li>Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265403">Evaluation of glucose homeostasis.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).</li>
<li>McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping%3A+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+should+put+clothes+on+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Why we should put clothes on mice.</a> Cell Metab. 9, 111-112 (2009).</li>
<li>Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full+expression+of+fasting-induced+torpor+requires+beta+3-adrenergic+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling.</a> J Neurosci. 26, 241-245 (2006).</li>
<li>Geiser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+and+body+temperature+reduction+during+hibernation+and+daily+torpor%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor.</a> Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).</li>
<li>Mead, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13768766">Mechanical properties of lungs.</a> Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).</li>
<li>Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li>
<li>Lundblad, L. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17906089">Penh is not a measure of airway resistance!</a> Eur Respir J. 30, 805(2007).</li>
<li>Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestrained+plethysmography+is+an+unreliable+measure+of+airway+responsiveness+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice.</a> J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).</li>
<li>Fairchild, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+volume+for+virus+retention+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice.</a> Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).</li>
<li>Brown, R. H., Wagner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bronchoprotection+by+anesthetic+induction+agents%3A+propofol+versus+ketamine%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine.</a> Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).</li>
<li>Goyal, S., Agrawal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+in+status+asthmaticus%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+journal+of+critical+care+medicine%3A+peer-reviewed%2C+official+publication+of+Indian+Society+of+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ketamine in status asthmaticus: A review.</a> Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).</li>
<li>Doi, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+irritation+produced+by+volatile+anaesthetics+during+brief+inhalation%3A+comparison+of+halothane%2C+enflurane%2C+isoflurane+and+sevoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+anaesthesia+%3D+Journal+canadien+d%27anesthesie%22%5BJournal%5D)">Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane.</a> Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).</li>
<li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs%3A+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%3A+respiratory%2C+environmental+and+exercise+physiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).</li>
<li>Rolls, G. <a target="_blank" href="http://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/fixation-and-fixatives-1-the-process-of-fixation-and-the-nature-of-fixatives/">Process of Fixation and the Nature of Fixatives</a>. , (2017).</li>
<li>Winsor, L. Tissue processing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinsor%2C+L+%22Laboratory+histopathology%22">Laboratory histopathology</a>. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Histochemistry%2C+theoretical+and+applied%22">Histochemistry, theoretical and applied</a>. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).</li>
<li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+basis+of+alveolar-capillary+gas+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange.</a> Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).</li>
<li>Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+fixation+by+airway+instillation%3A+effects+on+capillary+hematocrit%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit.</a> Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%3A+respiratory%2C+environmental+and+exercise+physiology%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).</li>
<li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+routines+cause+animal+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science%22%5BJournal%5D)">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy raport zawiera trzy protokoły dla trzech różnych metod analizy wpływu otyłości na metabolizm glukozy i wyniki płucne. Po pierwsze, test tolerancji glukozy daje możliwość analizy wewnątrzkomórkowego wychwytu glukozy i może wskazywać na insulinooporność. Po drugie, pletyzmografia całego ciała jest techniką pomiaru czynności płuc, a tym samym jest pomocna w testowaniu skuteczności nowych metod leczenia. Po trzecie, ustandaryzowany protokół fiksacji jest niezbędny do ilościowej analizy morfometrycznej w celu oceny ...

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2008 roku, ponad 1,4 miliarda dorosłych, w wieku 20 lat i starszych, miało nadwagę ze wskaźnikiem masy ciała (BMI) większym lub równym 25; ponadto, ponad 200 milionów mężczyzn i prawie 300 milionów kobiet było otyłych (BMI≥30)1. Otyłość i zespół metaboliczny są głównymi czynnikami ryzyka wielu chorób. Podczas gdy otyłość i towarzyszący jej wzrost masy białej tkanki tłuszczowej są ściśle związane z cukrzycą typu 22,3, chorobami sercowo-naczyniowymi, w tym chorobą niedokrwienną serca (CHD), niewydolnością serca (HF), migotaniem przedsionków4 i chorobą zwyrodnieniową stawów5, ich funkcjonalne role w patogenezie chorób układu oddechowego pozostają słabo poznane. Jednak badania epidemiologiczne wykazały, że otyłość jest silnie związana z przewlekłymi chorobami układu oddechowego, w tym dusznością wysiłkową, zespołem obturacyjnego bezdechu sennego (OBS), zespołem hipowentylacji otyłości (OHS), przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP), zatorowością płucną, zachłystowym zapaleniem płuc i astmą oskrzelową6,7,8,9. Potencjalne mechanizmy łączące otyłość i zaburzony metabolizm, np. insulinooporność i cukrzyca typu II, z patogenezą przewlekłej choroby płuc, obejmują nie tylko mechaniczne i fizyczne konsekwencje przyrostu masy ciała na wentylację, ale także wywołują przewlekły podostry stan zapalny10,11. Wzrost otyłości i chorób płuc w ciągu ostatniej dekady, w połączeniu z brakiem skutecznych strategii zapobiegawczych i podejść terapeutycznych, podkreśla potrzebę zbadania mechanizmów molekularnych w celu zdefiniowania nowych sposobów radzenia sobie z chorobami płuc związanymi z otyłością.
Tutaj opisujemy trzy standardowe testy, które są ważnymi podstawami do badania otyłości i jej wpływu na strukturę i funkcję płuc w modelach mysich: (1) wewnątrzotrzewnowa tolerancja glukozy (ipGTT) (2) pomiar oporu dróg oddechowych (Res) i zgodności układu oddechowego (Cdyn); oraz (3) przygotowanie i utrwalenie płuc do późniejszej ilościowej oceny histologicznej. ipGTT jest solidnym testem przesiewowym do pomiaru wychwytu glukozy, a tym samym wpływu otyłości na metabolizm. Prostota metody pozwala na dobrą standaryzację, a co za tym idzie porównywalność wyników między laboratoriami. Bardziej wyrafinowane metody, takie jak klamry hiperglikemiczne lub badania na izolowanych wyspach trzustkowych, mogą być wykorzystane do szczegółowej analizy fenotypu metabolicznego12. Tutaj oceniamy tolerancję glukozy, aby zdefiniować stan zaburzeń ogólnoustrojowych i metabolicznych związany z otyłością jako podstawę do dalszych badań nad wynikiem płucnym. Aby ocenić wpływ otyłości i zaburzeń metabolicznych na czynność płuc, zmierzyliśmy opór dróg oddechowych (Res) i podatność układu oddechowego (Cdyn). Aby scharakteryzować chorobę płuc, dostępne są zarówno nieograniczone, jak i powściągliwe metody oceny czynności płuc. Nieskrępowana pletyzmografia u swobodnie poruszających się zwierząt naśladuje stan naturalny, odzwierciedlając wzorce oddychania; Natomiast metody inwazyjne, takie jak pomiar impedancji wejściowej Res i cDyn u głęboko znieczulonych myszy w celu oceny dynamicznej mechaniki płuc, są dokładniejsze13. Ponieważ przewlekłe choroby układu oddechowego są odzwierciedlone w histologicznych zmianach tkanki płucnej, nieuchronne jest prawidłowe unieruchomienie płuc do dalszej analizy. Wybór metody utrwalenia i przygotowania tkanek zależy od przedziału płuca, który będzie badany, na przykład przewodzenia dróg oddechowych lub miąższu płuc14. W tym miejscu opisano metodę, która pozwala na jakościową i ilościową ocenę przewodzących dróg oddechowych w celu zbadania wpływu otyłości na rozwój astmy.

<table><tbody><tr><td>GlucoMen LX</td><td>A.Menarini diagnostics, Firneze, Włochy</td><td>38969</td><td>glukometr</td></tr><tr><td>GlucoMen LX Sensor</td><td>A.Menarini diagnostics, Firneze, Włochy</td><td>39765</td><td>Paski testowe</td></tr><tr><td>Glukoza 20%</td><td>B. Braun, Melsung, Niemcy</td><td>2356746</td><td></td></tr><tr><td>FinePointe Software</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Holandia</td><td>601-1831-002</td><td></td></tr><tr><td>Jednostanowiskowy stół pod mysz FinePointe RC</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Holandia</td><td>601-1831-001</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler FPRC</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Holandia</td><td>601-1075-001</td><td></td></tr><tr><td>Blok aerozolowy FPRC</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Holandia</td><td>601-1106-001</td><td></td></tr><tr><td>Głowica aerogenowa 5.2-4um</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Holandia</td><td>601-2306-001</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST, Kolumbia Brytyjska, Kanada</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>FST, Kolumbia Brytyjska, Kanada</td><td>14105-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>FST, Kolumbia Brytyjska, Kanada</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand 4-0</td><td>Ethicon, Portoryko, USA</td><td>736H</td><td>Szew</td></tr> <tr><td>chirurgicznyRoti-Histofix 4%</td><td>Roth</td><td>P087.1</td><td>4% Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Zoetis, Berlin, Niemcy</td><td>10013389</td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Rompun 2%</td><td>Bayer, Leverkusen, Niemcy</td><td>770081</td><td>Ksylazyna</td></tr></tbody></table>

dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Otyłość i zaburzenia układu oddechowego to główne problemy zdrowotne. Otyłość staje się wyłaniającą się epidemią, a do 2030 r. na całym świecie spodziewana liczba osób otyłych wyniesie ponad 1 miliard, co stanowi rosnące obciążenie społeczno-ekonomiczne. Jednocześnie stale rośnie liczba chorób współistniejących związanych z otyłością, w tym cukrzycy oraz przewlekłych chorób serca i płuc. Chociaż otyłość wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zaostrzeń astmy, pogorszeniem objawów ze strony układu oddechowego i słabą kontrolą, funkcjonalna rola otyłości i zaburzonego metabolizmu w patogenezie przewlekłej choroby płuc jest często niedoceniana, a podstawowe mechanizmy molekularne pozostają nieuchwytne. Celem artykułu jest przedstawienie metod oceny wpływu otyłości na metabolizm, a także strukturę i funkcję płuc. W tym miejscu opisujemy trzy techniki badań na myszach: (1) ocena wewnątrzotrzewnowej tolerancji glukozy (ipGTT) w celu analizy wpływu otyłości na metabolizm glukozy; (2) pomiar oporu dróg oddechowych (Res) i podatności układu oddechowego (Cdyn) w celu analizy wpływu otyłości na czynność płuc; oraz (3) przygotowanie i utrwalenie płuc do późniejszej ilościowej oceny histologicznej. Choroby płuc związane z otyłością są prawdopodobnie wieloczynnikowe, wynikają z ogólnoustrojowej dysregulacji stanu zapalnego i metabolicznej, które potencjalnie niekorzystnie wpływają na czynność płuc i odpowiedź na leczenie. Dlatego niezbędna jest ustandaryzowana metodologia badania mechanizmów molekularnych i efektów nowych metod leczenia.

Reprezentatywne wyniki testu tolerancji glukozy podanej dootrzewnowo (ipGTT) (Rysunek 4), testu funkcji płuc (Rysunek 5) oraz reprezentatywne obrazy przedstawiające płuca barwione hematoksyliną i eozyną (Rysunek 6).
Test ipGTT przeprowadzono u myszy otyłych (kolor niebieski) po 7 tygodniach stosowania diety wysokotłuszczowej (HFD). Myszy ka...

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Ogólnym celem poniższych trzech metod jest zbadanie wpływu otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad układem oddechowym dotyczące wpływu zaburzeń metabolicznych na strukturę i czynność płuc. Zaletą tych technik jest to, że można je łączyć w celu oceny funkcjonalnej roli metabolizmu w patogenezie przewlekłych chorób płuc oraz testowania różnych podejść terapeutycznych.Implikacje tych technik wykraczają poza fenotypowanie i wyjaśniają specyficzną funkcjonalną rolę celów metabolicznych w patogenezie chorób płuc. Metody te mogą być również stosowane do badania struktury i funkcji zarówno u zdrowych zwierząt z modyfikacjami genetycznymi, jak i w zwierzęcych modelach POChP i astmy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach, będą miały trudności, ponieważ wprowadzenie rurki dotchawiczej, wdmuchiwanie płuc i podawanie głębokiego znieczulenia, wszystkie one wymagają doświadczenia i szkolenia.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tych metod, gdy odkryliśmy, że wczesna otyłość u myszy, ale także u ludzi, jest ściśle związana z metabolizmem i przewlekłymi chorobami płuc po okresie niemowlęcym. Aby zmierzyć dootrzewnową tolerancję glukozy, delikatnie przytrzymaj dorosłą mysz na czczo przez 12 godzin za ogon i użyj sterylnych nożyczek do nacięcia końcówki ogona. Natychmiast nałóż swobodnie płynącą kroplę krwi na pasek testowy glukometru, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi na czczo.Wynik testu pojawi się na ekranie glukometru po czterech sekundach. Po zmierzeniu glukozy dla każdego zwierzęcia, oznacz je indywidualnie kolorowymi markerami i zważ zwierzęta. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki podaj każdemu zwierzęciu 100 mikrolitrów glukozy na tonę gramów masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym i zmierz poziom glukozy we krwi 15, 30, 60 i 120 minut później za pomocą nowych pasków testowych, jak pokazano.Aby ocenić czynność płuc, ułóż dorosłą mysz w pozycji leżącej na podkładce i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u stóp, zwilż sierść w okolicy tarczycy 70% etanolem i użyj kleszczy, aby unieść skórę w linii środkowej między wcięciem szyjnym przy mostku a spojeniem bulwy mentum. Za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry w skórze namiotu, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę tłuszczową i tarczycę oraz odsłonić tchawicę z ostrożnym oddzieleniem obu płatów tarczycy na przesmyku i rozcięciem mięśni mostkowo-tarczowych i mostkowych.Za pomocą ostrych kleszczy przełóż pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem i ostrożnie naciąć tchawicę blisko krtani między chrząstkami tchawicy za pomocą mikronożyczek. Zaintubować rurką dotchawiczą, zabezpieczając rurkę szwem chirurgicznym i przenieść zwierzę do podgrzewanego łóżka komory ciała. Podłącz rurkę dotchawiczą do płyty czołowej i włącz respirator.Potwierdź ruch klatki piersiowej równocześnie z szybkością wentylacji, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie rurki dotchawiczej i obserwuj sygnał ciśnienia na ekranie komputera. Aby kontrolować zmiany ciśnienia przezpłucnego podczas wentylacji, należy wprowadzić rurkę przełykową do poziomu płuc obserwujących ekran, aby ułatwić umieszczenie rurki w miejscu, w którym można zaobserwować maksymalne odchylenie ciśnienia i minimalne artefakty serca. Rozpocznij akwizycję danych zgodnie z instrukcjami producenta i nałóż 10 mikrolitrów PBS na nebulizator.Rozpocznij nebulizację po pięciu minutach aklamacji, po której następuje trzyminutowa faza odpowiedzi, podczas której mierzy się opór dróg oddechowych i podatność układu oddechowego. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez trzy minuty przed rozpoczęciem następnej nebulizacji i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania dotyczącymi stopniowego stosowania zwiększającego się stężenia metacholiny o 10 mikrolitrach na respiratorze. Do ilościowej analizy histomorfometrycznej tkanki płucnej użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w przeponie dorosłej myszy i użyj zakrzywionych nożyczek, aby wykonać nacięcie okołomostkowe na całej długości klatki piersiowej, aby delikatnie otworzyć klatkę piersiową.Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić jamę opłucnową i usunąć grasicę. Po usunięciu serca użyj ostrych kleszczy, aby przygotować i odsłonić tchawicę, aby przejść przez pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem, a następnie ostrożnie naciąć tchawicę w pobliżu krtani między chrząstkami tchawicy. Zaintubuj kaniulą dożylną o rozmiarze 26 i użyj środka utrwalającego, aby napełnić płuca przez utrwalenie ciśnienia pod stałym ciśnieniem 20 centymetrów wody.Po 30 minutach w temperaturze pokojowej podwiązać tchawicę i jednocześnie usunąć kaniulę. Następnie ostrożnie wyciąć płuca, nie uszkadzając tkanki i przechowywać płuca w świeżym środku utrwalającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Otyłe myszy wykazują wzrost poziomu glukozy w surowicy 15 i 30 minut po dootrzewnowym wstrzyknięciu glukozy, co wskazuje na upośledzony wychwyt glukozy przez komórki w porównaniu z myszami karmionymi standardową dietą.Inwazyjna analiza czynności płuc wykazuje do 1,5-krotnego wzrostu oporu dróg oddechowych u otyłych, wysokotłuszczowych myszy karmionych dietą po stymulacji metacholiną w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Zabarwienie hematoksyliną i eozyną wycinków miąższu płuc po instalacji dotchawiczej ujawnia wiele nienapompowanych obszarów, grubych przegród pęcherzykowych i wielokątnych pęcherzyków płucnych w płucach wkroplonych przy zbyt małym ciśnieniu. Natomiast zbyt duże ciśnienie wkraplania prowadzi do nadmiernie napompowanych obszarów ze zniszczonymi przegrodami pęcherzyków płucnych.Zastosowanie odpowiedniego ciśnienia podczas stabilizacji płuc prowadzi jednak do całkowitego napompowania płuca z okrągłymi pęcherzykami płucnymi. Po opanowaniu, dootrzewnowe testy tolerancji glukozy można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny. Testy czynnościowe płuc można wykonać w ciągu jednej godziny, a wdmuchiwanie płuc można zakończyć w mniej niż godzinę.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że adaptacja myszy, szkolenie badacza oraz praca w cichym i zredukowanym stresie środowisku są zalecane dla optymalnego pozyskiwania danych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem i chorobami układu oddechowego do zbadania mechanizmów związanych ze strategiami leczenia przewlekłej choroby płuc przy użyciu małych modeli zwierzęcych oraz ich skuteczności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wpływ otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc.Nie zapominaj, że praca ze zwierzętami lub narzędziami chirurgicznymi może powodować urazy lub reakcje skórne i że podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

intraperitoneal-glucose-tolerance-test-measurement-lung-function

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje, jak przeprowadzić doustny test tolerancji glukozy na myszy laboratoryjnej.

Doustny test tolerancji glukozy (OGTT): pomiar metabolizmu glukozy u myszy

Celem tego protokołu jest przedstawienie standardowej metody przeprowadzania dożylnych testów tolerancji glukozy (IVGTT) w celu oceny kontroli glikemii u naczelnych innych niż ludzie i oceny ich statusu metabolicznego od zdrowego do dysmetabolicznego.

Charakterystyka stanu metabolicznego u naczelnych innych niż ludzie za pomocą dożylnego testu tolerancji glukozy

To badanie opisuje protokół, który wykorzystuje obrazowanie 18F-FDG i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT), wraz z modelowaniem kinetycznym, do ilościowego określenia in vivo, w czasie rzeczywistym wychwytu 18F-FDG do tkanek.

Określanie kinetyki metabolizmu glukozy za pomocą 18F-FDG Micro-PET/CT

Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA) jest krytycznym kryterium oceny morfologii i fizjologii płuc w chorobach płuc i regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Opisujemy tutaj znormalizowaną metodę, która może zminimalizować błąd systematyczny pomiaru ISA zarówno w modelach myszy do pneumonektomii płuc, jak i implantacji protez.

Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Obecny artykuł opisuje generację i charakterystykę metaboliczną myszy karmionych dietą wysokotłuszczową jako model insulinooporności i otyłości wywołanej dietą. Ponadto zawiera szczegółowe protokoły do wykonywania doustnego testu tolerancji glukozy i testu tolerancji insuliny, monitorując zmiany metabolizmu glukozy w całym organizmie in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie fluorescencyjnie znakowanej glukozy koreluje z wychwytem glukozy i może być wykorzystane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wychwytu glukozy w wyciętych organach i hodowlach komórkowych.

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

Ten protokół przedstawia metodę oceny rezerwy pęcherzykowo-kapilarnej płuc mierzonej za pomocą połączonego pomiaru pojedynczego oddechu zdolności dyfuzji tlenku węgla (DL, CO) i tlenku azotu (DL, NO) podczas ćwiczeń. Założenia i zalecenia dotyczące stosowania techniki podczas ćwiczeń stanowią fundament tego artykułu.

Pomiar podwójnej zdolności dyfuzyjnej płuc gazu podczas wysiłku fizycznego u ludzi metodą pojedynczego oddechu

Tomografia impedancji elektrycznej to nieinwazyjne, wolne od promieniowania narzędzie do monitorowania wentylacji płuc w czasie rzeczywistym. Mierząc zmiany impedancji w klatce piersiowej, może wizualizować rozkład powietrza na zasadzie oddech po oddechu. Elektryczna tomografia impedancyjna początkowo przeznaczona do monitorowania wentylacji może również mierzyć perfuzję poprzez dożylne wstrzyknięcie roztworu soli fizjologicznej.

Monitorowanie czynności płuc za pomocą elektrycznej tomografii impedancyjnej na oddziale intensywnej terapii

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Poznaj metody badania wpływu otyłości na strukturę i czynność płuc u myszy, w tym test tolerancji glukozy, pletyzmografię i zespolenie płuc. Techniki te umożliwiają ocenę roli metabolizmu w patogenezie przewlekłych chorób płuc.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne (Wideo) | JoVE Journal

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Przeglądaj więcej filmów