Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne
March 15th, 2018
Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.
Ogólnym celem poniższych trzech metod jest zbadanie wpływu otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad układem oddechowym dotyczące wpływu zaburzeń metabolicznych na strukturę i czynność płuc. Zaletą tych technik jest to, że można je łączyć w celu oceny funkcjonalnej roli metabolizmu w patogenezie przewlekłych chorób płuc oraz testowania różnych podejść terapeutycznych.
Implikacje tych technik wykraczają poza fenotypowanie i wyjaśniają specyficzną funkcjonalną rolę celów metabolicznych w patogenezie chorób płuc. Metody te mogą być również stosowane do badania struktury i funkcji zarówno u zdrowych zwierząt z modyfikacjami genetycznymi, jak i w zwierzęcych modelach POChP i astmy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach, będą miały trudności, ponieważ wprowadzenie rurki dotchawiczej, wdmuchiwanie płuc i podawanie głębokiego znieczulenia, wszystkie one wymagają doświadczenia i szkolenia.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tych metod, gdy odkryliśmy, że wczesna otyłość u myszy, ale także u ludzi, jest ściśle związana z metabolizmem i przewlekłymi chorobami płuc po okresie niemowlęcym. Aby zmierzyć dootrzewnową tolerancję glukozy, delikatnie przytrzymaj dorosłą mysz na czczo przez 12 godzin za ogon i użyj sterylnych nożyczek do nacięcia końcówki ogona. Natychmiast nałóż swobodnie płynącą kroplę krwi na pasek testowy glukometru, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi na czczo.
Wynik testu pojawi się na ekranie glukometru po czterech sekundach. Po zmierzeniu glukozy dla każdego zwierzęcia, oznacz je indywidualnie kolorowymi markerami i zważ zwierzęta. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki podaj każdemu zwierzęciu 100 mikrolitrów glukozy na tonę gramów masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym i zmierz poziom glukozy we krwi 15, 30, 60 i 120 minut później za pomocą nowych pasków testowych, jak pokazano.
Aby ocenić czynność płuc, ułóż dorosłą mysz w pozycji leżącej na podkładce i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u stóp, zwilż sierść w okolicy tarczycy 70% etanolem i użyj kleszczy, aby unieść skórę w linii środkowej między wcięciem szyjnym przy mostku a spojeniem bulwy mentum. Za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry w skórze namiotu, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę tłuszczową i tarczycę oraz odsłonić tchawicę z ostrożnym oddzieleniem obu płatów tarczycy na przesmyku i rozcięciem mięśni mostkowo-tarczowych i mostkowych.
Za pomocą ostrych kleszczy przełóż pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem i ostrożnie naciąć tchawicę blisko krtani między chrząstkami tchawicy za pomocą mikronożyczek. Zaintubować rurką dotchawiczą, zabezpieczając rurkę szwem chirurgicznym i przenieść zwierzę do podgrzewanego łóżka komory ciała. Podłącz rurkę dotchawiczą do płyty czołowej i włącz respirator.
Potwierdź ruch klatki piersiowej równocześnie z szybkością wentylacji, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie rurki dotchawiczej i obserwuj sygnał ciśnienia na ekranie komputera. Aby kontrolować zmiany ciśnienia przezpłucnego podczas wentylacji, należy wprowadzić rurkę przełykową do poziomu płuc obserwujących ekran, aby ułatwić umieszczenie rurki w miejscu, w którym można zaobserwować maksymalne odchylenie ciśnienia i minimalne artefakty serca. Rozpocznij akwizycję danych zgodnie z instrukcjami producenta i nałóż 10 mikrolitrów PBS na nebulizator.
Rozpocznij nebulizację po pięciu minutach aklamacji, po której następuje trzyminutowa faza odpowiedzi, podczas której mierzy się opór dróg oddechowych i podatność układu oddechowego. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez trzy minuty przed rozpoczęciem następnej nebulizacji i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania dotyczącymi stopniowego stosowania zwiększającego się stężenia metacholiny o 10 mikrolitrach na respiratorze. Do ilościowej analizy histomorfometrycznej tkanki płucnej użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w przeponie dorosłej myszy i użyj zakrzywionych nożyczek, aby wykonać nacięcie okołomostkowe na całej długości klatki piersiowej, aby delikatnie otworzyć klatkę piersiową.
Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić jamę opłucnową i usunąć grasicę. Po usunięciu serca użyj ostrych kleszczy, aby przygotować i odsłonić tchawicę, aby przejść przez pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem, a następnie ostrożnie naciąć tchawicę w pobliżu krtani między chrząstkami tchawicy. Zaintubuj kaniulą dożylną o rozmiarze 26 i użyj środka utrwalającego, aby napełnić płuca przez utrwalenie ciśnienia pod stałym ciśnieniem 20 centymetrów wody.
Po 30 minutach w temperaturze pokojowej podwiązać tchawicę i jednocześnie usunąć kaniulę. Następnie ostrożnie wyciąć płuca, nie uszkadzając tkanki i przechowywać płuca w świeżym środku utrwalającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Otyłe myszy wykazują wzrost poziomu glukozy w surowicy 15 i 30 minut po dootrzewnowym wstrzyknięciu glukozy, co wskazuje na upośledzony wychwyt glukozy przez komórki w porównaniu z myszami karmionymi standardową dietą.
Inwazyjna analiza czynności płuc wykazuje do 1,5-krotnego wzrostu oporu dróg oddechowych u otyłych, wysokotłuszczowych myszy karmionych dietą po stymulacji metacholiną w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Zabarwienie hematoksyliną i eozyną wycinków miąższu płuc po instalacji dotchawiczej ujawnia wiele nienapompowanych obszarów, grubych przegród pęcherzykowych i wielokątnych pęcherzyków płucnych w płucach wkroplonych przy zbyt małym ciśnieniu. Natomiast zbyt duże ciśnienie wkraplania prowadzi do nadmiernie napompowanych obszarów ze zniszczonymi przegrodami pęcherzyków płucnych.
Zastosowanie odpowiedniego ciśnienia podczas stabilizacji płuc prowadzi jednak do całkowitego napompowania płuca z okrągłymi pęcherzykami płucnymi. Po opanowaniu, dootrzewnowe testy tolerancji glukozy można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny. Testy czynnościowe płuc można wykonać w ciągu jednej godziny, a wdmuchiwanie płuc można zakończyć w mniej niż godzinę.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że adaptacja myszy, szkolenie badacza oraz praca w cichym i zredukowanym stresie środowisku są zalecane dla optymalnego pozyskiwania danych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem i chorobami układu oddechowego do zbadania mechanizmów związanych ze strategiami leczenia przewlekłej choroby płuc przy użyciu małych modeli zwierzęcych oraz ich skuteczności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wpływ otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc.
Nie zapominaj, że praca ze zwierzętami lub narzędziami chirurgicznymi może powodować urazy lub reakcje skórne i że podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł omawia metody badania wpływu otyłości na strukturę i funkcjonowanie płuc za pomocą modeli zwierzęcych. Podkreśla znaczenie tych technik w zrozumieniu przewlekłych chorób płuc.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Badania nad układem oddechowym
- Zaburzenia metaboliczne
Tło
- Otyłość jest związana z przewlekłymi chorobami płuc.
- Zrozumienie mechanizmów wymaga dobrze określonych modeli zwierzęcych.
- Badania mają na celu zbadanie funkcjonalnej roli metabolizmu w patogenezie płuc.
- Techniki mogą być stosowane zarówno w modelach zdrowych, jak i chorobowych.
Cel badania
- Ocenić wpływ otyłości na wyniki dotyczące płuc.
- Opracować strategie zapobiegania przewlekłym chorobom płuc.
- Wyjaśnić funkcjonalną rolę metabolizmu w patogenezie chorób płuc.
Zastosowanie metod
- Test tolerancji na glukozę
- Plethyzmografia ciała
- Fiksacja płuc
- Kombinacja technik do kompleksowej oceny
Główne wyniki
- Metody zapewniają wgląd w strukturę i funkcjonowanie płuc.
- Techniki mogą pomóc w testowaniu podejść terapeutycznych.
- Wyniki mają zastosowanie w rozumieniu POChP i astmy.
- Wymagana jest doświadczona technika wykonania tych metod.
Wnioski
- Te metody są kluczowe dla badania wpływu otyłości na zdrowie płuc.
- Fascilitują one badanie zaburzeń metabolicznych w chorobach układu oddechowego.
- Trening jest niezbędny do skutecznego zastosowania tych technik.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Obesity-related metabolic dysfunction represents a growing risk factor for chronic lung diseases, creating a need for preclinical models that can mechanistically link systemic metabolism to pulmonary outcomes. The integrated assessment of glucose tolerance, lung function, and histological structure enables de-risking of therapeutic hypotheses by providing quantitative, reproducible readouts across metabolic and respiratory domains. This approach supports target validation and predictive confidence in early discovery by elucidating whether metabolic interventions modify lung pathology in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of metabolic targets in lung pathogenesis by measuring glucose intolerance as a biomarker of impaired cellular uptake.
- Operational Value: Enables pathway clarification through standardized ipGTT procedures that detect diet-induced metabolic dysregulation in obese models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking metabolic impairment to functional lung outcomes via concurrent airway resistance and compliance measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by fixing lungs at standardized pressure to ensure reproducible alveolar morphology for histomorphometric analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization through stepwise methacholine challenge protocols that quantify dose-dependent bronchoconstriction in obese versus control animals.
- Scalability: Highlights platform reuse across COPD and asthma models, enabling consistent lung structure-function assessment in genetically modified or diseased cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by connecting systemic inflammatory and metabolic dysregulation to lung structural changes such as thickened septa and polygonal alveoli.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by demonstrating how lung fixation at 20 cm H2O pressure yields round-shaped alveoli, enabling reliable quantitative endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by showing that appropriate insufflation pressure prevents overinflation or collapse, reducing artifact-driven variability in histological assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting iterative evaluation of metabolic interventions on lung structure and function in preclinical models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by measuring serum glucose levels at 15 and 30 minutes post-injection to evaluate cellular glucose uptake in obesity models.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible airway resistance and compliance measurements following nebulization and methacholine challenge, enabling compound effect comparison.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements such as increased airway resistance (up to 1.5-fold) and altered alveolar morphology that help teams compare metabolic and pulmonary phenotypes.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating lung preparation and fixation protocols that preserve tissue integrity for histological analysis across study groups.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable to both healthy animals with genetic modifications and disease models of COPD and asthma.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in obesity-lung disease linkages.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of metabolic and functional pulmonary assessments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early metabolic phenotype stratification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on concordant glucose tolerance, lung function, and histological outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in surgical procedures including tracheal intubation, lung insufflation, and glucose administration.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs such as glucometers, ventilators, pressure monitoring systems, and nebulizers for methacholine delivery.
- Cross-team standardization requirements for consistent animal fasting, injection dosing, and timing of metabolic and functional readouts.
- Adaptation considerations across model systems including healthy, genetically modified, and disease-induced obese mice.
- Practical limitations supported by source material: investigator training and stress-reduced environments are recommended for optimal data acquisition due to technical complexity of surgical steps.
