Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne
15 marca 2018
Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.
Ogólnym celem poniższych trzech metod jest zbadanie wpływu otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad układem oddechowym dotyczące wpływu zaburzeń metabolicznych na strukturę i czynność płuc. Zaletą tych technik jest to, że można je łączyć w celu oceny funkcjonalnej roli metabolizmu w patogenezie przewlekłych chorób płuc oraz testowania różnych podejść terapeutycznych.
Implikacje tych technik wykraczają poza fenotypowanie i wyjaśniają specyficzną funkcjonalną rolę celów metabolicznych w patogenezie chorób płuc. Metody te mogą być również stosowane do badania struktury i funkcji zarówno u zdrowych zwierząt z modyfikacjami genetycznymi, jak i w zwierzęcych modelach POChP i astmy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach, będą miały trudności, ponieważ wprowadzenie rurki dotchawiczej, wdmuchiwanie płuc i podawanie głębokiego znieczulenia, wszystkie one wymagają doświadczenia i szkolenia.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tych metod, gdy odkryliśmy, że wczesna otyłość u myszy, ale także u ludzi, jest ściśle związana z metabolizmem i przewlekłymi chorobami płuc po okresie niemowlęcym. Aby zmierzyć dootrzewnową tolerancję glukozy, delikatnie przytrzymaj dorosłą mysz na czczo przez 12 godzin za ogon i użyj sterylnych nożyczek do nacięcia końcówki ogona. Natychmiast nałóż swobodnie płynącą kroplę krwi na pasek testowy glukometru, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi na czczo.
Wynik testu pojawi się na ekranie glukometru po czterech sekundach. Po zmierzeniu glukozy dla każdego zwierzęcia, oznacz je indywidualnie kolorowymi markerami i zważ zwierzęta. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki podaj każdemu zwierzęciu 100 mikrolitrów glukozy na tonę gramów masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym i zmierz poziom glukozy we krwi 15, 30, 60 i 120 minut później za pomocą nowych pasków testowych, jak pokazano.
Aby ocenić czynność płuc, ułóż dorosłą mysz w pozycji leżącej na podkładce i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u stóp, zwilż sierść w okolicy tarczycy 70% etanolem i użyj kleszczy, aby unieść skórę w linii środkowej między wcięciem szyjnym przy mostku a spojeniem bulwy mentum. Za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry w skórze namiotu, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę tłuszczową i tarczycę oraz odsłonić tchawicę z ostrożnym oddzieleniem obu płatów tarczycy na przesmyku i rozcięciem mięśni mostkowo-tarczowych i mostkowych.
Za pomocą ostrych kleszczy przełóż pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem i ostrożnie naciąć tchawicę blisko krtani między chrząstkami tchawicy za pomocą mikronożyczek. Zaintubować rurką dotchawiczą, zabezpieczając rurkę szwem chirurgicznym i przenieść zwierzę do podgrzewanego łóżka komory ciała. Podłącz rurkę dotchawiczą do płyty czołowej i włącz respirator.
Potwierdź ruch klatki piersiowej równocześnie z szybkością wentylacji, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie rurki dotchawiczej i obserwuj sygnał ciśnienia na ekranie komputera. Aby kontrolować zmiany ciśnienia przezpłucnego podczas wentylacji, należy wprowadzić rurkę przełykową do poziomu płuc obserwujących ekran, aby ułatwić umieszczenie rurki w miejscu, w którym można zaobserwować maksymalne odchylenie ciśnienia i minimalne artefakty serca. Rozpocznij akwizycję danych zgodnie z instrukcjami producenta i nałóż 10 mikrolitrów PBS na nebulizator.
Rozpocznij nebulizację po pięciu minutach aklamacji, po której następuje trzyminutowa faza odpowiedzi, podczas której mierzy się opór dróg oddechowych i podatność układu oddechowego. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez trzy minuty przed rozpoczęciem następnej nebulizacji i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania dotyczącymi stopniowego stosowania zwiększającego się stężenia metacholiny o 10 mikrolitrach na respiratorze. Do ilościowej analizy histomorfometrycznej tkanki płucnej użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w przeponie dorosłej myszy i użyj zakrzywionych nożyczek, aby wykonać nacięcie okołomostkowe na całej długości klatki piersiowej, aby delikatnie otworzyć klatkę piersiową.
Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić jamę opłucnową i usunąć grasicę. Po usunięciu serca użyj ostrych kleszczy, aby przygotować i odsłonić tchawicę, aby przejść przez pleciony szew chirurgiczny 4-0 między tchawicą a przełykiem, a następnie ostrożnie naciąć tchawicę w pobliżu krtani między chrząstkami tchawicy. Zaintubuj kaniulą dożylną o rozmiarze 26 i użyj środka utrwalającego, aby napełnić płuca przez utrwalenie ciśnienia pod stałym ciśnieniem 20 centymetrów wody.
Po 30 minutach w temperaturze pokojowej podwiązać tchawicę i jednocześnie usunąć kaniulę. Następnie ostrożnie wyciąć płuca, nie uszkadzając tkanki i przechowywać płuca w świeżym środku utrwalającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Otyłe myszy wykazują wzrost poziomu glukozy w surowicy 15 i 30 minut po dootrzewnowym wstrzyknięciu glukozy, co wskazuje na upośledzony wychwyt glukozy przez komórki w porównaniu z myszami karmionymi standardową dietą.
Inwazyjna analiza czynności płuc wykazuje do 1,5-krotnego wzrostu oporu dróg oddechowych u otyłych, wysokotłuszczowych myszy karmionych dietą po stymulacji metacholiną w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Zabarwienie hematoksyliną i eozyną wycinków miąższu płuc po instalacji dotchawiczej ujawnia wiele nienapompowanych obszarów, grubych przegród pęcherzykowych i wielokątnych pęcherzyków płucnych w płucach wkroplonych przy zbyt małym ciśnieniu. Natomiast zbyt duże ciśnienie wkraplania prowadzi do nadmiernie napompowanych obszarów ze zniszczonymi przegrodami pęcherzyków płucnych.
Zastosowanie odpowiedniego ciśnienia podczas stabilizacji płuc prowadzi jednak do całkowitego napompowania płuca z okrągłymi pęcherzykami płucnymi. Po opanowaniu, dootrzewnowe testy tolerancji glukozy można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny. Testy czynnościowe płuc można wykonać w ciągu jednej godziny, a wdmuchiwanie płuc można zakończyć w mniej niż godzinę.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że adaptacja myszy, szkolenie badacza oraz praca w cichym i zredukowanym stresie środowisku są zalecane dla optymalnego pozyskiwania danych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem i chorobami układu oddechowego do zbadania mechanizmów związanych ze strategiami leczenia przewlekłej choroby płuc przy użyciu małych modeli zwierzęcych oraz ich skuteczności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wpływ otyłości i zaburzeń metabolicznych na strukturę i funkcję płuc.
Nie zapominaj, że praca ze zwierzętami lub narzędziami chirurgicznymi może powodować urazy lub reakcje skórne i że podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metody badania wpływu otyłości na strukturę i funkcję płuc z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Podkreślono znaczenie tych technik w zrozumieniu przewlekłych chorób płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad układem oddechowym
- Zaburzenia metaboliczne
Wprowadzenie
- Otyłość jest powiązana z przewlekłymi chorobami płuc.
- Zrozumienie tych mechanizmów wymaga dobrze zdefiniowanych modeli zwierzęcych.
- Celem badań jest zbadanie funkcjonalnej roli metabolizmu w patogenezie płuc.
- Techniki te można zastosować zarówno w modelach zdrowych, jak i chorych.
Cel badania
- Ocena wpływu otyłości na wyniki płucne.
- Ustalenie strategii zapobiegawczych w chorobach przewlekłych płuc.
- Wyjaśnienie funkcjonalnej roli celów metabolicznych.
Zastosowane metody
- Test tolerancji glukozy
- Pletyzmografia całego ciała
- Fiksacja płuc
- Połączenie technik w celu kompleksowej oceny
Główne wyniki
- Metody te dostarczają informacji na temat budowy i funkcji płuc.
- Stosowane techniki mogą pomóc w testowaniu podejść terapeutycznych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia POChP oraz astmy.
- Prawidłowe wykonanie techniki wymaga doświadczenia.
Wnioski
- Metody te są kluczowe dla badania wpływu otyłości na zdrowie płuc.
- Ułatwiają one badanie zaburzeń metabolicznych w chorobach układu oddechowego.
- Szkolenie jest niezbędne do skutecznego zastosowania tych technik.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dysfunkcja metaboliczna związana z otyłością stanowi rosnący czynnik ryzyka przewlekłych chorób płuc, co stwarza zapotrzebowanie na modele przedkliniczne, które mogą mechanistycznie powiązać metabolizm systemowy z efektami w obrębie płuc. Zintegrowana ocena tolerancji glukozy, funkcji płuc oraz struktury histologicznej umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczenie ilościowych, powtarzalnych odczytów w domenach metabolicznej i oddechowej. Podejście to wspiera walidację celów i zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, wyjaśniając, czy interwencje metaboliczne modyfikują patologię płuc w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza funkcjonalnej roli celów metabolicznych w patogenezie płuc poprzez pomiar nietolerancji glukozy jako biomarkera upośledzonego wychwytu komórkowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych dzięki standaryzowanym procedurom ipGTT, które wykrywają indukowaną dietą dysregulację metaboliczną w modelach otyłości.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez powiązanie zaburzeń metabolicznych z funkcjonalnymi efektami w płucach za pomocą jednoczesnych pomiarów oporu i podatności dróg oddechowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów badań poprzez utrwalanie płuc pod standaryzowanym ciśnieniem, co zapewnia powtarzalną morfologię pęcherzyków płucnych do analiz histomorfometrycznych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problem standaryzacji testów dzięki zastosowaniu etapowych protokołów próby z metacholiną, które pozwalają na ilościowe określenie zależnego od dawki skurczu oskrzeli u zwierząt otyłych w porównaniu z grupą kontrolną.
- Skalowalność: Wskazuje na możliwość ponownego wykorzystania platformy w modelach POChP i astmy, co umożliwia spójną ocenę zależności między strukturą a funkcją płuc w kohortach zwierząt modyfikowanych genetycznie lub chorych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia znaczenie kliniczne choroby, łącząc systemową dysregulację zapalną i metaboliczną ze zmianami strukturalnymi w płucach, takimi jak pogrubienie przegród i wieloboczne pęcherzyki płucne.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, wykazując, że utrwalanie płuc pod ciśnieniem 20 cm H2O pozwala uzyskać pęcherzyki o okrągłym kształcie, co umożliwia uzyskanie wiarygodnych punktów końcowych w analizie ilościowej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Odnosi się do redukcji ryzyka mechanistycznego, wykazując, że odpowiednie ciśnienie insufflacji zapobiega nadmiernemu rozdęciu lub zapadnięciu się pęcherzyków, co zmniejsza zmienność wynikającą z artefaktów w ocenach histologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta plasuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, wspierając iteracyjną ocenę interwencji metabolicznych w odniesieniu do struktury i funkcji płuc w modelach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar poziomu glukozy w surowicy w 15. i 30. minucie po iniekcji w celu oceny komórkowego poboru glukozy w modelach otyłości.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez powtarzalne pomiary oporu i podatności dróg oddechowych po nebulizacji i próbie z metacholiną, co umożliwia porównanie efektów działania związków.
- Analityka: Podkreśla ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak zwiększony opór dróg oddechowych (do 1,5-krotnego) i zmieniona morfologia pęcherzyków płucnych, co pomaga zespołom porównywać fenotypy metaboliczne i płucne.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, prezentując protokoły przygotowania i utrwalania płuc, które zachowują integralność tkanki do analizy histologicznej w grupach badawczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako możliwość wielokrotnego zastosowania, a nie technikę jednorazową, możliwą do wykorzystania zarówno u zdrowych zwierząt z modyfikacjami genetycznymi, jak i w modelach chorobowych POChP i astmy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w powiązaniach między otyłością a chorobami płuc.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność metabolicznych i funkcjonalnych ocen płuc.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki wczesnej stratyfikacji fenotypów metabolicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na zgodnych wynikach tolerancji glukozy, funkcji płuc i obrazie histologicznym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie procedur chirurgicznych, w tym intubacji tchawicy,y wentylacji płuc oraz podawania glukozy.
- Zapotrzebowanie na instrumentarium i infrastrukturę analityczną, taką jak glukometry, respiratory, systemy monitorowania ciśnienia oraz nebulizatory do podawania metacholiny.
- Wymogi dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności w zakresie głodzenia zwierząt, dawkowania iniekcji oraz czasu pomiarów metabolicznych i funkcjonalnych.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, w tym u myszy zdrowych, modyfikowanych genetycznie oraz z indukowaną otyłością.
- Ograniczenia praktyczne wynikające z materiałów źródłowych: ze względu na złożoność techniczną etapów chirurgicznych, w celu optymalnego pozyskiwania danych zaleca się przeszkolenie badaczy oraz zapewnienie środowiska ograniczającego stres.
