Stworzenie wysokoprzepustowej platformy badań przesiewowych w celu oceny heterogeniczności amplifikacji genu HER2 w raku piersi
5 grudnia 2017
Heterogeniczny rozkład komórek HER2-dodatnich można zaobserwować w podgrupie nowotworów piersi i rodzi dylematy kliniczne. W tym miejscu przedstawiamy niezawodny i opłacalny protokół definiowania, ilościowego określania i porównywania heterogeniczności genetycznej HER2 wewnątrz guza w dużej serii heterogennie przetworzonych nowotworów piersi.
Ogólnym celem tej procedury laboratoryjnej jest jednoczesne zdefiniowanie, ilościowe określenie i porównanie wewnętrznej heterogeniczności genetycznej HER2 w obrębie guza w dużej serii heterogennie przetworzonych nowotworów piersi za pomocą wysokoprzepustowej hybrydyzacji srebra in situ. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów związanych z translacją raka piersi i badaniami, takimi jak badanie heterogeniczności amplifikacji genu HER2, dużej kohorty przypadków pobranych z archiwów patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustową schizoanalizę HER2 w różnych obszarach topograficznych mnogich i niejednorodnie przetworzonych nowotworów piersi.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w hybrydyzacji in situ, będą miały trudności, ponieważ badania retrospektywne zazwyczaj wymagają analizy próbek archiwalnych, które przeszły różne procedury utrwalania, przetwarzania i przechowywania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdecydowaliśmy się przeklasyfikować wszystkie nowotwory piersi z naszej instytucjonalnej bazy danych od 2003 roku. Tę procedurę zademonstruje Giulia Ercoli, technik z naszego laboratorium.
Rozpocznij ten protokół od wyboru pacjentów i próbek tkanek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utwórz i otwórz nowy plik arkusza kalkulacyjnego, zawierający zapisy z odrębnych obszarów każdej sprawy. Dołącz osobne kolumny dla identyfikatora przypadku, identyfikatora bloku, identyfikatora obszaru, typu tkanki, topografii, morfologii, statusu biomarkera i wszystkich innych dostępnych cech immunohistochemicznych.
Utwórz projekt TMA. Zdefiniuj bloki adresatów PMA, przechodząc do pozycji plik, nowy, blok. Kliknij pierwsze pole, aby wypełnić i wpisz wymiary bloku parafinowego.
Następnie utwórz projekt tablicy tkankowej, przechodząc do pliku, nowego, macierzy tkanek. Kliknij ikonę importu, a następnie wybierz plik szablonu wcześniej utworzonego bloku odbiorców. Kliknij Dalej.
Następnie wybierz jeden milimetr jako rozmiar plamki, klikając okrągły przycisk. Wybierz 500 mikronów jako odstęp między plamkami, czyli przestrzeń między dwoma środkami sąsiednich miejsc. Następnie kliknij ikonę kalkulatora, aby obliczyć łączną liczbę utworzonych miejsc, która powinna wynosić 231.
Następnie kliknij przycisk definiuj, aby utworzyć siatki i podsiatki. Skreślić kolumny ósmą i 15 oraz linię środkową. Zachowaj trzy punkty pierwszej linii dla orientacji.
Ostateczna mapa powinna obejmować łączną liczbę 183 miejsc. Zdefiniuj listę typów tkanek, przechodząc do pliku, nowego, listy typów tkanek. Następnie zdefiniuj projekt, przechodząc do pliku, nowego, projektu wspomagającego.
Następnie przygotuj bloki akceptorów. Oczyszczone metalowe formy napełnij elastyczną parafiną w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pozostaw bloki parafiny do ostygnięcia w temperaturze folii na noc wewnątrz metalowych form.
Następnego dnia wyekstrahuj bloki parafiny z metalowych form. Skonstruuj TMA za pomocą zautomatyzowanego lub półautomatycznego narzędzia do tworzenia tablicy, najpierw włączając macierz, a następnie wstawiając bloki akceptujące do karuzeli tablic. Zdefiniuj pozycję początkową na każdym bloku odbiorcy, używając strzałek, aby przesunąć światło lasera i wyrównać je z lewą górną krawędzią parafiny bloku odbiorcy.
Kliknij przycisk Dalej i powtórz te czynności dla wyrównania w pionie. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby automatycznie utworzyć otwór w poprzednio zdefiniowanej współrzędnej bloku odbiorcy. Opróżnij stempel.
Ustaw blok dawcy do pobrania próbki i usuń rdzeń tkankowy z wcześniej opisanego obszaru zainteresowania. Włóż rdzeń tkanki dawcy do otworu w bloku biorcy. Następnie usuń blok dawcy z macierzy.
Powtarzaj te kroki, aż TMA zostanie zakończone. Umieść stronę tkankową nowo wygenerowanego bloku TMA na sterylnym czystym szkiełku podstawowym i umieść je w piecu laboratoryjnym w temperaturze 45 stopni Celsjusza na pięć minut. Delikatnie dociśnij klocek na szkiełku przez pięć sekund, aby spłaszczyć rdzenie tkanek.
Powtórz raz, w sumie dwa razy. Następnie pokryj powierzchnię tkanki TMA cienką warstwą elastycznej parafiny o temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pozostaw blok TMA w temperaturze pokojowej na dwie godziny.
Na koniec przenieś blok TMA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny przed wykonaniem analiz histochemicznych i immunohistochemicznych, jak opisano w protokole tekstowym. Umieść szkiełka TMA do analizy w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie uruchom przyrząd i oprogramowanie immunostainer.
W widoku głównym kliknij przycisk protokołów, a następnie kliknij przycisk utwórz/edytuj protokoły. Wybierz procedurę podwójnego koktajlu ISH, aby zmodyfikować szablon podstawowy. Oznacz pieczenie na liście pudełek i ustaw temperaturę na 63 stopnie Celsjusza na 20 minut.
Następnie oznacz deparafinowanie. Następnie oznacz kondycjonowanie komórek na liście pól. Następnie oznacz kondycjonowanie komórek CC2 i ustaw temperaturę na 86 stopni Celsjusza, a czas inkubacji na cztery minuty.
Oznacz łagodny CC2 na osiem minut, standardowy na 12 minut i przedłużony na osiem minut. Oznacz ISH-proteazę trzy na liście pól i ustaw czas inkubacji na 16 minut. Wybierz dinitropenyl HER2 i digoksygeninę chromosomu 17 sondy.
Inkubować przez 16 minut, a następnie ustawić denaturację na 20 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Ustaw czas inkubacji sondy na sześć godzin. Następnie ustaw czas inkubacji multimeru SISH na 32 minuty.
Ustaw chromian srebra i czas inkubacji na cztery minuty. Następnie ustaw czas inkubacji czerwonego multimeru na 24 minuty. Ustaw czerwony chromian i czas inkubacji na osiem minut.
Następnie oznacz barwienie przeciwstawne na liście pól, wybierz hematoksylinę dwa i ustaw czas inkubacji na osiem minut. Oznacz post barwienia przeciwstawnego na liście pól, wybierz odczynnik do niebieszczenia i ustaw czas inkubacji na cztery minuty. Na koniec wykonaj schizoanalizę dla HER2.
Ocenić amplifikację genu HER2 jako dodatnią, jeśli stosunek sondy do liczenia chromosomów HER2 17 jest większy lub równy 2,0 przy średniej liczbie kopii HER2 większej lub równej 4,0 sygnałów na komórkę. Oceń jako negatywny, jeśli stosunek sondy do oznaczania liczby chromosomów HER2 17 jest mniejszy niż 2,0, a średnia liczba kopii HER2 jest mniejsza niż 4,0 sygnałów na komórkę. Pokazano tutaj reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające analizę hybrydyzacji srebra in situ heterogennego raka piersi HER2.
W tym paradygmatycznym przykładzie dwa odrębne obszary inwazyjnego raka piersi o wysokim stopniu złośliwości bez specjalnego typu wykazują różne wyniki pod względem amplifikacji genu HER2, wizualizowanej jako czarne kropki, w porównaniu z sondą do liczenia centromerowego 17, wizualizowaną jako czerwone kropki. W szczególności jeden obszar należący do rdzenia guza i wykazujący nieregularny wzór barwienia cytokeratyny siedem był amplifikowany przez HER2, podczas gdy pojedynczy punkt przed frontem inwazyjnym wykazywał wzór HER2 typu dzikiego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić czytelną schizoanalizę matryc oznaczonych tkankami zawierających mnogie i niejednorodnie przetworzone raki piersi.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni roboczych od wyboru etui. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem raka piersi, można ją przełożyć na inne rodzaje raka, w których heterogeniczność HER2 jest krytycznie istotna, takie jak rak żołądka. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku prostej oceny HER2, ponieważ jest ona przeznaczona do kompleksowego mapowania wielu obszarów topograficznych w większych seriach raka piersi.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uniknąć pęknięć na bloku TMA. Nawet minimalne pęknięcie parafiny świadczy o jakości, odtwarzalności i ogólnej klarowności hybrydyzacji in situ. Po tej procedurze można wykonać obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące proteomiki raka piersi, szczególnie w zakresie niejednorodności wewnątrz- i międzynowotworowej.
Nie zapominaj, że praca z stemplami TMA i gorącym woskiem parafinowym może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie jednorazowych rękawiczek nitrylowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono niezawodny i kosztowo efektywny protokół definiowania, ilościowego określania i porównywania wewnątrznowotworowej heterogeniczności genetycznej HER2 w raku piersi. Metoda ta wykorzystuje wysokoprzepustową srebrną hybrydyzację in situ w celu rozwiązania dylematów klinicznych wynikających z heterogennego rozkładu komórek HER2-dodatnich.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad rakiem piersi
- Heterogeniczność genetyczna
- Techniki hybrydyzacji in situ
Wstęp
- Komórki HER2-dodatnie wykazują heterogeniczną dystrybucję w niektórych nowotworach piersi.
- Ta heterogenność stanowi wyzwanie dla podejmowania decyzji klinicznych.
- Istniejące metody mogą być problematyczne w przypadku próbek archiwalnych ze względu na zróżnicowany sposób przetwarzania.
- Techniki wysokoprzepustowe mogą usprawnić analizę wielu próbek jednocześnie.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy heterogeniczności amplifikacji genu HER2.
- Ułatwienie badań nad rakiem piersi z wykorzystaniem dużej kohorty z archiwów patomorfologicznych.
- Poprawa wiarygodności analizy HER2 w warunkach klinicznych.
Wykorzystane metody
- Wysokoprzepustowa srebrna hybrydyzacja in situ.
- Analiza dużej serii przypadków raka piersi.
- Porównanie heterogeniczności genetycznej HER2 w różnych obszarach guza.
- Wykorzystanie próbek archiwalnych o zróżnicowanym utrwaleniu i obróbce.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne ilościowe określenie heterogeniczności HER2.
- Analiza wysokoprzepustowa ujawnia znaczące różnice w ekspresji HER2.
- Wyniki mogą pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych w leczeniu raka piersi.
- Protokół można dostosować do różnych warunków przetwarzania próbek.
Wnioski
- Niniejszy protokół pozwala na lepsze zrozumienie heterogeniczności HER2 w raku piersi.
- Stanowi on cenne narzędzie zarówno dla badaczy, jak i klinicystów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby dalej badać terapie związane z HER2.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Heterogeniczność HER2 w raku piersi komplikuje decyzje terapeutyczne i przyczynia się do zmiennych wyników klinicznych, co stwarza potrzebę zastosowania zestandaryzowanych i skalowalnych metod oceny. Ta wysokoprzepustowa platforma SISH umożliwia jednoczesną kwantyfikację amplifikacji genu HER2 w wielu topografiiach guza oraz w próbkach archiwalnych, wspierając przedkliniczną walidację celów oraz stratyfikację biomarkerów. Dzięki zapewnieniu powtarzalnego, ilościowego mapowania statusu HER2, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę wzorców amplifikacji HER2 w różnych obszarach guza w celu wyjaśnienia zasadności wyboru celu oraz jego znaczenia biologicznego.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną ocenę ryzyka celu poprzez ilościowe określenie wewnątrznowotworowej zmienności genetycznej w archiwalnych kohortach raka piersi.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na wyznaczenie stosunków sygnału HER2/chromosom 17 oraz progów liczby kopii, co dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu procesu wyboru celu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na tworzenie zestandaryzowanych formatów TMA zoptymalizowanych pod kątem SISH, co umożliwia skalowalną ocenę statusu HER2 w próbkach heterogenicznych.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza stosunek HER2/chromosom 17 oraz średnią liczbę kopii HER2 na komórkę jako mierzalne punkty końcowe walidacji analizy.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do innych typów nowotworów (np. żołądka), w których heterogenność HER2 wpływa na odpowiedź terapeutyczną, co wspiera przenaszalność analizy pomiędzy różnymi wskazaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Mapuje status HER2 od etapu odkryć po modele przedkliniczne, zachowując heterogenność przestrzenną w tkankach FFPE.
- Dostosowanie biomarkerów: Integruje się z IHC dla ER, PR, Ki67 oraz HER2, co umożliwia multimodalne profilowanie biomarkerów w kohortach archiwalnych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Identyfikuje subpopulacje HER2-ujemne w obrębie nowotworów pozornie HER2-dodatnich, co dostarcza informacji na temat strategii terapii skojarzonej oraz mechanizmów oporności.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do translacji, umożliwiając ocenę heterogeniczności HER2 po identyfikacji celu i przed przedklinicznymi badaniami skuteczności, szczególnie w przypadku stratyfikacji opartej na biomarkerach.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wzorców amplifikacji HER2 oraz heterogeniczności szlaków w próbkach guza pierwotnego.
- Badania przesiewowe: Zapewnia powtarzalność analizy poprzez standaryzację konstrukcji TMA oraz wykonania protokołu SISH w przypadku próbek poddanych różnym procesom przygotowania.
- Analityka: Dostarcza ilościowe stosunki HER2/chromosom 17 oraz progi liczby kopii, co umożliwia obiektywne porównanie heterogeniczności genetycznej.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość prac przedklinicznych poprzez powiązanie przestrzennych wzorców HER2 z efektami funkcjonalnymi w systemach modelowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zestandaryzowaną platformę oceny HER2, możliwą do zastosowania w wielu wskazaniach nowotworowych i zestawach próbek archiwalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach zależnych od HER2 poprzez rozwiązanie problemu wewnątrznowotworowej heterogeniczności genetycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu tworzeniu macierzy TMA oraz optymalizacji warunków SISH.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność decyzji typu go/no-go, dostarczając ilościowych progów HER2 do stratyfikacji pacjentów w badaniach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów celujących w HER2 z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację nowotworów o heterogennych profilach amplifikacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu macierzy tkankowych (TMA), hybrydyzacji in situ oraz analizie patologii cyfrowej.
- Zależność od zautomatyzowanych barwiarek, urządzeń do tworzenia macierzy TMA oraz systemów obrazowania zdolnych do wykrywania sygnału SISH.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w obszarach patologii, biologii molekularnej i bioinformatyki w celu zapewnienia spójnej interpretacji danych.
- Należy uwzględnić różnice w utrwalaniu, przetwarzaniu i przechowywaniu próbek podczas porównywania sygnałów HER2 w materiałach archiwalnych.
- Ograniczenie do oceny amplifikacji HER2 na poziomie DNA; metoda nie obejmuje ekspresji białka ani aktywności sygnalizacyjnej bez uzupełniających badań IHC lub testów funkcjonalnych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
