Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka
22 lutego 2018
Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.
Ogólnym celem tego indukowanego szokiem cieplnym systemu ekspresji białek jest ocena aktywności antyapoptotycznej białek w dwóch potencjalnie antagonistycznych funkcjonalnie białkach w komórkach owadów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji i aktywności białek kandydujących w biotechnologii i proteomice, takich jak ich działanie antyapoptotyczne i interakcje białkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że czas ekspresji genów jest kontrolowany przez indukcję szoku cieplnego.
Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w stan funkcjonalny białka. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak ekspresja białek ssaków. Komórki owadów Spodoptera frugiperda lub Sf9 używane w tym protokole są hodowane w pożywce do hodowli komórkowych w kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Potrząsnąć kolbą do hodowli komórkowych w celu odłączenia komórek od kolby. Następnie sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że około 80% komórek jest odłączonych. Przenieś 50% zawiesiny komórek do nowej kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i pozwól komórkom przyłączyć się w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Po 15 minutach zastąp podłoże pięcioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i hoduj w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza. W zależności od wzrostu komórek, przechodź komórki co dwa do trzech dni. Przed pobraniem komórek Sf9 ważne jest, aby sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami lub innymi mikroorganizmami.
Aby zebrać komórki Sf9, potrząśnij kolbą hodowlaną, aby odłączyć komórki, a następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Za pomocą pipety P10 przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemacytometru i policz liczbę komórek pod mikroskopem świetlnym. Płytkę trzy razy po 10 do piątej komórki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.
Po 15 minutach zastąp pożywkę 0,5 mililitra pożywki galwanicznej. Przygotuj regenta transfekcji komórek. Do każdej transfekcji rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji komórek 100 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i wirować przez jedną sekundę w celu wymieszania.
W tym badaniu trzy różne obcięcia genu bakulowirusa, inhibitora apoptozy 3 lub IAP3, zostaną wyrażone pod kontrolą promotora szoku cieplnego Drosophila 70, IAP3 na pełnej długości, skrócenie bez domeny RING i skrócenie bez domeny BIR. Dodaj dwa mikrogramy każdego plazmidowego DNA do 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszaj przez wirowanie przez jedną sekundę. Przygotuj również kontrolę pozytywną.
Połącz rozcieńczony plazmidowy DNA i rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Za pomocą pipety P1000 dodaj kroplami 210 mikrolitrów każdej mieszaniny odczynników do transfekcji DNA na komórki.
Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Po pięciu godzinach zastąp pożywkę galwaniczną 0,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowych, a następnie uszczelnij 24-dołkową płytkę taśmą. Inkubować w temperaturze 28 stopni.
Następnego dnia szok termiczny w celu wywołania ekspresji białka poprzez pływanie płytki w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach włóż 24-dołkową płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Ekspresja białka jest następnie potwierdzana za pomocą Western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby zbadać apoptozę komórek indukowaną genem, najpierw przygotuj komórki Sf9, jak wykazano wcześniej. Następnie należy transfekować komórki w taki sam sposób jak poprzednio, ale w każdej reakcji transfekcji należy uwzględnić jeden mikrogram plazmidu zawierającego gen indukujący apoptozę. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin, wymienić pożywkę i inkubować przez 16 godzin.
Szok cieplny transfekowanych komórek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin przed przeprowadzeniem testu żywotności komórek. W przypadku apoptozy komórek wywołanej chemikaliami umieść jedną płytkę razy 10 do sześciu komórek Sf9 w każdym dołku płytki sześciodołkowej.
Pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut, a następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem podłoża galwanicznego. Transfekować komórki czterema mikrogramami każdego plazmidowego DNA. Po pięciu godzinach zastąp pożywkę galwaniczną jednym mililitrem pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 16 godzin.
Następnie szok cieplny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Inkubuj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin po szoku cieplnym. Następnie potraktuj transfekowane komórki aktynomycyną D w celu wywołania apoptozy.
Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 16 godzin przed przeprowadzeniem testu żywotności komórek. Rozpocznij tę procedurę od umycia leczonych komórek. Usuń pożywkę z każdej studzienki, dodaj jeden mililitr PBS i pozostaw na jedną minutę.
W ten sposób przemyć komórki trzykrotnie PBS. Ponownie zawiesić komórki w każdej studzience jednym mililitrem PBS zawierającym 04% błękitu trypanowego i barwić w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge.
Przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek zabarwionej na niebiesko trypanem do hemacytometru i policz żywotne nienaruszone komórki pod mikroskopem świetlnym. Na koniec przeprowadź analizę statystyczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pełna długość i dwa obcięcia IAP3 z Lymantria xylina MNPV uległy nadekspresji w komórkach Sf9, a Western blot przeprowadzono na lizatach komórkowych w celu potwierdzenia ekspresji białka.
Białko antyapoptotyczne Ac-P35 włączono jako kontrolę pozytywną. Wszystkie białka można było wykryć w transfekowanych komórkach po jednej godzinie lub pięciu godzinach po szoku cieplnym, z wyższą ekspresją po pięciu godzinach. System ten można dostosować do oceny aktywności antyapoptotycznej.
W przypadku apoptozy komórek indukowanej genami, induktor apoptozy Drosophila Reaper został poddany jednoczesnej transfekcji z docelowymi konstruktami plazmidowymi genów do komórek Sf9, które następnie poddano szokowi cieplnemu w celu aktywacji ekspresji genów. W porównaniu z wektorem Drosophila Reaper, kontrola pozytywna wykazała wysoką aktywność antyapoptotyczną, sięgającą nawet 80% wskaźnika żywotności. Pozostałe konstrukty wykazywały różny wpływ na aktywność antyapoptotyczną.
W przypadku apoptozy komórek wywołanej substancją chemiczną tylko jeden konstrukt został transfekowany do komórek Sf9, a aktynomycynę D dodano pięć godzin po szoku cieplnym. W porównaniu z kontrolą pozytywną lub kontrolą negatywną, pozostałe konstrukty wykazywały różny wpływ na aktywność antyapoptozą. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o przestrzeganiu zasad działania hodowli komórkowej w przepływie laminarnym i dokładnym sprawdzaniu stanu komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak koimmunoprecypitacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy istnieje jakakolwiek interakcja między dwoma białkami ulegającymi koekspresji w komórkach owadów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biotechnologii do badania funkcji białek w organizmach zwierzęcych lub mikroorganizmach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tego systemu do ekspresji obcego białka lub oceny potencjalnie funkcjonalnie antagonistycznych białek w komórkach owadów. Nie zapominaj, że praca z niektórymi chemikaliami, takimi jak aktynomycyna D, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje system ekspresji białek indukowany szokiem termicznym (system komórek pDHsp/V5-His/sf9), wykorzystywany do oceny aktywności antyapoptotycznej obcych białek w komórkach owadów. Metoda ta pozwala na kontrolowanie czasu ekspresji genów poprzez indukcję szokiem termicznym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Proteomika
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Systemy ekspresji białek indukowane szokiem termicznym są cenne w badaniu funkcji białek.
- Komórki owadzie, takie jak Sf9, są powszechnie stosowane do ekspresji białek.
- Metoda ta może zostać również dostosowana do ekspresji białek ssaków.
- Zrozumienie aktywności antyapoptotycznej jest kluczowe dla różnych zastosowań badawczych.
Cel badania
- Ocena aktywności antyapoptotycznej białek kandydackich.
- Badanie oddziaływań międzybiałkowych w kontrolowanym środowisku.
- Uzyskanie informacji na temat statusu funkcjonalnego białek.
Zastosowane metody
- Indukcja szokiem termicznym w celu kontroli ekspresji genów.
- Wykorzystanie komórek owadziego linii Sf9 hodowanych w pożywce do kultur komórkowych.
- Ocena białek obcych oraz ich przyciętych sekwencji aminokwasowych.
- Analiza oddziaływań i aktywności białek.
Główne wyniki
- Pomyślna ekspresja obcych białek w komórkach owadów.
- Wykazane działania antyapoptotyczne białek kandydujących.
- Uzyskanie informacji na temat statusu funkcjonalnego białek.
- Wskazanie potencjalnych zastosowań w biotechnologii i proteomice.
Wnioski
- System ekspresji białek indukowany szokiem termicznym jest skuteczny w badaniu funkcji białek.
- Metoda ta zapewnia kontrolowane podejście do oceny aktywności białek.
- Możliwe jest dalsze zastosowanie tej metody w innych systemach ekspresyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten indukowany szokiem termicznym system ekspresji umożliwia kontrolowaną czasowo ekspresję obcych białek w komórkach owadów, wspierając testy funkcjonalne aktywności antyapoptotycznej. Stanowi on powtarzalną platformę do oceny funkcji białek w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej, pomagając w walidacji celu oraz ograniczaniu ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania leków. Możliwość adaptacji systemu do kotransfekcji białek antagonistycznych pozwala na badanie oddziaływań białkowych, co zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyki
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę funkcjonalną białek kandydackich poprzez kontrolowaną ekspresję wariantów pełnowymiarowych i skróconych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ocenę aktywności antyapoptotycznej z wykorzystaniem induktorów apoptozy, takich jak Reaper Drosophila lub czynników chemicznych, takich jak aktynomycyna D.
- Wartość strategiczna: Ułatwia porównanie wariantów białek w celu wyjaśnienia zależności między strukturą a funkcją oraz priorytetyzację celów o pożądanych profilach funkcjonalnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące ekspresji białek, potwierdzone za pomocą metody Western blot w określonych punktach czasowych po indukcji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły transfekcji i szoku termicznego dla formatów płytek 24-dołkowych i 6-dołkowych, zapewniając powtarzalność wyników analizy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalną ocenę wariantów białek w identycznych warunkach, wspierając proces optymalizacji związków wiodących (hit-to-lead) w przepływach pracy proteomicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystanie komórek Sf9 jako systemu istotnego dla przebiegu choroby do modelowania szlaków apoptozy oraz oceny przeżywalności komórek zapośredniczonej przez białka.
- Wartość operacyjna: Wyznaczanie liczby żywych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu, co zapewnia funkcjonalny odczyt skuteczności przeciwapoptozy.
- Wartość strategiczna: Wsparcie postępów skorygowanych o ryzyko poprzez powiązanie aktywności molekularnej z fenotypem komórkowym w powtarzalnym modelu komórek owadziej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w etap od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji leadów, gdzie funkcjonalna walidacja aktywności białka dostarcza informacji niezbędnych do wyboru celu oraz przygotowania testów do dalszych analiz przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ekspresję wariantów białek w celu oceny funkcji antyapoptotycznej i potencjału interakcji.
- Screening: Zapewnia powtarzalne procedury transfekcji i indukcji, kompatybilne z formatami płytek wielodołkowych, przeznaczone do funkcjonalnego screeningu średniej przepustowości.
- Analityka: Umożliwia potwierdzenie ekspresji metodą Western blot oraz wykonanie testów żywotności w celu ilościowego określenia aktywności białek i efektów komórkowych.
- Badania translacyjne: Łączy funkcje molekularne z wynikiem fenotypowym w komórkach owadzich, wspierając mechanistyczne zrozumienie regulacji apoptozy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych kandydatów białkowych w projektach z zakresu biotechnologii i proteomiki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Umożliwia ograniczenie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie domen białkowych (np. RING, BIR) z aktywnością antyapoptotyczną za pomocą analizy trunkacji.
- Wartość operacyjna: Oferuje standaryzowane protokoły hodowli komórkowych, transfekcji, indukcji szokiem termicznym oraz oceny żywotności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu danych funkcjonalnych o wariantach białek przed zasobochłonną walidacją.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów z wykazaną aktywnością w kontrolowanym, indukowalnym systemie ekspresji.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórek owadziej, technik transfekcji oraz protokołów indukcji szokiem termicznym.
- Metoda zależy od dostępu do inkubatorów lub kąpieli wodnych o temperaturze 28°C i 42°C w celu kontrolowanej ekspresji.
- Konieczne jest standaryzowane przygotowanie i mieszanie odczynników, aby zapewnić spójną wydajność transfekcji we wszystkich studzienkach.
- Wymagana jest adaptacja projektu plazmidu i dobór promotora w zależności od białka docelowego i celów ekspresji.
- Ograniczeniem jest konieczność przestrzegania środków bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z niebezpiecznymi substancjami, takimi jak aktynomycyna D.
