Name: Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj system ekspresji białek indukowanej szokiem cieplnym w komórkach Sf9 do oceny aktywności antyapoptotycznej obcych białek. Ta metoda pozwala kontrolować czas ekspresji genu i badać funkcje białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jian-Horng Leu z Instytutu Biologii Morskiej, National Taiwan Ocean University za dostarczenie 3 konstrukcji plazmidowych. Badania te były wspierane przez Grant 106-2311-B-197 -001 - z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Hodowla komórek owadów
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki do hodowli komórkowych. W tym celu należy dodać 500 μl antybiotyków (amfoterycyna B = 0,25 μg/ml, penicylina = 100 jednostek/ml, streptomycyna = 100 μg/ml) i 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w pożywce do hodowli komórek bez surowicy (bez FBS lub antybiotyków). 
		nuta: Przed użyciem podgrzać płodową surowicę bydlęcą w temperaturze 65 °C przez 30 minut w łaźni wodnej.</li>
		<li>Utrzymuj Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), komórki owadów sf9. Oderwać ok. 80% komórek od kolby do hodowli komórkowej o średnicy 25cm2 poprzez potrząśnięcie kolbą i sprawdzić pod mikroskopem świetlnym. Następnie przenieść 50% zawiesiny komórek do nowej kolby do hodowli komórkowych o średnicy 25cm2 i pozostawić komórki do przyłączenia się na 15 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę 5 ml pożywką do hodowli świeżych komórek i hoduj w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Komórki pasażowe należy przeprowadzać co 2 do 3 dni, w zależności od wzrostu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plazmidów do transfekcji komórek
	<ol>
		<li>Wstawić docelowe fragmenty DNA (np. gen iap3 Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) i jego konstrukty delecji) do pDHsp/V5-His metodą klonowania opartą na PCR11. Sprawdź wzrost przekształconych kolonii przez PCR kolonii za pomocą PCR Master Mix (2X) i zestawu starterów pDhsp-F2/Op-IE2R. Potwierdź sekwencje plazmidu za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania. 
		UWAGA: W tabeli 1 wymieniono startery używane do PCR i odpowiadające im konstrukty.</li>
		<li>Hodowla jednosekwencjonowanych kolonii bakteryjnych, które zawierają wyżej wymienione struktury plazmidowe (krok 1.2) w pożywce o pojemności 200 ml LB zawierającej odpowiednio wybrane antybiotyki (50 μg/ml).</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidy z hodowanej E. coli za pomocą zestawu plazmidów Midi zgodnie z instrukcjami producenta12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę galwaniczną, mieszając 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i 8,5 ml pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych aktynomycyny D (ActD), dodając 1,5 μl materiału wyjściowego ActD (1 mg/ml) do 10 ml pożywki do hodowli komórkowej (stężenie końcowe = 150 ng/ml). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przejściowa ekspresja białka
<ol>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Zebrać komórki sf9 przez wytrząsanie kolby hodowlanej, przewrócić i upuścić zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i przenieść 10 μl do hemocytometru za pomocą pipety P10. Policz liczbę komórek pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Płytka 3 × 105 komórek sf9 do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę 0,5 ml podłoża galwanicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja plazmidów
	<ol>
		<li>Rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek: Rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji komórek w 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszać przez wirowanie przez 1 s.</li>
		<li>Dodaj 2 μg plazmidowego DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His) do 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszaj przez wirowanie przez 1 s (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
		<li>Połączyć rozcieńczony plazmidowy DNA i rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek (210 μl) i mieszać przez wirowanie przez 1 s. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać kroplami 210 μl mieszaniny odczynników do transfekcji DNA na komórki za pomocą pipety P1000. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 5 godzin.</li>
		<li>Zastąp pożywkę galwaniczną 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych za pomocą pipety P1000. Uszczelnić 24-dołkową płytkę taśmą i inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szok cieplny transfekowanych komórek: Umieść płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C (unoszącej się na powierzchni wody). Podgrzewać przez 30 minut i umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Wykrywanie ekspresji białek
	<ol>
		<li>Po 1 h lub 5 h szoku cieplnym umyj komórki 0,5 ml 1x buforu PBS krótko trzy razy. 
		UWAGA: Rozcieńczyć bufor 10x PBS do 1x buforu PBS, dodając 1 ml buforu 10x PBS do 9 ml wysterylizowanego ddH2O</li>
		<li>Zneutralizować komórki za pomocą 40 μl barwnika ładującego 1x SDS, pipetując w górę iw dół. 
		UWAGA: Rozcieńczyć 4x barwnik ładujący SDS, mieszając 30 μl 1x buforu PBS i 10 μL 4x buforu próbki SDS.</li>
		<li>Podgrzewać próbki białek w temperaturze 98 °C przez 10 minut w bloku grzewczym, wirować przez 1 minutę i umieszczać na lodzie do testu Western blot.</li>
		<li>Test Western blot 
		Postępuj zgodnie z procedurą testu Western blot z Eslami i Lujan13. Uruchom SDS-PAGE gels14: jeden żel poddany barwieniu Coomassie na niebiesko (kontrola obciążenia w celu sprawdzenia, czy ilość próbek białka załadowanych do każdej studzienki jest równa pod względem ilości), a drugi poddany testowi Western blot, zgodnie z Eslami i Lujan13.</li>
		<li>Wykryć białka fuzyjne znakowane V5 za pomocą króliczego przeciwciała anty-V5 (5 mg / ml) (rozcieńczenie 1:5000 w buforze TBST do stężenia roboczego 1 μg / ml) i koniugatu koziej anty-króliczej peroksydazy IgG-chrzanowej (HRP) (0,8 mg / ml) (rozcieńczenie 1:10000 w buforze TBST do stężenia roboczego 0,08 μg / ml). 
		nuta: Dostosuj zawartość procentową poliakrylamidu do 17,5%, gdy masa cząsteczkowa białka ma wynosić <17 kDa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test aktywności antyapoptotycznej
<ol>
	<li>Apoptoza komórek wywołana genem: Powtórz powyższą procedurę od 2.1 do 2.3. Kotransfekcja 1 μg plazmidowego DNA pDHsp/D-rpr/FLAG-His (zawierającego gen induktora apoptozy) z 1 μg plazmidowego DNA [odpowiednio wektor pDHsp70/V5-His (kontrola ujemna), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (kontrola pozytywna), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His.]. Po 5 godzinach po leczeniu szokiem cieplnym przeprowadź test żywotności komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	<li>Apoptoza komórek wywołana chemicznie: Powtórz wyżej wymienioną procedurę od 2.1 do 2.3. W kroku 2.1.2 umieść 1 x 106 komórek sf9 w każdym dołku na płytce 6-dołkowej. Transfekcja 4 μg plazmidowego DNA [odpowiednio wektor pDHsp70/V5-His (kontrola negatywna), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (kontrola pozytywna), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His.]. Po 5 godzinach od szoku cieplnego potraktuj komórki sf9 2 ml pożywki do hodowli komórek ActD przez 16 godzin i przeprowadź test żywotności komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
	nuta: Minimalna objętość do pokrycia jednego dołka płytki 6-dołkowej wynosi 1 ml.</li>
	<li>Wykonaj powyższe eksperymenty z testem aktywności antyapoptotycznej, w tym 3.1 i 3.2 w trzech powtórzeniach.</li>
</ol>
4. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Umyj leczone komórki, dodając 1 ml buforu 1x PBS przez 1 minutę 3 razy. Ponownie zawiesić komórki, pipetując 1 ml 1x bufor PBS zawierający 0,04% błękitu trypanowego i barwić przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. 
	nuta: Rozcieńczyć 0,4% roztwór błękitu trypanowego, mieszając 9 ml buforu 1x PBS i 1 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
	<li>Przenieść 10 μl trypanowej zawiesiny komórek zabarwionych na niebiesko do hemocytometru za pomocą pipety P10 i policzyć żywotne nienaruszone komórki pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Oblicz zarejestrowane dane i przedstaw jako środki ± S.D. dla wszystkich obliczeń.</li>
		<li>Analizuj dane za pomocą dwustronnego testu t Studenta za pomocą programu Microsoft Excel. Zdefiniuj statystycznie istotne dane jako wartość P <0,05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Koncepcja systemu komórkowego pDHsp/V5-His/sf9 opartego na szoku cieplnym została po raz pierwszy opisana przez Clem i wsp. w 1994 r.8. Porównanie promotora genu bakulowirusa (IE1) i Drosophila hsp70 wykazało, że hsp70 miał wyższą skuteczność w komórkach komarów10. Ponadto, ze względu na indukcję szoku cieplnego, czas ekspresji białek może być precyzyjnie kontrolowany po obróbce szoku cieplnego. System ten został następnie zastosowany do ...

Dwa systemy ekspresji białek były powszechnie używane do produkcji białek: systemy ekspresji białek prokariotów (system ekspresji genów Escherichia coli) i systemy ekspresji białek eukariotów. Jednym z popularnych systemów ekspresji białek eukariotycznych jest system wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS)1. Bakulowirusy zostały po raz pierwszy użyte na całym świecie jako środki kontroli biologicznej szkodników rolniczych i leśnych. W ciągu ostatnich kilku dekad bakulowirusy zostały opracowane jako narzędzia biotechnologiczne dla wektorów ekspresji białek. Genomy bakulowirusów składają się z dwuniciowego kolistego DNA i otoczkowych nukleokapsydów2. Do tej pory zsekwencjonowano ponad siedemdziesiąt osiem izolatów bakulowirusa3. Opierając się na kaskadzie czasowej ekspresji genów bakulowirusa w komórkach owadów gospodarza, transkrypcję genu można podzielić na cztery kaskady czasowe, w tym geny natychmiastowo-wczesne, opóźnione-wczesne, późne i bardzo późne4.
BEVS zostały wyznaczone tak, że bardzo późne promotory genów (np. wielościan lub promotor p10) były używane do kierowania genami docelowymi, podczas gdy rekombinowany bakulowirus był generowany przez rekombinację homologiczną. Ekspresja obcych białek w komórkach owadów przez rekombinowanego bakulowirusa jest podobna do ekspresji białek ssaków w modyfikacjach potranslacyjnych (odpowiednich do produkcji glikoproteiny). W związku z tym bakulowirus jest szeroko stosowany5,6,7. Jednak jednym z ograniczeń jest obecność różnych szlaków N-glikozylacji w komórkach owadów7.
Dlatego też opracowano nowy system ekspresji wirusa bakulowirusa, system przejściowej ekspresji genów. System ten ulega ekspresji obcych genów pod wpływem promotorów natychmiast-wczesnych bakulowirusów (tj. promotora 1) w komórkach owadów. Dzięki zastosowaniu tego systemu, białko docelowe może być natychmiast wyrażane pod kontrolą promotora ie-1, jednocześnie modyfikując szlak N-glikozylacji w komórkach owadów, co skutkuje lepszymi oligosacharydami sprzężonymi z N7. Co więcej, geny bakulowirusa są transkrybowane przez polimerazę II RNA komórki gospodarza i nie wymagają żadnego czynnika wirusowego do aktywacji4. Dlatego obce białka mogą ulegać ekspresji w komórkach owadów w krótkim czasie. Do tej pory system przejściowej ekspresji genów jest jedną z najważniejszych technologii wykonywania testów funkcjonalnych białek w systemie hodowli komórkowych bakulowirusa in vitro. System może być stosowany do analizy funkcji bakulowirusa lub obcych białek. Jeden z dostępnych na rynku przejściowych systemów ekspresji genów opiera się na promotorach genu o natychmiastowej wczesnej fazie (IE) wirusa polihedrozy jądrowej Orgyia pseudotsugata multicapsid (OpMNPV) (promotory OpIE2 i OpIE1).
Jednak niższy poziom ekspresji obcych genów w komórkach owadów nadal stanowił problem, gdy zastosowano system ekspresji przejściowych genów oparty na promotorze OpIE8,9,10. W ten sposób skonstruowano kolejny przejściowy system ekspresji genów w oparciu o promotor genu białka szoku cieplnego Drosophila 70 (hsp70) 8,9. Promotor hsp70 działa skuteczniej niż bakuroliwirusowy promotor IE, gdy jest indukowany szokiem cieplnym w komórkach owadów10. W tym systemie geny docelowe ulegały ekspresji pod wpływem promotora szoku cieplnego Drosophila 70 (Dhsp70). Obce geny można łatwo sklonować do plazmidu o przejściowej ekspresji genów za pomocą metod klonowania opartych na PCR. Co więcej, kontrola czasu ekspresji genów może być przeprowadzona przez indukcję szoku cieplnego.
W tym raporcie, stosujemy podejście i wyrażamy trzy różne skrócenia genu bakulowirusa (inhibitor apoptozy 3, iap3 z Lymantria xylina MNPV) za pomocą systemu ekspresji białek przejściowych opartego na szoku cieplnym i dalej stosujemy te wyrażone białka do analizy aktywności antyapoptotycznej. System ten może albo szybko eksprymować obce białka, albo być dalej stosowany do oceny aktywności antyapoptotycznej białek w komórkach sf9, a jednocześnie może być stosowany do innych testów aktywności białek.

<table><tbody><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>do hodowli komórek owadów</td></tr><tr><td>Certyfikowana płodowa surowica bydlęca</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II</td><td>SFM Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>pożywka do hodowli komórkowych bez surowicy</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia w świetle odwróconym</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Competent Cell</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Bulion (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, klasa bakteriologiczna</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>Antybiotyk anty-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>selekcja PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (bez endotoksyn)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 ml probówki wirówkowe</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowy wielotalerzowy</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>Odczynnik Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>odczynnik transfektyny komórkowej</td></tr><tr><td>PBS-buforowany fosforanem Sól fizjologiczna (10X) pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4 razy; SDS Loading Dye</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td><td>Membrany Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF</td></tr><tr><td>System Mini Trans-Blot Cell</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>Blottion</td></tr><tr><td>Roztwór Pąsek</td><td>S SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anty-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>królicze przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-V5Kozia peroksydaza chrzanowa anty-królikowa IgG (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % roztwór błękitu trypanowego</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F123602 Taśma</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24-dołkowa taśma ( 19 mm i razy; 36 mln zł)</td></tr></tbody></table>

przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

System przejściowej ekspresji genów jest jedną z najważniejszych technologii do przeprowadzania analizy funkcjonalnej białek w systemie hodowli komórkowych bakulowirusa in vitro. System ten został opracowany do ekspresji obcych genów pod kontrolą promotora bakulowirusa w plazmidach o przejściowej ekspresji. Co więcej, system ten można zastosować do testu funkcjonalnego zarówno samego bakulowirusa, jak i obcych białek. Najszerzej i najszerzej dostępny na rynku system ekspresji genów przejściowych został opracowany w oparciu o promotor genu natychmiastowo wczesnego (IE) wirusa polihedrozy jądrowej Orgyia pseudotsugata multicapsid (OpMNPV). Zaobserwowano jednak niski poziom ekspresji obcych genów w komórkach owadów. W związku z tym skonstruowano przejściowy system ekspresji genów w celu poprawy ekspresji białek. W tym systemie rekombinowane plazmidy zostały skonstruowane tak, aby zawierały sekwencję docelową pod kontrolą promotora szoku cieplnego Drosophila 70 (Dhsp70). Protokół ten przedstawia zastosowanie tego opartego na szoku cieplnym systemu pDHsp / V5-His (epitop V5 z 6 histydyną) / komórki Spodoptera frugiperda (komórka sf9); System ten jest dostępny nie tylko do ekspresji genów, ale także do oceny aktywności antyapoptotycznej białek kandydujących w komórkach owadów. Co więcej, system ten może być transfekowany jednym rekombinowanym plazmidem lub kotransfekowany dwoma potencjalnie funkcjonalnie antagonistycznymi rekombinowanymi plazmidami w komórkach owadów. Protokół demonstruje skuteczność tego systemu i przedstawia praktyczny przypadek zastosowania tej techniki.

Pełnowymiarowe białko oraz dwie inne wersje skrócone (domeny BIR i RING) Ly-IAP3 z LyxyMNPV wykazano nadekspresję w komórkach sf9, wykorzystując system pDHsp/V5-His/Spodoptera frugiperda oparty na szoku termicznym. Wektor pDHsp/V5-His zawiera promotor białka szoku termicznego Drosophila, który steruje ekspresją genu w temperaturze 42 °C przy udziale komórkowych czynników transkrypcyjnych i systemu translacji (Rysunek 1)8</s...

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Ogólnym celem tego indukowanego szokiem cieplnym systemu ekspresji białek jest ocena aktywności antyapoptotycznej białek w dwóch potencjalnie antagonistycznych funkcjonalnie białkach w komórkach owadów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji i aktywności białek kandydujących w biotechnologii i proteomice, takich jak ich działanie antyapoptotyczne i interakcje białkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że czas ekspresji genów jest kontrolowany przez indukcję szoku cieplnego.Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w stan funkcjonalny białka. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak ekspresja białek ssaków. Komórki owadów Spodoptera frugiperda lub Sf9 używane w tym protokole są hodowane w pożywce do hodowli komórkowych w kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Potrząsnąć kolbą do hodowli komórkowych w celu odłączenia komórek od kolby. Następnie sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że około 80% komórek jest odłączonych. Przenieś 50% zawiesiny komórek do nowej kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i pozwól komórkom przyłączyć się w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Po 15 minutach zastąp podłoże pięcioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i hoduj w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza. W zależności od wzrostu komórek, przechodź komórki co dwa do trzech dni. Przed pobraniem komórek Sf9 ważne jest, aby sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami lub innymi mikroorganizmami.Aby zebrać komórki Sf9, potrząśnij kolbą hodowlaną, aby odłączyć komórki, a następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Za pomocą pipety P10 przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemacytometru i policz liczbę komórek pod mikroskopem świetlnym. Płytkę trzy razy po 10 do piątej komórki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.Po 15 minutach zastąp pożywkę 0,5 mililitra pożywki galwanicznej. Przygotuj regenta transfekcji komórek. Do każdej transfekcji rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji komórek 100 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i wirować przez jedną sekundę w celu wymieszania.W tym badaniu trzy różne obcięcia genu bakulowirusa, inhibitora apoptozy 3 lub IAP3, zostaną wyrażone pod kontrolą promotora szoku cieplnego Drosophila 70, IAP3 na pełnej długości, skrócenie bez domeny RING i skrócenie bez domeny BIR. Dodaj dwa mikrogramy każdego plazmidowego DNA do 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszaj przez wirowanie przez jedną sekundę. Przygotuj również kontrolę pozytywną.Połącz rozcieńczony plazmidowy DNA i rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Za pomocą pipety P1000 dodaj kroplami 210 mikrolitrów każdej mieszaniny odczynników do transfekcji DNA na komórki.Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Po pięciu godzinach zastąp pożywkę galwaniczną 0,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowych, a następnie uszczelnij 24-dołkową płytkę taśmą. Inkubować w temperaturze 28 stopni.Następnego dnia szok termiczny w celu wywołania ekspresji białka poprzez pływanie płytki w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach włóż 24-dołkową płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Ekspresja białka jest następnie potwierdzana za pomocą Western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby zbadać apoptozę komórek indukowaną genem, najpierw przygotuj komórki Sf9, jak wykazano wcześniej. Następnie należy transfekować komórki w taki sam sposób jak poprzednio, ale w każdej reakcji transfekcji należy uwzględnić jeden mikrogram plazmidu zawierającego gen indukujący apoptozę. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin, wymienić pożywkę i inkubować przez 16 godzin.Szok cieplny transfekowanych komórek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin przed przeprowadzeniem testu żywotności komórek. W przypadku apoptozy komórek wywołanej chemikaliami umieść jedną płytkę razy 10 do sześciu komórek Sf9 w każdym dołku płytki sześciodołkowej.Pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut, a następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem podłoża galwanicznego. Transfekować komórki czterema mikrogramami każdego plazmidowego DNA. Po pięciu godzinach zastąp pożywkę galwaniczną jednym mililitrem pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Następnie szok cieplny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Inkubuj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin po szoku cieplnym. Następnie potraktuj transfekowane komórki aktynomycyną D w celu wywołania apoptozy.Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 16 godzin przed przeprowadzeniem testu żywotności komórek. Rozpocznij tę procedurę od umycia leczonych komórek. Usuń pożywkę z każdej studzienki, dodaj jeden mililitr PBS i pozostaw na jedną minutę.W ten sposób przemyć komórki trzykrotnie PBS. Ponownie zawiesić komórki w każdej studzience jednym mililitrem PBS zawierającym 04% błękitu trypanowego i barwić w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge.Przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek zabarwionej na niebiesko trypanem do hemacytometru i policz żywotne nienaruszone komórki pod mikroskopem świetlnym. Na koniec przeprowadź analizę statystyczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pełna długość i dwa obcięcia IAP3 z Lymantria xylina MNPV uległy nadekspresji w komórkach Sf9, a Western blot przeprowadzono na lizatach komórkowych w celu potwierdzenia ekspresji białka.Białko antyapoptotyczne Ac-P35 włączono jako kontrolę pozytywną. Wszystkie białka można było wykryć w transfekowanych komórkach po jednej godzinie lub pięciu godzinach po szoku cieplnym, z wyższą ekspresją po pięciu godzinach. System ten można dostosować do oceny aktywności antyapoptotycznej.W przypadku apoptozy komórek indukowanej genami, induktor apoptozy Drosophila Reaper został poddany jednoczesnej transfekcji z docelowymi konstruktami plazmidowymi genów do komórek Sf9, które następnie poddano szokowi cieplnemu w celu aktywacji ekspresji genów. W porównaniu z wektorem Drosophila Reaper, kontrola pozytywna wykazała wysoką aktywność antyapoptotyczną, sięgającą nawet 80% wskaźnika żywotności. Pozostałe konstrukty wykazywały różny wpływ na aktywność antyapoptotyczną.W przypadku apoptozy komórek wywołanej substancją chemiczną tylko jeden konstrukt został transfekowany do komórek Sf9, a aktynomycynę D dodano pięć godzin po szoku cieplnym. W porównaniu z kontrolą pozytywną lub kontrolą negatywną, pozostałe konstrukty wykazywały różny wpływ na aktywność antyapoptozą. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o przestrzeganiu zasad działania hodowli komórkowej w przepływie laminarnym i dokładnym sprawdzaniu stanu komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak koimmunoprecypitacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy istnieje jakakolwiek interakcja między dwoma białkami ulegającymi koekspresji w komórkach owadów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biotechnologii do badania funkcji białek w organizmach zwierzęcych lub mikroorganizmach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tego systemu do ekspresji obcego białka lub oceny potencjalnie funkcjonalnie antagonistycznych białek w komórkach owadów. Nie zapominaj, że praca z niektórymi chemikaliami, takimi jak aktynomycyna D, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

Poznaj system ekspresji białek indukowanej szokiem cieplnym w komórkach Sf9 do oceny aktywności antyapoptotycznej obcych białek. Ta metoda pozwala kontrolować czas ekspresji genu i badać funkcje białek.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

Przeglądaj więcej filmów