Name: Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: Poznaj technikę przezskórnej iniekcji domięśniowej pod kontrolą echokardiografii z kontrastem w sercu królika. Ta metoda umożliwia bezpieczne dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sheili Monfort, Brendzie Martínez, Carlosowi Micó, Alberto Muñozowi i Manuelowi Molinie za doskonałe wsparcie podczas zbierania danych, oraz Carlosowi Bueno za dostarczenie komórek EGFP(+) HEK-293. Prace te były częściowo wspierane przez: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Hiszpania (JT) (numer grantu: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I+D+I 2008-2011 (Grant nr. RD12/0019/0001) (JMM), współfinansowany ze środków funduszy strukturalnych Unii Europejskiej (FEDER) (JMM); oraz University of Reading, Wielka Brytania (AG, GB) (Finansowanie Centralne). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Opisane w niniejszym dokumencie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Uniwersytetu w Murcii w Hiszpanii i przeprowadzono je zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE Komisji Europejskiej. Opisane etapy zostały wykonane zgodnie ze standardowymi protokołami operacyjnymi, które stanowiły część planu pracy i nie zostały przeprowadzone wyłącznie w celu nagrania filmu towarzyszącego niniejszej publikacji.
1. Przygotowanie komórek i ssaczego wektora ekspresyjnego
UWAGA: W tym miejscu krótko opisujemy protokół przygotowania i transfekcji linii komórkowej (ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293 (HEK-293)); należy jednak zoptymalizować odpowiednie protokoły specyficzne dla badanego typu komórek (np. komórek macierzystych).
<ol>
	<li>Hodować komórki HEK-293 w pożywce Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Po osiągnięciu przez komórki stanu subkonfluencji, przeprowadzić pasaż w stosunku 1:3.</li>
	<li>Rozpocząć pasażowanie komórek poprzez odessanie pożywki, a następnie jednokrotne przemycie sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Usunąć nadmiar PBS, a następnie inkubować z 2,5 mL 0,5x trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (5 min, 37 °C).
	<ol>
		<li>Dodać taką samą objętość pożywki DMEM (uzupełnionej zgodnie z powyższym opisem), aby zatrzymać reakcję, a następnie odczepić komórki poprzez powolne i delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety elektronicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przenieść zawiesinę komórkową do odpowiedniego naczynia (np. stożkowej probówki wirówkowej 15-50 mL). Wirować w rotorze z koszyczkami (100 x g), odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć osad sterylnym PBS.</li>
	<li>Resuspendować osad w świeżej pożywce DMEM i wysiać z odpowiednią gęstością komórek (np. 1 x 106 komórek w kolbie 75 cm2) do świeżych kolb hodowlanych lub dużych szalek, zgodnie z lokalnymi praktykami laboratoryjnymi.
	<ol>
		<li>Wymieniać istniejącą pożywkę na świeżą co 2 dni. 
		UWAGA: Wektor ekspresyjny został wyprowadzony z pIRES1hyg i stosowany zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano wcześniej21. p(EGFP) IRES1hyg został wygenerowany poprzez subklonowanie cDNA EGFP jako insertu BamHI + NotI z pEGFP-N1 do pIRES1hyg trawionego BamHI + NotI21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 dzień przed transfekcją wysiać komórki HEK-293 z gęstością 0,5 x 105 komórek/cm2 na 12- lub 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.</li>
	<li>W dniu transfekcji przygotować kompleksy odczynnika do transfekcji DNA-lipid w oddzielnych probówkach do mikrocentryfugi 1,5 mL (1 probówka na dołek).
	<ol>
		<li>Zacząć od dodania 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do każdej probówki, a następnie dodać 4 µg DNA (delikatnie wymieszać).</li>
		<li>Następnie do każdej probówki dodać 250 µL wcześniej przygotowanej mieszaniny 10 µL odczynnika do transfekcji lipidowej i 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy (ponownie delikatnie wymieszać).</li>
		<li>Na koniec przeprowadzić transfekcje, inkubując komórki HEK-293 z kompleksami odczynnika do transfekcji DNA-lipid przez 4 h, a następnie zastąpić pożywkę pożywką DMEM uzupełnioną zgodnie z powyższym opisem (krok 1.1) i inkubować przez kolejne 48 h. Przeprowadzić selekcję lekową stabilnych transfektantów za pomocą 100 µg/mL hygromycyny B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczepić komórki HEK-293 za pomocą trypsyny zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2). Po przemyciu komórek sterylnym PBS, resuspendować w odpowiednim nośniku (np. 10% v/v InI w PBS), aby uzyskać końcowe stężenie komórek 5 x 106/mL.</li>
</ol>
2. Przygotowanie królika
UWAGA: Pozycjonowanie królika oraz przetwornika podczas IMI nie jest optymalne do oceny morfologii i funkcji serca zwierzęcia. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie pełnego badania echokardiograficznego20 przed IMI (patrz poniżej), a następnie w kolejnych punktach czasowych określonych w planie eksperymentalnym. Celem tych działań będzie ocena bazowych cech anatomicznych i funkcjonalnych serca u zwierzęcia, które otrzyma wstrzyknięcie, a także ocena wpływu IMI na funkcję serca.
<ol>
	<li>Przeprowadź badanie metodą ślepą, zgodnie z wytycznymi Komitetu Echokardiografii Amerykańskiego Kolegium Medycyny Wewnętrznej Weterynaryjnej oraz Amerykańskiego Towarzystwa Echokardiografii/Europejskiego Stowarzyszenia Obrazowania Serca i Naczyń22,23,24.</li>
	<li>Zapewnij jednoczesny zapis jednokanałowego elektrokardiogramu (EKG) przez cały czas trwania badania echokardiograficznego.</li>
	<li>Zanestezjuj królika za pomocą ketaminy w dawce 10 mg/kg w połączeniu z medetomidyną w dawce 200 µg/kg, podając preparaty w zastrzyku domięśniowym (I.M.).</li>
	<li>Sprawdź poziom znieczulenia po 10-20 min od podania leków anestetycznych.</li>
	<li>Używając maszynki do strzyżenia, usuń szeroko sierść z klatki piersiowej (np. od poziomu szyi do obszaru podmieczowatego) (Rysunek 1A).</li>
	<li>Wygolij dodatkowe obszary o powierzchni 1-2 cm2 na wewnętrznej stronie prawej kończyny przedniej (obszar przyśrodkowy stawu łokciowego) oraz obu kończyn tylnych (obszar przyśrodkowy stawu skokowego) (Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść przylepne elektrody EKG na wygolonych obszarach kończyn, aby synchronicznie monitorować rytm serca podczas procedury (Rysunek 1C).</li>
	<li>Umieść zwierzę w pozycji grzbietnej na kocu termicznym, z kończynami wyciągniętymi i przymocowanymi do stołu za pomocą taśmy chirurgicznej (Rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że uszy są odgięte do tyłu za głową/grzbietem królika i znajdują się niżej niż kończyny przednie, ponieważ pomaga to utrzymać prawidłową pozycję klatki piersiowej zwierzęcia przez cały czas trwania procedury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw zwierzę w oddychaniu spontanicznym, podając tlen przez maskę przez cały czas trwania procedury (100%, 2-3 L/min).</li>
</ol>
<img alt="Przygotowanie zwierzęcia do badania USG, dłonie w rękawiczkach, ogolona skóra, głowica USG, procedura weterynaryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie królika do IMI. (A) Wystrzyganie włosów z klatki piersiowej; (B) Wystrzyganie włosów z kończyn; (C) Mocowanie elektrod i ułożenie królika z wyciągniętymi nogami na kocyku termicznym. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Technika IMI pod kontrolą przezskórnej echokardiografii kontrastowej u królika
<ol>
	<li>Oczyścić i zdezynfekować skórę klatki piersiowej roztworem na bazie chlorheksydyny.
	<ol>
		<li>Przez cały czas trwania procedury należy stosować techniki aseptyczne, zgodnie z aktualnymi najlepszymi praktykami.</li>
		<li>W miarę możliwości i jeśli jest to racjonalnie wykonalne, należy przeprowadzić procedurę w warunkach pełnej sterylności, obejmującą w szczególności stosowanie materiałów sterylnych, takich jak fartuchy, rękawiczki, chirurgiczne obłożenia pola operacyjnego, sterylne podkłady na stół, a także sterylną osłonę przetwornika ultradźwiękowego i sterylny żel do USG. Pozwoli to zminimalizować ryzyko wprowadzenia patogenów do zwierzęcia poddawanego IMI i stanowi standardową praktykę w warunkach klinicznych (np., podczas punkcji serca). 
		UWAGA: Zaleca się, aby zawsze postępować zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi badań na zwierzętach, obowiązującymi w danej instytucji oraz kraju, w którym prowadzona jest praktyka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś żel transmisyjny do USG na klatkę piersiową i/lub na przetwornik, a następnie, owijając kabel przetwornika wokół szyi eksperymentatora, wykonaj szybkie badanie przesiewowe serca zwierzęcia w oknie akustycznym, co często ułatwia wizualizację anatomii i planowanie procedury IMI.</li>
	<li>Umieść przetwornik ręcznie w pozycji 4th-6th przestrzeń międzyżebrowa, 2–3 cm od prawej linii przymostkowej pod kątem padania ok. 90° w odniesieniu do prawej strony ściany klatki piersiowej (Rycina 2A).</li>
	<li>Dostosuj położenie przetwornika względem przestrzeni międzyżebrowej, a także jego kąt przednio-tylny i grzbietowo-brzuszny, aby zoptymalizować zmodyfikowany przekrój w osi krótkiej na poziomie mięśni papilarnych. Zidentyfikuj w tym przekroju prawą komorę (RV), lewą komorę (LV), przegrodę międzykomorową (IVS), ścianę tylną (PW) oraz przednio-boczne (AL) i tylno-przyśrodkowe (PM) mięśnie papilarne (Rycina 2B).
	<ol>
		<li>Uzyskaj szerokie pole widzenia poprzez znaczne zwiększenie głębokości za pomocą odpowiedniego sterownika w systemie (np., przycisk, pokrętło).</li>
		<li>Należy zwrócić szczególną uwagę na uzyskanie symetrycznego obrazu w tym rzucie, a także na odpowiednie zróżnicowanie konturów wsierdzia i osierdzia i w razie potrzeby skorygować je za pomocą elementów sterujących optymalizacją obrazu (np., wzmocnienie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po uzyskaniu optymalnego obrazu echokardiograficznego (Rycina 2B), należy utrzymać tę pozycję przez cały pozostały czas trwania procedury, podczas gdy drugi operator wykonuje IMI (patrz poniżej).
	<ol>
		<li>Podczas trzymania przetwornika należy unikać zasłaniania znacznika orientacji, który powinien być zawsze skierowany do przodu, co umożliwi jego wyrównanie z igłą w kolejnych krokach (Rycina 2A, C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą igły 24 G przymocowanej do strzykawki 1 ml umieść igłę blisko skóry lewej połowy klatki piersiowej, w pozycji symetrycznego odbicia względem przetwornika. Następnie ręcznie wyrównaj igłę z oznaczeniem orientacji przetwornika pod kątem ok. 90° (Rycina 2C), a następnie powoli przesuwaj igłę przez skórę do jamy klatki piersiowej. 
	UWAGA: Przezskórne wprowadzenie igły w tej pozycji i orientacji ułatwia wizualizację igły w płaszczyźnie wiązki ultradźwięków (Rycina 2D, E), co umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i, w razie potrzeby, korektę położenia igły względem docelowego obszaru mięśnia sercowego (Rycina 2G, H).</li>
	<li>Po umieszczeniu końcówki w docelowym miejscu, powoli podać wstrzykiwaną substancję (do 0,25 ml na miejsce wstrzyknięcia) w czasie od 10 do 30 s (Rysunek 2E), powoli i delikatnie wycofując igłę podczas wstrzykiwania, aby zwiększyć zakres opracowanego mięśnia sercowego.
	<ol>
		<li>Do standaryzacji techniki oraz jako... należy użyć InI 10% (v/v) rozcieńczonego w PBS, a także jako... in situ znacznika w trakcie nabywania biegłości, a także w celu potwierdzenia skutecznego celowania we wszystkie cztery miejsca IMI w obrębie mięśnia sercowego za pomocą badania makroskopowego i histopatologicznego (patrz Reprezentatywne wyniki). Po osiągnięciu biegłości, InI można zastąpić odpowiednim komercyjnym środkiem kontrastowym do USG, jeśli jest to pożądane. 
		UWAGA: Podanie do mięśnia sercowego 10% (v/v) InI rozcieńczonego w PBS, z komórkami lub bez, skutkuje transmuralną hiperechogenicznością (t.j., echogenny wygląd) w miejscu wstrzyknięcia (Rysunek 2E, F). Przejściowe spowolnienie lub przyspieszenie częstotliwości akcji serca, związane z dodatkowymi skurczami komór (np., pojedyncze, dublety i triplety) są często obserwowane już od pierwszego kontaktu igły z epicardium, a także w trakcie i/lub krótko po IMI. Jednakże nie rozwijają się arytmie zagrażające życiu, a ostre działania niepożądane są rzadko obserwowane przy zastosowaniu do 0,25 ml (1,25 x 106 komórek) preparatu do wstrzyknięcia na miejsce wstrzyknięcia domięśniowego (patrz Reprezentatywne wyniki i Dyskusja).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby wprowadź subtelne zmiany w kącie nachylenia igły, aby zakończyć iniekcje 0,25 ml do każdego z czterech docelowych miejsc IMI (trzech w wolnej ścianie lewej komory (LVFW) i jednego w IVS).</li>
	<li>Po zakończeniu procedury IMI prowadzonej pod kontrolą przezskórnej echokardiografii z kontrastem, należy ocenić rytm serca (np., za pomocą seryjnych zapisów EKG i/lub 24-godzinnego monitorowania Holterem), a następnie przeprowadzić seryjne badanie echokardiograficzne w oknie w celu zweryfikowania braku powikłań, aż do pełnego wybudzenia zwierzęcia z narkozy, a dopiero wtedy przenieść je do pomieszczenia z cyklem światła.
	<ol>
		<li>W niniejszym badaniu zastosowano 24-godzinne monitorowanie EKG metodą Holtera w celu oceny wpływu IMI z InI na rytm serca w ciągu 24 h. W tym celu porównano grupę 6 królików o prawidłowym fenotypie (grupa kontrolna) oraz grupę 6 królików, którym podawano dożylnie doksorubicynę (kardiotoksyczny lek z grupy antracyklin, powszechnie stosowany w leczeniu nowotworów; grupa DOX) w dawce 2 mg/kg/tydzień przez 8 tygodni, a następnie obie grupy otrzymywały IMI z InI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat obrazowania ultradźwiękowego i rozmieszczenia sondy do analizy funkcji serca w modelu zwierzęcym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przezskórne wstrzykiwanie domięśniowe w sercu królika pod kontrolą echokardiografii kontrastowej. (A) Rozmieszczenie przetwornika w prawym hemitoraksie pod kątem ~ 90°. (B) Reprezentacyjny obraz przekroju krótkiej osi przymostkowej (PSSX) serca na poziomie mięśni brodawkowych u królika. (C) Ustawienie igły pod kątem ~ 90° względem znacznika orientacji przetwornika. (D) Położenie igły w miejscu docelowym w widoku PSSX serca (należy zauważyć, że igła jest łatwo widoczna w płaszczyźnie wiązki ultradźwiękowej). (E i F) Demonstracja hiperechogeniczności w miejscu docelowym po wstrzyknięciu domięśniowym tuszu indyjskiego (groty strzałek wskazują transmuralną hiperechogeniczność). (G) Przypadkowe umieszczenie igły w jamie LV (groty strzałek wskazują trzon igły). (H) Repozycjonowanie igły do wolnej ściany LV (groty strzałek wskazują trzon igły). RV = prawa komora; LV = lewa komora; IVS = przegroda międzykomorowa; PW = ściana tylna; AL = mięsień brodawkowy przednio-boczny; PM = mięsień brodawkowy tylno-przyśrodkowy. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Analizy po IMI
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę histopatologiczną próbek tkanki serca królików.
	<ol>
		<li>Utrwalić tkankę przez 24 h w 10% formaldehydzie, a następnie odwodnić w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu w następujący sposób: 
		• 1x w 70% (60 min) 
		• 1x w 95% etanolu/5% metanolu (60 min) 
		• 1x w 100% (60 min) 
		• 1x w 100% (90 min) 
		• 1x w 100% (120 min) 
		UWAGA: Wszystkie powyższe inkubacje przeprowadza się w temperaturze pokojowej (RT). Następnie dwukrotnie zastąpić ksylenem 100% (1 h, RT), a na koniec zalać parafiną w dwóch etapach (60 min, 58 °C)25.</li>
		<li>Wyciąć skrawki tkanki o grubości 4-5 µm przy użyciu mikrotomu25. Nanieść skrawki na szkiełka.</li>
		<li>Przeprowadzić barwienie metodą hematoksylino-eozyną oraz metodą trichromem Massona25,26,27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W skrawkach tkanki z przeszczepionych serc przeprowadzić immunohistochemię w celu wykrycia komórek EGFP(+) HEK-293 (np. stosując metodę kompleksu awidyna-biotyna (ABC)), w skrócie:
	<ol>
		<li>Odparafinować skrawki serca o grubości 4-5 µm w ksylenie 100% (10 min, w RT). Rehydratyzować tkankę, płucząc w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (2x w 100% (2 min); 2x w 95% (2 min); 1x w 70% (2 min); 1x w 50% (2 min); 1x w 30% (2 min); 1x ddH2O (2 min)) w RT.</li>
		<li>Przeprowadzić inhibicję endogennej peroksydazy, pokrywając skrawki 100 µL 3% H2O2 rozcieńczonego w metanolu (przygotowanego z 5 mL 30% roztworu stokowego H2O2 i dodania metanolu do całkowitej objętości 50 mL) (inkubować 30 min, RT), a następnie przemyć poprzez imersję w buforze solnym Tris (TBS; pH 7.6).</li>
		<li>Przeprowadzić odsłanianie antygenów poprzez traktowanie enzymatyczne, pokrywając skrawki 100 µL 0,1% Pronazy (przygotowanej z 0,01 g Pronazy rozpuszczonej w 10 mL TBS) (inkubować 12 min, RT), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Inkubować w roztworze blokującym (normalna surowica kozia w stężeniu 10% w TBS), stosując 100 µL na szkiełko (30 min, RT), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem przeciwko zielonemu białku fluorescencyjnemu (GFP) pochodzenia kurczego jako przeciwciałem pierwszorzędowym (1:500 w TBS) (1 h, 30 °C), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Inkubować z biotynilowanym przeciwciałem wtórnym anty-IgG kurczym pochodzenia koziego (1:250 w TBS) (1 h, 30 °C), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Inkubować z kompleksem awidyna-biotyna (20 min, 30 °C), a następnie znakować przy użyciu tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (RT, 5-10 min).</li>
		<li>Na koniec odwodnić, płucząc w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu (1x w 30% (2 min); 1x w 50% (2 min); 1x w 70% (2 min); 2x w 95% (2 min); 2x w 100% (2 min)) w RT, dobarwić skrawki metodą hematoksylino-eozyną25, a następnie przykryć szkiełka lamellkami. Uwzględnić kontrole pozytywne, negatywne oraz izotypowe. 
		UWAGA: Powyższy skrócony protokół nie jest przeznaczony do ogólnego zastosowania w immunohistochemii; niezbędna jest optymalizacja dla danej tkanki i warunków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem było opracowanie minimalnie inwazyjnej techniki, która mogłaby być wykorzystana do dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego królików (duży przedkliniczny model zwierzęcy)17,18, przy jednoczesnym wykorzystaniu stosunkowo niedrogiego systemu obrazowania łatwo dostępnego w wielu ośrodkach klinicznych i badawczych. Tutaj pokazujemy, że przy użyciu klinicznego systemu echokardiografii i wspomaganego przez InI, powszechnie dostępny środek, ...

Terapie komórkowe i genowe są ekscytujące i stale rozwijają strategie regeneracji/naprawy uszkodzonego mięśnia sercowego w HFrEF. W kilku badaniach porównano skuteczność (np. wskaźnik retencji komórek) różnych dróg dostarczania komórek, które konsekwentnie wykazały wyższość IMI nad drogami dodonośnymi lub dożylnymi1,2,3,4,5. Nic więc dziwnego, że duża część badań nad translacyjnymi modelami terapii komórkami macierzystymi uszkodzonego mięśnia sercowego, dostarcza zastrzyk za pośrednictwem IMI wykonywany pod bezpośrednim widokiem w procedurze otwartej klatki piersiowej6,7. Podejście to ma jednak kilka ograniczeń, w tym inwazyjny charakter procedury, która niesie ze sobą ryzyko śmiertelności okołozabiegowej (często zaniżonej)8. Ponadto IMI w bezpośrednim widoku nie wyklucza możliwości przypadkowego wstrzyknięcia do jamy komorowej. W praktyce klinicznej IMI podczas operacji otwartej klatki piersiowej może być odpowiednią metodą dostarczania komórek terapeutycznych, np. podczas operacji pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG); jednak takie podejście może nie być odpowiednie do dostarczania komórek w kardiomiopatii globalnej pochodzenia nieniedokrwiennego (np. HFrEF wtórna do kardiomiopatii indukowanej antracyklinami (AICM)).
Nie ma wątpliwości, że choroba niedokrwienna serca (IHD) jest najczęstszą przyczyną HFrEF (~ 66%)9,10; jednak kardiomiopatia nieniedokrwienna, w tym AICM, nadal dotyka znaczną część pacjentów z HFrEF (33%)9. Rzeczywiście, ostatnie postępy w onkologii klinicznej spowodowały, że w samych Stanach Zjednoczonych ponad 10 milionów osób, które przeżyły raka11, z szacunkami podobnej liczby w Europie, co jest zgodne z ogólnym trendem w kierunku poprawy przeżywalności pacjentów z rakiem12,13. W związku z tym badanie korzyści płynących z nowych terapii, takich jak przeszczep komórek macierzystych w kardiomiopatii nieniedokrwiennej, a także testowanie skutecznej i minimalnie inwazyjnej drogi dostarczania komórek macierzystych ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę rosnącą liczbę pacjentów dotkniętych kardiotoksycznością wtórną do leków przeciwnowotworowych.
Warto zauważyć, że badania testujące hipotezy z wykorzystaniem terapii komórkami macierzystymi mającymi na celu naprawę/regenerację uszkodzonego mięśnia sercowego często obejmują użycie małych gryzoni (np. myszy i szczurów). Modele te często wymagają drogich systemów ultrasonograficznych wysokiej częstotliwości do oceny funkcji mięśnia sercowego, zwykle wyposażonych w przetworniki liniowe, które mają pewne nieodłączne powiązane ograniczenia (np. pogłos)14. Jednak inne modele, takie jak króliki, reprezentujące duży model przedkliniczny, mają pewne zalety w testowaniu hipotez terapii komórkami macierzystymi w HFrEF. Tak więc, w przeciwieństwie do szczurów i myszy, króliki utrzymują system transportu Ca+2 i elektrofizjologię komórkową, która przypomina system ludzi i innych dużych zwierząt (np. psów i świń)15,16,17,18,19. Kolejną zaletą jest możliwość wykonywania badań ultrasonograficznych serca przy użyciu stosunkowo niedrogich i powszechnie dostępnych systemów echokardiografii klinicznej wyposażonych w przetworniki fazowe o stosunkowo wysokiej częstotliwości, np. 12 MHz, takie jak często stosowane w kardiologii noworodków i dzieci. Systemy te umożliwiają doskonałe obrazowanie echokardiograficzne przy użyciu najnowocześniejszej technologii i wykorzystują przewagę obrazowania harmonicznego20. Ponadto szeroko zakrojone testowanie hipotez dotyczących potencjału terapii regeneracyjnych serca (np. terapii komórkami macierzystymi), ich bezpieczeństwa, skuteczności, potencjału kardiomiogennego, a także ocena losów iniekcji po podaniu do mięśnia sercowego, jest obowiązkowe, zanim będzie można rozważyć ich stosowanie u ludzi, i wymagają one użycia dużych przedklinicznych modeli zwierzęcych, takich jak rabbit17, 19. W tym miejscu opisujemy minimalnie inwazyjną technikę dostarczania komórek za pomocą przezskórnego IMI sterowanego echokardiografią kontrastową przy użyciu klinicznego systemu echokardiografii, który jest ukierunkowany na terapię opartą na przeszczepie komórek macierzystych w kardiomiopatii nieniedokrwiennej20. Opisujemy również korzyści płynące z atramentu India Ink (InI, znanego również jako China Ink) jako ultradźwiękowego środka kontrastowego i znacznika in situ wstrzyknięcia w serce królika.

<table><tbody><tr><td>System ultrasonograficzny HD11 XE</td> System <td>echokardiograficzny 10670267 firmy</td> <td>Philips</td><td></td>.</tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>4-12 MHz przetwornik matrycy fazowej</td></tr><tr><td>Żel do transmisji ultradźwięków (Aquasone)</td><td>Parket laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&nbsp; Cewnik naigłowy</td></tr><tr><td>Omnifix-F 1 ml strzykawka</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene (Ketamina)</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>Konieczna jest recepta weterynaryjna</td></tr><tr><td>Domtor (Medetomidine)</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>Konieczna jest recepta weterynaryjna</td></tr><tr><td>Poduszka</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>Indie (Chiny) Holter atramentowy</td></tr><tr><td>Syneflash</td><td>Ela medyczny</td><td>SF0003044S</td><td>24-godzinny system Holter EKG.</td></tr><tr><td>Elektrody Niebieski Czujnik&reg;</td><td>Elektrody EKG Holter</td> <td>Ambu (NUMED)</td><td>VLC-00-S</td>.</tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olimpus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>Zestaw kompleksu biotyny Avidin.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP kurczaka</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe.</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało IgG przeciwko kurczakowi</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9010</td><td>Przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>Czterochlorowodorek 3,30-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>DAKO (Agilent)</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>S3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>Holter EKG</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 (odczynnik do transfekcji lipidów)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka surowicy (Opti-MEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Calbiochem (MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen (histologiczny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza Fisher</td><td>Scientific</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Terapia komórkowa i genowa to ekscytujące i obiecujące strategie w celu regeneracji serca w warunkach niewydolności serca ze zmniejszoną frakcją wyrzutową (HFrEF). Zanim będą mogły być brane pod uwagę do stosowania i stosowane u ludzi, wymagane są szeroko zakrojone badania przedkliniczne na dużych modelach zwierzęcych w celu oceny bezpieczeństwa, skuteczności i losu wstrzyknięcia (np. komórek macierzystych) po dostarczeniu do mięśnia sercowego. Małe modele gryzoni mają zalety (np. opłacalność, możliwość manipulacji genetycznej); Jednak biorąc pod uwagę nieodłączne ograniczenia tych modeli, wyniki w nich zawarte rzadko przekładają się na praktykę kliniczną. Z drugiej strony, duże modele zwierzęce, takie jak króliki, mają zalety (np. podobną elektrofizjologię serca w porównaniu z ludźmi i innymi dużymi zwierzętami), zachowując przy tym dobrą równowagę ekonomiczną. Tutaj pokazujemy, jak wykonać przezskórną technikę iniekcji domięśniowej serca pod kontrolą echokardiografii kontrastowej (IMI), która jest minimalnie inwazyjna, bezpieczna, dobrze tolerowana i bardzo skuteczna w celowanym dostarczaniu zastrzyków, w tym komórek, do kilku miejsc w mięśniu sercowym modelu królika. Do wdrożenia tej techniki wykorzystaliśmy również powszechnie dostępny system do echokardiografii klinicznej. Po zastosowaniu w praktyce opisanego tutaj protokołu, badacz posiadający podstawową wiedzę ultrasonograficzną stanie się kompetentny w wykonywaniu tej wszechstronnej i małoinwazyjnej techniki do rutynowego stosowania w eksperymentach, mających na celu testowanie hipotez dotyczących możliwości terapii regeneracyjnych serca w modelu królika. Po osiągnięciu kompetencji całą procedurę można wykonać w ciągu 25 minut po znieczuleniu królika.

Przezskórna IMI z użyciem InI pod kontrolą echokardiografii kontrastowej:
Stosując opisany powyżej protokół, po potwierdzeniu echokardiograficznie optymalnego ułożenia końcówki igły i rozpoczęciu wstrzykiwania, podczas podawania InI (10% v/v w PBS) zaobserwowano transmuralną hiperechogeniczność (Rysunek 2E), a także krótko po wykonaniu IMI w obszarze docelowym (...

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i dokładne podanie objętości wstrzyknięcia do mięśnia sercowego lewej komory serca królika. Aby to zrobić, należy skorzystać z kontroli echokardiografii z kontrastem przezskórnym. Osiąga się to poprzez najpierw znieczulenie zwierzęcia, a następnie przygotowanie klatki piersiowej do zabiegu.Następnie, po ułożeniu królika na kocu termicznym i sprawdzeniu, czy sygnał EKG jest prawidłowo wyświetlany, należy za pomocą klinicznego systemu ultrasonograficznego uzyskać odpowiednie okno akustyczne i zoptymalizować obraz w szerokim polu widzenia. Następnie, po załadowaniu strzykawki zaznaczonymi komórkami zmieszanymi z odpowiednim środkiem kontrastowym i pod kontrolą ultrasonograficzną, ostrożnie ustawić igłę naprzeciwko głowicy i ustawić ją blisko skóry lewego półtułowia, przed spowolnieniem przesuwania igły do docelowego obszaru mięśnia sercowego. Na koniec wstrzyknięcie jest bezpiecznie dostarczane, co wykazano przezścienną hiperechogenicznością w miejscu wstrzyknięcia w obrazie echokardiograficznym.Ostatecznie potwierdzenie ex vivo pomyślnego dostarczenia iniekcji wykazuje obecność barwnika w mięśniu sercowym, podczas gdy przekrojowa analiza im

percutaneous-contrast-echocardiography-guided-intramyocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Obecny protokół opisuje trzy metody podawania kardioaktywnych środków terapeutycznych w modelu świniowym. Samice świń rasy lądowej otrzymywały leczenie poprzez: (1) torakotomię i wstrzyknięcie przeznasierdziowe, (2) wstrzyknięcie przezwsierdziowe za pomocą cewnika lub (3) wlew dożylny za pomocą minipompy osmotycznej żyły szyjnej.

Dostarczanie terapii kardioaktywnej w modelu zawału mięśnia sercowego u świń

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wycięcie części kości z żebra myszy. Procedura została opracowana jako model do badania naprawy kości długich na dużą skalę.

Zabieg chirurgiczny resekcji żebra myszy: model do naprawy kości długich na dużą skalę

Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych są użytecznymi modelami ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Poniżej przedstawiamy wysokoprzepustowy system przesiewowy do ilościowego określania wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i wielodołkowego czytnika płytek do obrazowania z kontrolowaną temperaturą.

Skurcze syncytii kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC mierzone za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca na płytkach 384-dołkowych o kontrolowanej temperaturze

Opisujemy zabieg chirurgiczny stosowany do wywołania niedokrwienia obwodowego u królików z hiperlipidemią i cukrzycą. Operacja ta działa jako model przedkliniczny dla stanów doświadczanych w chorobie tętnic obwodowych u pacjentów. Angiografia jest również opisywana jako sposób pomiaru stopnia wprowadzonego niedokrwienia i odzyskania perfuzji.

Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Poznaj technikę przezskórnej iniekcji domięśniowej pod kontrolą echokardiografii z kontrastem w sercu królika. Ta metoda umożliwia bezpieczne dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w badaniach przedklinicznych.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym (Wideo) | JoVE Journal

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Przeglądaj więcej filmów