Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i dokładne podanie objętości wstrzyknięcia do mięśnia sercowego lewej komory serca królika. Aby to zrobić, należy skorzystać z kontroli echokardiografii z kontrastem przezskórnym. Osiąga się to poprzez najpierw znieczulenie zwierzęcia, a następnie przygotowanie klatki piersiowej do zabiegu.

Następnie, po ułożeniu królika na kocu termicznym i sprawdzeniu, czy sygnał EKG jest prawidłowo wyświetlany, należy za pomocą klinicznego systemu ultrasonograficznego uzyskać odpowiednie okno akustyczne i zoptymalizować obraz w szerokim polu widzenia. Następnie, po załadowaniu strzykawki zaznaczonymi komórkami zmieszanymi z odpowiednim środkiem kontrastowym i pod kontrolą ultrasonograficzną, ostrożnie ustawić igłę naprzeciwko głowicy i ustawić ją blisko skóry lewego półtułowia, przed spowolnieniem przesuwania igły do docelowego obszaru mięśnia sercowego. Na koniec wstrzyknięcie jest bezpiecznie dostarczane, co wykazano przezścienną hiperechogenicznością w miejscu wstrzyknięcia w obrazie echokardiograficznym.

Ostatecznie potwierdzenie ex vivo pomyślnego dostarczenia iniekcji wykazuje obecność barwnika w mięśniu sercowym, podczas gdy przekrojowa analiza immunohistochemiczna skrawków tkanki mięśnia sercowego służy do wykazania pomyślnego dostarczenia markera komórkowego i barwnika do docelowego mięśnia sercowego. Celem tego filmu jest pokazanie, jak bezpiecznie i dokładnie wykonać tę technikę, jak to możliwe, na dzisiejszym króliku, przy użyciu systemu echokardiografii klincznej. Głównymi zaletami tej techniki są minimalny i podstawowy charakter maszyny oraz możliwość wykorzystania echokardiografii kontrastowej do precyzyjnej wizualizacji docelowych miejsc iniekcji, zmniejszając w ten sposób do minimum ryzyko przypadkowego podania międzykomorowego.

Przed przystąpieniem do wstrzyknięcia do mięśnia sercowego należy rozpocząć od wstrzyknięcia kombinacji ketaminy i medetomidyny w celu znieczulenia zwierzęcia. Jak wykazano, królik zachowuje spokój, gdy głowa jest przykryta kocem chirurgicznym. Po znieczuleniu zwierzęcia użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć włosy ze skóry klatki piersiowej, zaczynając poniżej szyi, a następnie przechodząc do obszaru podmieczykowatego.

Ogol dodatkowe obszary od jednego do trzech centymetrów wewnętrznej powierzchni prawej kończyny przedniej, a także przyśrodkowe obszary piszczelowe zarówno prawej, jak i lewej kończyny tylnej. Następnie nałóż odpowiedni żel przewodzący na elektrody i umieść je w ogolonych obszarach kończyn. Przymocuj elektrody taśmą chirurgiczną, aby zapobiec utracie kontaktu podczas przemieszczania zwierzęcia podczas zabiegu.

Następnie umieść zwierzę na kocu termicznym, sprawdź, czy na ekranie systemu wyświetlany jest prawidłowy sygnał EKG, utrzymuj zwierzę w pozycji odleżynowej na plecach i pozwól zwierzęciu na spontaniczne oddychanie podczas podawania tlenu przez maskę na twarz przez cały czas trwania zabiegu. Dokładnie oczyść i zdezynfekuj ogoloną skórę klatki piersiowej roztworem na bazie chlorheksydyny. Aby utrzymać dobry kontakt skóry z głowicą oraz zredukować artefakty i poprawić ogólną jakość obrazowania, nałóż na głowicę odpowiednią ilość żelu ultradźwiękowego.

Następnie ręcznie umieść przetwornik w czwartej do szóstej przestrzeni międzyżebrowej w odległości od dwóch do trzech centymetrów od prawej linii przymostkowej i pod kątem padania wiązki ultradźwiękowej około 90 stopni w stosunku do ściany klatki piersiowej. Upewnij się, że znacznik orientacji przetwornika jest skierowany do przodu, aby ułatwić jego wyrównanie z igłą w kolejnych krokach. Powinieneś uzyskać przymostkowy widok serca w krótkiej osi na poziomie mięśni brodawkowatych.

A ważne jest, aby mieć szerokie pole widzenia poprzez zwiększanie głębokości przy odpowiednim sterowaniu w systemie. W razie potrzeby dostosuj położenie przetwornika względem przestrzeni międzyżebrowej, a także jego kąta przednio-tylnego i grzbietowo-brzusznego, aby zoptymalizować obraz, a następnie zidentyfikuj w tym widoku prawą brzuszną, RV, lewą brzuszną, LV, przegrodę międzykomorową, IVS, ścianę tylną, PW, a także mięśnie brodawkowate przednio-przyśrodkowe. Zwróć szczególną uwagę, aby uzyskać symetryczny obraz w tym widoku, a także odpowiednie różnicowanie wykrzywień wsierdzia i nasierdzia, a jeśli to konieczne, dostosuj za pomocą elementów sterujących optymalizacją obrazu, takich jak kontrola wzmocnienia.

Po uzyskaniu prawidłowego obrazu echokardiograficznego należy utrzymać tę pozycję przez resztę zabiegu, podczas gdy drugi operator wykonuje wstrzyknięcie do mięśnia sercowego. W tym celu należy użyć fabrycznie załadowanej strzykawki z dołączoną igłą, którą należy umieścić blisko skóry lewego półprzewodnika w symetrycznym położeniu lustrzanym w stosunku do przetwornika. Następnie ręcznie wyrównaj igłę ze znacznikiem orientacji przetwornika pod kątem około 90 stopni i powoli przesuwaj igłę przez skórę do jamy klatki piersiowej.

Przezskórne wprowadzenie igły w tej pozycji i orientacji umożliwia wizualizację igły w płaszczyźnie wiązki ultradźwiękowej, umożliwiając w ten sposób monitorowanie w czasie rzeczywistym, a w razie potrzeby dostosowanie położenia igły względem docelowego obszaru mięśnia sercowego, jak pokazano tutaj. Zwróć uwagę na tym obrazie na obecność igły w lewej komorze komory, pokazaną przez groty strzałek. Można go łatwo przestawić, delikatnie chowając i przestawiając igłę w żądane miejsce.

Trzymając końcówkę w miejscu docelowym, powoli podawaj wstrzyknięcie przez okres od 20 do 30 sekund, jednocześnie powoli i delikatnie cofając igłę, aby zwiększyć zakres leczonego mięśnia sercowego. Wykonaj subtelne zmiany kąta padania igły, jeśli jest to konieczne, aby zakończyć wstrzyknięcia w czterech miejscach wstrzyknięcia do mięśnia sercowego. Jeden w przegrodzie śródkomorowej i trzy w wolnej ścianie lewej komory i dostarczyć objętość 250 mikrolitrów iniekcji na miejsce wstrzyknięcia.

Po zakończeniu zabiegu kontynuuj monitorowanie dwuseryjnych skanów echokardiograficznych okna królika, a także zapisów EKG w celu sprawdzenia braku powikłań wtórnych do zabiegu, aż zwierzę całkowicie wybudzi się ze znieczulenia. Wskazane jest stosowanie 24-godzinnego monitorowania EKG metodą Holtera, aby pomóc w określeniu wpływu iniekcji domięśniowych na rytm serca. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, po potwierdzeniu echokardiografii wewnątrzmięśniowego ułożenia końcówki igły i rozpoczęciu wstrzyknięcia, zaobserwowano przezścienną hiperechogeniczność podczas dostarczania atramentu indyjskiego do obszaru docelowego w tym przymostkowym widoku krótkiej osi, białe groty strzałek.

Hiperechogeniczność zaobserwowano również wkrótce po wstrzyknięciu, jak pokazano w tym przymostkowym widoku serca o długiej osi, gdzie wyraźnie widać jasny obraz echa na białych grotach strzałek przegrody międzykomorowej. Kiedy bezpośrednio po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego nastąpiła eutanazja, złogi tuszu indyjskiego były łatwo widoczne podczas zewnętrznego badania serca, jak pokazano na tym obrazie. Czarne groty strzał.

Podobnie, skrawki tkanki serca na poziomie mięśni brodawkowatych ujawniły przezścienne złogi tuszu indyjskiego w wolnej ścianie lewej brzusznej, czarnych grotów strzał, demonstrując wydajne i skuteczne dostarczanie zastrzyku do mięśnia sercowego. Na tym samym zdjęciu osad atramentu indyjskiego był również widoczny w przegrodzie międzykomorowej. Biała strzałka.

Chociaż zabieg był ogólnie dobrze tolerowany, bardzo często obserwowano przejściowe przyspieszenie lub spowolnienie akcji serca, związane z izolowanymi przedwczesnymi skurczami komorowymi, PCV, zarówno w trakcie, jak i krótko po zabiegu. Rzeczywiście, monitorowanie za pomocą 24-godzinnego EKG Holtera u zwierząt, które otrzymały wstrzyknięcie do mięśnia sercowego tuszem indyjskim, ujawniło, że arytmie były bardzo częste i że na ich względną częstość może mieć wpływ podstawowy stan fizjologiczny zwierzęcia. Na zdjęciu przedstawiono przykład izolowanego PVC, najczęściej obserwowanej arytmii, wykrywanej podczas monitorowania holterowskiego.

Porównanie między grupą królików o prawidłowym fenotypie a grupą królików, którym podawano dożylnie doksorubicynę lub DOX, lek kardiotoksyczny i przeciwnowotworowy, przez osiem tygodni. Przed wstrzyknięciem do mięśnia sercowego z tuszem indyjskim wskazano, że izolowane PVC występowały znacznie częściej w grupie DOX. Inne arytmie wykryte w holterowskim monitorowaniu EKG w obu grupach to kuplety PVC, trojaczki PVC i nieutrzymujący się częstoskurcz komorowy.

Co istotne, podczas gdy średnie tętno w grupie normalnej i DOX było porównywalne, odchylenie standardowe normy do normy, interwały R do R lub SDNN, miara nieliniowej dynamiki związanej ze stanem zdrowia serca, wykazywało wyraźne zmniejszenie w grupie leczonej doksorubicyną. Przed zabiegiem udana transfekcja wzmocnionego białka zielonej fluorescencji, komórek znakowanych eGFP, została potwierdzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w warunkach hodowli komórkowych in vitro. Następnie, po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego, po którym bezpośrednio nastąpiła eutanazja, wykazano pomyślne dostarczenie komórek oznaczonych eGFP dodatnim do mięśnia sercowego za pomocą analizy immunohistochemicznej skrawków tkanki serca.

Tak więc, jak pokazano na tym obrazie, w mięśniu sercowym znajdowały się liczne oznaczone komórki. Czarne groty strzał, przeplatane osadami atramentu indyjskiego. Złogi atramentu indyjskiego i liczne komórki eGFP dodatnie, białe groty strzał, były nadal obecne, gdy eutanazja została opóźniona o 24 godziny po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego.

Warto zauważyć, że w tym momencie zaobserwowano ostrą reakcję zapalną, z neutrofilami naciekającymi mięsień sercowy, czerwonymi strzałkami, co sugeruje ostrą reakcję odrzucenia komórkowego na przeszczepione komórki ksenogeniczne. Ostry stan zapalny obserwowano również 24 godziny po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego samym atramentem indyjskim. Jednak w tym przypadku dominującymi komórkami naciekającymi mięsień sercowy były makrofagi.

Białe groty strzał. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego, kierując się echokardiografią kontrastową w sercu królika. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 25 minut po zastoju.