Name: Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu podsiatkówkowego komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do modelu atrofii geograficznej. Technika ta umożliwia ocenę integracji komórek dawcy przy użyciu optycznej tomografii koherencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Instytutu Karolinska, Fundacji Księżnej Małgorzaty dla Osób Niedowidzących, Fundacji Edwina Jordana na Rzecz Badań Oftalmologicznych, Szwedzkiej Fundacji Oka, Fundacji Króla Gustawa V, Fundacji ARMEC Lindeberg i Fundacji Cronqvista.

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Karolinska Instituet dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach z udziałem nowozelandzkich królików albinosów (tabela materiałów) zostały zatwierdzone przez regionalną komisję etyki zwierząt (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (zezwolenie: dnr 56/15). Stosowanie hESC (dnr 2011/745-31/3) oraz transfer i manipulowanie hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) jest również zgodne ze szwedzkim ustawodawstwem i przepisami Karolinska Institutet oraz zostało zatwierdzone przez regionalną komisję ds. etyki człowieka (Regionala Etikprövningsnämnden i Sztokholm).
1. Podsiatkówkowe wstrzyknięcie jodanu sodu (NaIO3) do wielkookiego modelu zwierzęcego
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierząt przez podanie domięśniowe w udo mieszaniną 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny w soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 30 G i rozszerzenie źrenic za pomocą miejscowych kropli do oczu przy użyciu mieszaniny 0,75% cyklopentolanu i 2,5% fenylefryny. Prawidłowe znieczulenie jest potwierdzone, jeśli zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie w tylną nogę.</li>
	<li>Umieść królika pod mikroskopem chirurgicznym z głową skierowaną w stronę chirurga (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i błonę nictitans za pomocą sterylnej szmatki, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Używaj zbilansowanego roztworu soli (BSS), aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia w obu oczach.</li>
	<li>W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę 2-portową (lub opcjonalnie 3-portową) 25 G transvitralną pars plana z trokarami bez zaworu do wprowadzania narzędzi mikrochirurgicznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Wielofunkcyjna maszyna do witrektomii posiada porty do podłączenia kaniuli infuzyjnej, endoillumination, wirektoratu i endolasera. W przypadku iniekcji podsiatkówkowych obowiązkowe jest tylko endooświetlenie, co sprawia, że konfiguracja 2-portowa jest wystarczająca. Wprowadzić endoillumację przez górny lewy trokar i użyć górnego prawego trokaru do kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych.
	<ol>
		<li>W przypadku konfiguracji 3-portowej użyj dolnego trokaru skroniowego do kaniuli infuzyjnej BSS. Jeśli używane są opcjonalne instrumenty (takie jak witrektor), włóż je przez prawy górny trokar.</li>
		<li>Włóż 2 górne trokary w odległości 1-2 mm od rąbka za pomocą szponiastych kleszczy, aby chwycić i przesunąć spojówkę leżącą nad miejscem wprowadzenia.</li>
		<li>Upewnij się, że trokary są włożone przeztwardówkowo pod kątem równoległym 30-45° rąbka i przejdź do środka końcówki trokaru. Następnie obróć trokar o 90° i wsuń się w oko, celując w tylny biegun oka. Ta procedura pozwoli uniknąć wycieku pooperacyjnego z powodu sklerotomii, a także zmniejszy ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej (tj. infekcji bakteryjnej w oku). Zobacz także Rysunek 2B dla pozycji trokarów.</li>
		<li>Umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę, z syntetycznymi łzami jako żelem kontaktowym między okiem a soczewką kontaktową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Pobrać 500 μl NaIO3 do strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do rurki przedłużającej (obsługiwanej przez asystenta) i kaniuli wielokońcówkowej 38 G (obsługiwanej przez chirurga).</li>
		<li>Przełóż sondę endoilluminacyjną przez górny lewy trokar, a kaniulę iniekcyjną przez prawy górny trokar i przesuń kaniulę przez przestrzeń ciała szklistego w kierunku siatkówki, kierując się na obszar tuż pod głową nerwu wzrokowego.</li>
		<li>Pozwól, aby końcówka kaniuli powoli dotykała siatkówki, aż do uzyskania widocznego ogniskowego wybielania. Samo wstrzyknięcie przeniknie do siatkówki, umożliwiając dostarczenie podsiatkówkowe. Nie pozwól, aby kaniula przeniknęła do siatkówki, ponieważ może to spowodować krwotok.</li>
		<li>Wstrzyknąć 50 μl NaIO3 podsiatkówkowo przez okres 5 sekund. Ponieważ między siatkówką a leżącym pod nią naczyniówką znajduje się naturalna płaszczyzna rozszczepienia, podczas wstrzyknięcia powinien stopniowo tworzyć się wyraźnie widoczny półprzezroczysty pęcherzyk.</li>
		<li>Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks.</li>
		<li>Po usunięciu endoillumacji i kaniuli iniekcyjnej usuń trokary za pomocą kleszczy z pazurami i wywieraj lekki nacisk przez 30 s na samouszczelniające się sklerotomii bez szwów za pomocą końcówki lub końca kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po operacji podaj podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu. Nie podawaj pooperacyjnie miejscowo sterydów ani antybiotyków. Jako leki przeciwbólowe podawaj 0,5 ml buprenorfiny 0,3 mg/ml podskórnie po operacji, jak również dzień po operacji.</li>
	<li>Po użyciu umyj wszystkie instrumenty, zanurzając je na kilka sekund, najpierw w 70% etanolu, następnie w 45% etanolu, a na końcu w wodzie destylowanej. Osusz je dokładnie ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Opiekuj się zwierzętami, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności i umieść je wszystkie pojedynczo w klatce. W razie potrzeby (np. do celów immunohistochemicznych) należy poddać zwierzęta eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie 100 mg/kg pentobarbitalu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odczekaj 7 dni, aby przystąpić do przeszczepu komórek hESC-RPE.</li>
</ol>
2. Podsiatkówkowe przeszczepienie komórek hESC-RPE u leczonych zwierząt
<ol>
	<li>Podać 2 mg (100 μl) triamcynolonu doszklistkowego znieczulonym zwierzętom za pomocą igły iniekcyjnej o wadze 30 g umieszczonej w odległości 1-2 mm od rąbka w dolnym kwadrancie skroniowym na 1 tydzień przed przeszczepieniem hESC-RPE i podawać ponownie co 3 miesiące. Upewnij się, że końcówka jest skierowana w stronę tylnego bieguna oka, aby uniknąć dotknięcia soczewki.</li>
	<li>Hodowla monowarstwy hESC-RPE zgodnie z wcześniejszym opisem1.</li>
	<li>Usunąć pożywkę różnicującą komórki (patrz tabela materiałów) z 24-dołkowej monowarstwy hESC-RPE i przemyć każdą studzienkę 500 μl PBS bez Ca2+ i Mg2+. Powtórz tę czynność jeszcze raz, w sumie 2 prania.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać 500 μl trypsyny do dołka i inkubować przez 12 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przechyl płytkę i ostrożnie usuń trypsynę (komórki powinny pozostać przyczepione do płytki). Zebrać komórki w 800 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej o temperaturze 37 °C, delikatnie pipetując lub nawet skrobając, jeśli to konieczne, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. 
	UWAGA: Użyj sitka komórkowego o wielkości 40 μm, jeśli zaobserwuje się grudki komórek.</li>
	<li>Policz komórki w komorze hemocytometru za pomocą 0,2% błękitu trypanowego, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki różnicującej i odwirować komórki w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżo wysterylizowanym PBS z filtrem (przepuszczonym przez filtr strzykawkowy 25 mm) do końcowego stężenia 1,000 komórek/μl.</li>
	<li>Poprzednią zawiesinę komórkową podzielić na podwielokrotności o objętości 600 μl i przechowywać na lodzie do czasu i w trakcie zabiegu.</li>
	<li>Znieczulać zwierzęta przez podanie domięśniowe w udo mieszaniną 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny w soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 30 G. Rozszerz źrenice za pomocą miejscowych kropli do oczu, stosując amix 0,75% cyklopentolanu i 2,5% fenylefryny. Prawidłowe znieczulenie jest potwierdzone, jeśli zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie w tylną nogę.</li>
	<li>Umieść królika z głową skierowaną w stronę chirurga. Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i błonę nictitans za pomocą sterylnej szmatki, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Użyj BSS, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia w obu oczach.</li>
	<li>W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę 2-portową (lub opcjonalnie 3-portową) 25 G transvitreal pars plana z trokarami umieszczonymi w tych samych pozycjach, jak opisano w kroku 1.3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Jeśli poprzednie sklerotomia są widoczne, należy wykonać wprowadzenie trokaru tuż obok nich, ale nie przez nie, aby zminimalizować ryzyko przecieku pooperacyjnego.
	<ol>
		<li>Umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę, z syntetycznymi łzami jako żelem kontaktowym między okiem a soczewką kontaktową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Po prawidłowym ustawieniu końcówki (patrz kroki 1.3.5 i 1.3.6) wstrzyknąć podsiatkówkowo 50 μl delikatnie zmieszanej zawiesiny hESC-RPE (50 000 komórek). Celuj w środek obszaru wstępnie leczonego NaIO3 wyróżniającego się charakterystycznym "metalicznym" odruchem endooświetlenia. Siatkówka neurosensoryczna powinna łatwo się rozdzielać, tworząc wyraźnie widoczny pęcherzyk. Przepłukać igłę sterylnymH2Opomiędzy kolejnymi królikami/po użyciu, aby uniknąć zatkania igły z powodu zbrylenia komórek. Zmień igłę, gdy zauważysz zatkanie.</li>
		<li>Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks.</li>
		<li>Po usunięciu endoillumacji i kaniuli iniekcyjnej usuń trokary za pomocą kleszczy z pazurami i wywieraj lekki nacisk przez 30 s na samouszczelniające się sklerotomii bez szwów za pomocą końcówki lub końca kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po operacji podawać podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu. Nie należy podawać pooperacyjnych miejscowych sterydów ani antybiotyków. W przypadku leków przeciwbólowych podawać 0,5 ml buprenorfiny 0,3 mg/ml podskórnie po zabiegu, a także dzień po zabiegu.</li>
	<li>Po użyciu umyj wszystkie instrumenty, zanurzając je na kilka sekund, najpierw w 70% etanolu, następnie w 45% etanolu, a na końcu w wodzie destylowanej. Osusz je dokładnie ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Opiekuj się zwierzętami, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności i umieść je wszystkie pojedynczo w klatce. W razie potrzeby (np. do celów immunohistochemicznych) należy poddać zwierzęta eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie 100 mg/kg pentobarbitalu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie in vivo siatkówki i podsiatkówki
<ol>
	<li>Należy użyć urządzenia do optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej (SD-OCT) wraz z dołączonym oprogramowaniem (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać przekrojowe skany b leczonych zwierząt, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uniknąć rozmycia obrazu, upewnij się, że rogówka jest wilgotna, spłukując ją miejscową solą fizjologiczną co 30-60 s.
	<ol>
		<li>Umieść znieczulone zwierzęta z rozszerzoną źrenicą (patrz kroki 1.1 i 2.10) w regulowanym uchwycie, aby uzyskać niezakłóconą drogę od źródła światła instrumentu do siatkówki królika.</li>
		<li>Uzyskać co najmniej 3 skany OCT z jednoczesnymi obrazami referencyjnymi odbicia laserowej oftalmoskopii skaningowej w podczerwieni (IR-cSLO) reprezentujących górną, środkową i dolną część wstrzykniętego obszaru.</li>
		<li>Uzyskaj obrazy dna oka z odpowiednio niebieskim, zielonym, podczerwonym i wielokolorowym odbiciem laserowym cSLO (tj. wieloma jednoczesnymi kolorami lasera).</li>
		<li>Rejestruj obrazy autofluorescencji światła niebieskiego (BAF) za pomocą lasera wykorzystującego niebieskie światło urządzenia SD-OCT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

W niniejszym protokole opisano generowanie wielkookiego modelu GA i jego przedkliniczne zastosowanie do oceny integracji hESC-RPE in vivo .
W celu przekształcenia terapii regeneracyjnych w GA i chorobach pokrewnych do kliniki7 ważne jest opracowanie i optymalizacja metod, które wiernie oddają kliniczne metody transplantacji i obrazowania. Królik jest pod tym względem atrakcyjny: ma stosunkowo duże oko, które pozwala na operację wewnątrzgałkową i zastosowanie st...

Ten protokół opisuje generowanie przedklinicznego modelu atrofii geograficznej (GA) o dużych oczach, który pozwala na ocenę integracji przeszczepionego hESC-RPE w przestrzeni podsiatkówkowej. Szczegółowo opisane tutaj metody zostały wykorzystane w 3 ostatnich publikacjach, które wykazują produkcję wzbogaconej, czystej i funkcjonalnej populacji komórek RPE z hESC1, a także tworzenie zewnętrznego uszkodzenia siatkówki i fenotypu podobnego do GA indukowanego przez podsiatkówkowe wstrzyknięcie fizjologicznych roztworów soli (tj. BSS i PBS) lub NaIO3 w klasie rabbit eye<sup="xref">2, 3. Wykazaliśmy ponadto, że przeszczepy zawiesiny podsiatkówkowej hESC-RPE tworzą rozległe funkcjonalne monowarstwy o zdolności ratunkowej fotoreceptorów2.
Kilka zalet towarzyszy użyciu oka królika do generowania modelu choroby GA. Po pierwsze, rozmiar oka królika, który stanowi 70% objętości oka dorosłego człowieka, pozwala na klinicznie znaczący przeszczep przy użyciu gęstości komórek, która jest znacznie niższa niż rutynowo stosowana w małych oczach gryzoni (1000 komórek/μL vs. 50 000 komórek/μL)4,5. Po drugie, operacja u gryzoni jest zwykle przeztwardówkowa przez naczyniówkę, co narusza barierę siatkówkową i potencjalnie wywołuje reakcję zapalną i możliwe odrzucenie6. Oba czynniki razem mogą prowadzić do wielowarstwowości i zlepiania się przeszczepionych komórek oraz ogólnej słabej integracji przeszczepionych komórek w zakłóconej natywnej tkance siatkówki. Jednak model królika o dużych oczach pozwala na wykonanie techniki chirurgicznej z oprzyrządowaniem identycznym jak w warunkach klinicznych. Po trzecie, model o dużych oczach umożliwia również obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości i monitorowanie przeszczepionych komórek i leżącej nad nimi siatkówki w czasie1,2,3. W związku z tym opisujemy klinicznie istotny i opłacalny model przedkliniczny, który powinien być atrakcyjną alternatywą dla gryzoni dla każdego, kto jest zainteresowany badaniami nad normalną i chorą siatkówką oraz przestrzenią podsiatkówkową.

<table><tbody><tr><td>Pożywka różnicująca hESC XF NutriStem &ndash; bFGF oraz &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 &mu; m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 G 0,5' &rsquo;; 0,3 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtr strzykawkowy</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4% błękit trypanowy</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Stosować przy 0,2%</td></tr> <tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol, 100 mg/ml</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Stosować 35 mg/kg ketaminy</td></tr><tr><td>Rompun vet, 20 mg/ml</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Stosować 5 mg/kg ksylazyny</td></tr><tr><td>Triescence, 40 mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>412915</td><td>2 mg dowiterialnie</td></tr><tr><td>Cyklopentolat-fenylefryna, 0,75% + 2,5%</td> <td>APL</td><td>321968</td><td>Stosować 1 kroplę do każdego oka</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; a</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna do stosowania miejscowego</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal weterynarz 100 mg/ml</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Użyj 100 mg/ml pentobarbitalu</td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca (młotek)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G Kaniula podsiatkówkowa wielokońcówkowa</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Jednorazowa płaska soczewka</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Zwijacz pokrywy Barraquer Colibri</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trokary bez zaworów</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze pazurowe</td><td>Bausch & Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS Urządzenie do witrektomii</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Witrektomia Accurus 25+ Gauge TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>Użyj Heidelberg Eye Explorer w wersji 1.9.10.0</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr Neubauera</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Nowozelandzkie króliki albinosy</td><td>Lidk&ouml; pings Rabbit Farm, Szwecja</td><td></td><td></td></tr><tr>Komórki <td></td><td></td><td>hESC-RPE</td><td>Patrz numer referencyjny 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>Stosować podskórnie 0,5 ml buprenorfiny</td></tr></tbody></table>

przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Zanik geograficzny (GA), późne stadium suchego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem charakteryzuje się utratą warstwy nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), co prowadzi do późniejszej degeneracji ważnych struktur siatkówki (np. fotoreceptorów), powodując poważne upośledzenie widzenia. Podobnie, utratę RPE i zmniejszenie ostrości wzroku obserwuje się w długoterminowej obserwacji pacjentów z zaawansowanym wysiękowym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) otrzymujących doszklistkowe leczenie czynnikiem wzrostu śródbłonka przeciwnaczyniowego (VEGF). Dlatego z jednej strony fundamentalne znaczenie ma efektywne pozyskiwanie komórek RPE z nieograniczonego źródła, które może służyć jako terapia zastępcza. Z drugiej strony ważna jest ocena zachowania i integracji pobranych komórek w modelu choroby obejmującym metody chirurgiczne i obrazowe jak najbardziej zbliżone do tych stosowanych u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół oparty na naszych poprzednich publikacjach, który opisuje generowanie przedklinicznego modelu GA przy użyciu oka królika albinosa, do oceny komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC-RPE) w klinicznie istotnych warunkach. Zróżnicowane hESC-RPE są przeszczepiane do oczu naiwnych lub oczu ze zwyrodnieniem siatkówki podobnym do GA wywołanym przez NaIO3 przy użyciu techniki transszklistkowej pars plana 25 G. Ocena obszarów zwyrodniałych i przeszczepionych odbywa się za pomocą multimodalnego, nieinwazyjnego obrazowania w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości.

Reprezentatywne obrazy in vivo BAF, IR-cSLO oraz SD-OCT normalnej siatkówki królika albinosa przedstawiono na Rysunku 2. Należy zwrócić uwagę na różne warstwy siatkówki o charakterystycznych poziomach odbicia światła zarejestrowanych przez urządzenie SD-OCT.
Na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B przedstawiono schemat tworzenia pęcherzy pod...

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wielkookiego modelu zwierzęcego atrofii geograficznej w celu przeszczepienia ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodnego siatkówki do oka i oceny integracji komórek dawcy za pomocą optycznej koherentnej tomografii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu medycyny regeneracyjnej, takie jak leczenie chorób zwyrodnieniowych oparte na komórkach macierzystych. Główną zaletą tego ustawienia chirurgicznego jest nieograniczone źródło zdrowych komórek i chirurgiczne ustawienie do iniekcji podsiatkówkowej, które ma wiele podobieństw do procedury przeznaczonej dla pacjenta.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem poprzez ostentację komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Nasz zootechnik, Monica Aronsson, utrzymuje królika w pozycji, abyśmy mogli uwidocznić i zobrazować siatkówkę za pomocą optycznej koherentnej tomografii. Po znieczuleniu królika zgodnie z protokołem tekstowym należy umieścić królika pod mikroskopem chirurgicznym z głową skierowaną w stronę chirurga.Następnie użyj retraktora powieki, aby usunąć powieki i sterylnej szmatki, aby usunąć błonę nictitans. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować dwuportową lub opcjonalną trzyportową technikę transvitralnego pars plana o rozmiarze 25 z trokarami bez zaworu do wprowadzania narzędzi mikrochirurgicznych. Wielofunkcyjny aparat do witrektomii posiada porty do podłączenia kanuliki infuzyjnej, endoillumination, wirektora i endolasera.W przypadku wstrzyknięć podsiatkówkowych obowiązkowe jest tylko endooświetlenie, co sprawia, że konfiguracja z dwoma portami jest wystarczająca. Używając kleszczy skrzepowych, aby chwycić i przemieścić spojówkę, obrysuj miejsce wkłucia. Przeztwardziście włóż jeden z dwóch górnych trokarów, jeden do dwóch milimetrów od rąbka, pod kątem równoległym do trzydziestu do czterdziestu pięciu stopni.Kontynuuj wkładanie trokara do środka końcówki. Następnie obróć trokar o dziewięćdziesiąt stopni i przesuń go do oka, celując w tylny biegun. Zapobiegnie to pooperacyjnemu wyciekowi z tej sklerotomii, a także zmniejszy ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej.Powtórz z drugim górnym trokarem. Podczas wkładania trokaru ważne jest, aby znajdować się od jednego do dwóch milimetrów od rąbka, aby tunelować przyczep i celować w tylny biegun, aby zminimalizować ryzyko infekcji, krwawienia z ciała szklistego, odwarstwienia siatkówki i dotyku soczewki. Nałóż syntetyczne łzy jako żel przykurczający na rogówkę, a następnie umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę.Następnie wrzuć pięćset mikrolitrów jodanu sodu do jednomililitrowej strzykawki podłączonej do rurki przedłużającej obsługiwanej przez asystenta i kaniuli z polietyczną końcówką o rozmiarze 38 obsługiwanych przez chirurga. Przełóż sondę endoilluminacyjną przez lewy górny trokar. Następnie wprowadzić kaniulę do iniekcji przez prawy górny trokar i przesunąć kaniulę przez przestrzeń ciała szklistego w kierunku siatkówki, kierując się do obszaru tuż pod głową nerwu wzrokowego.Pozwól, aby czubek kaniuli powoli dotykał siatkówki, aż do uzyskania widocznego ogniskowego wybielenia. Nie pozwól, aby kaniula przeniknęła do siatkówki, ponieważ może to spowodować krwotok. Teraz, penetrując siatkówkę igłą, wstrzyknij pięćdziesiąt mikrolitrów jodanu sodu podsiatkówkowo w ciągu pięciu sekund.Ponieważ między siatkówką a leżącym pod nią naczyniówką znajduje się naturalna płaszczyzna rozszczepienia, podczas wstrzyknięcia powinien stopniowo tworzyć się wyraźnie widoczny półprzezroczysty pęcherzyk. Podczas wstrzykiwania powoli wsuwaj igłę, ale upewnij się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks. Po usunięciu kaniuli endoiluminacyjnej i iniekcyjnej należy użyć kleszczy skrzepowych, aby usunąć trokary.Następnie użyj końcówki lub końca kleszczy, aby wywierać lekki nacisk przez trzydzieści sekund na miękko uszczelniającą sklerotomię bez szwów. Podczas rekonwalescencji należy zająć się zwierzęciem zgodnie z protokołem tekstowym i odczekać siedem dni na przeszczep. Siedem dni po wstrzyknięciu jodanu sodu i po podaniu doszklistkowym triamcynolonu, zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pożywkę różnicującą komórki z dwudziestoczterodołkowej monowarstwy hESC-RPE i użyj pięciuset mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu do przemycia każdej studzienki.Po próbowaniu komórek przechyl płytkę i ostrożnie usuń trypsynę, aby komórki pozostały przymocowane do płytki. Zebrać komórki w ośmiuset mikrolitrach świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej o temperaturze trzydziestu siedmiu stopni Celsjusza, delikatnie pipetując lub nawet skrobając, jeśli to konieczne, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Używając punktu zerowego dwuprocentowego błękitu trypanowego, policz komórki w komorze hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie dodać pięć mililitrów pożywki różnicującej do zawiesiny komórek i odwirować komórki w ilości trzysta razy g, w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżo przefiltrowanym, wysterylizowanym PBS o końcowym stężeniu tysiąca komórek na mikrolitr. Podziel poprzednią zawiesinę komórkową na sześćset mikrolitrowych podwielokrotności i trzymaj je na lodzie do czasu i podczas operacji.Po znieczuleniu królika i rozszerzeniu źrenic zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż królika z głową skierowaną w stronę chirurga. Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i sterylnej szmatki, aby usunąć błonę nictitans. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę transszklistkową pars plana z dwoma portami lub opcjonalnie z trzema portami o rozmiarze 25 z trokarami umieszczonymi w tych samych pozycjach, jak pokazano wcześniej w tym filmie.Jeśli poprzednie sklerotomia są widoczne, wykonaj wprowadzenie trokaru tuż obok tych miejsc wprowadzenia, ale nie przez nie, aby zminimalizować ryzyko wycieku pooperacyjnego. Nałóż syntetyczne łzy na oko, jak poprzednio, i umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na roztworze na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę. Po prawidłowym ustawieniu końcówki i skierowaniu się do środka obszaru wstępnie leczonego jodanu sodu, wyróżniającego się charakterystycznym metalicznym odruchem endorozświetlenia, wstrzyknąć podsiatkówkowo pięćdziesiąt mikrolitrów delikatnie zmieszanej zawiesiny hESC-RPE.Siatkówka neurosensoryczna powinna łatwo się rozdzielać, tworząc wyraźnie widoczny pęcherzyk. Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks. Po usunięciu kaniuli endoiluminacyjnej i iniekcyjnej użyj kleszczy skrzepowych, aby usunąć trokary i użyj końca kleszczy, aby zastosować lekki nacisk przez trzydzieści sekund, tak jak poprzednio.Użyj optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej lub urządzenia SD-OCT wraz z dołączonym oprogramowaniem, aby uzyskać przekrojowe skany B leczonych zwierząt, zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść znieczulone zwierzę z rozszerzoną źrenicą w regulowanym mocowaniu, aby uzyskać niezakłóconą ścieżkę od źródła światła instrumentu do siatkówki królika. Aby uniknąć rozmycia obrazu, utrzymuj rogówkę wilgotną, spłukując ją miejscowym roztworem soli fizjologicznej co trzydzieści do sześćdziesięciu sekund.Uzyskaj co najmniej trzy skany OCT z jednoczesną skaningiem konfokalnym w podczerwieni, oftalmoskopią laserową lub konfokalnymi obrazami referencyjnymi odbicia SLO reprezentującymi górną, środkową i dolną część wstrzykniętego obszaru. Uzyskaj wiele jednoczesnych kolorów laserowych obrazów dna twarzy z konfokalnym SLO niebieskim, zielonym, podczerwonym i wielokolorowym odbiciem laserowym. Rejestruj obrazy autofluorescencji światła niebieskiego za pomocą lasera wykorzystującego światło niebieskie urządzenia SD-OCT.Reprezentatywne obrazy in vivo BAF, IR-cSLO i SD-OCT normalnej siatkówki królika albinosa są pokazane tutaj. Powiększenie obrazu SD-OCT ilustruje różne warstwy siatkówki z ich charakterystycznymi poziomami odbicia światła uchwyconymi przez instrument SD-OCT. Jak pokazano na tym obrazie SD-OCT, wykonanym trzy miesiące po wstrzyknięciu pięćdziesięciu mikrolitrów jednego milimolowego roztworu jodanu sodu, powstaje pęcherzyk, który ustępuje i stopniowo degeneruje zewnętrzną siatkówkę.Można zaobserwować ścieńczenie najbardziej zewnętrznych warstw neurosiatkówki w obszarach SD-OCT i hipo-BAF, co odpowiada utracie RPE, tworząc w ten sposób fenotyp podobny do GA. Po zidentyfikowaniu obszaru uszkodzenia, pięćdziesiąt tysięcy komórek hESC-RPE zostało ponownie wstrzykniętych do przeszczepu, tworząc drugi pęcherzyk, który ustąpił. Występują łagodne do umiarkowanych obszary hiper-BAF z ogniskowo zwiększonym hiper-BAF na granicy obszaru uszkodzenia, co wskazuje na przewlekły stres rodzimego RPE.Dla porównania pokazano pęcherzyk odpowiadający wstrzyknięciu hESC-RPE do oczu niepoddanych wcześniej leczeniu, pokazujący plamy komórek barwnikowych na obrazie MC i dobrze zachowane struktury siatkówki w skanie SD-OCT. Opanowanie tej dość klinicznej metody wstrzykiwania podsiatkówkowego ułatwi kliniczne przeszczepienie leczenia opartego na komórkach w stanach takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustawić zastrzyki podsiatkówkowe w modelu typu życia, jak przygotować ludzkie embrionalne komórki macierzyste pochodzące z komórek macierzystych do wstrzyknięć podsiatkówkowych oraz jak wizualizować integrację komórek dawcy za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

subretinal-transplantation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczep komórek stanowi strategię leczenia zwyrodnienia siatkówki charakteryzującego się utratą fotoreceptorów. W tym miejscu opisujemy metodę wzbogacania fotoreceptorów do przeszczepiania i ich przeszczepiania podsiatkówkowego dorosłym myszom.

Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Strategie wymiany nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i terapia oparta na genach są brane pod uwagę w przypadku kilku stanów zwyrodnieniowych siatkówki. Do translacji klinicznej wymagane są modele zwierzęce z dużymi oczami do badania technik chirurgicznych stosowanych u pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy model królika do chirurgii podsiatkówkowej ukierunkowany na przeszczep RPE, który jest wszechstronny i opłacalny.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Poznaj metodę przeszczepu podsiatkówkowego komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do modelu atrofii geograficznej. Technika ta umożliwia ocenę integracji komórek dawcy przy użyciu optycznej tomografii koherencyjnej.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Przeglądaj więcej filmów