Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej
January 22nd, 2018
Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wielkookiego modelu zwierzęcego atrofii geograficznej w celu przeszczepienia ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodnego siatkówki do oka i oceny integracji komórek dawcy za pomocą optycznej koherentnej tomografii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu medycyny regeneracyjnej, takie jak leczenie chorób zwyrodnieniowych oparte na komórkach macierzystych. Główną zaletą tego ustawienia chirurgicznego jest nieograniczone źródło zdrowych komórek i chirurgiczne ustawienie do iniekcji podsiatkówkowej, które ma wiele podobieństw do procedury przeznaczonej dla pacjenta.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem poprzez ostentację komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Nasz zootechnik, Monica Aronsson, utrzymuje królika w pozycji, abyśmy mogli uwidocznić i zobrazować siatkówkę za pomocą optycznej koherentnej tomografii. Po znieczuleniu królika zgodnie z protokołem tekstowym należy umieścić królika pod mikroskopem chirurgicznym z głową skierowaną w stronę chirurga.
Następnie użyj retraktora powieki, aby usunąć powieki i sterylnej szmatki, aby usunąć błonę nictitans. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować dwuportową lub opcjonalną trzyportową technikę transvitralnego pars plana o rozmiarze 25 z trokarami bez zaworu do wprowadzania narzędzi mikrochirurgicznych. Wielofunkcyjny aparat do witrektomii posiada porty do podłączenia kanuliki infuzyjnej, endoillumination, wirektora i endolasera.
W przypadku wstrzyknięć podsiatkówkowych obowiązkowe jest tylko endooświetlenie, co sprawia, że konfiguracja z dwoma portami jest wystarczająca. Używając kleszczy skrzepowych, aby chwycić i przemieścić spojówkę, obrysuj miejsce wkłucia. Przeztwardziście włóż jeden z dwóch górnych trokarów, jeden do dwóch milimetrów od rąbka, pod kątem równoległym do trzydziestu do czterdziestu pięciu stopni.
Kontynuuj wkładanie trokara do środka końcówki. Następnie obróć trokar o dziewięćdziesiąt stopni i przesuń go do oka, celując w tylny biegun. Zapobiegnie to pooperacyjnemu wyciekowi z tej sklerotomii, a także zmniejszy ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej.
Powtórz z drugim górnym trokarem. Podczas wkładania trokaru ważne jest, aby znajdować się od jednego do dwóch milimetrów od rąbka, aby tunelować przyczep i celować w tylny biegun, aby zminimalizować ryzyko infekcji, krwawienia z ciała szklistego, odwarstwienia siatkówki i dotyku soczewki. Nałóż syntetyczne łzy jako żel przykurczający na rogówkę, a następnie umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę.
Następnie wrzuć pięćset mikrolitrów jodanu sodu do jednomililitrowej strzykawki podłączonej do rurki przedłużającej obsługiwanej przez asystenta i kaniuli z polietyczną końcówką o rozmiarze 38 obsługiwanych przez chirurga. Przełóż sondę endoilluminacyjną przez lewy górny trokar. Następnie wprowadzić kaniulę do iniekcji przez prawy górny trokar i przesunąć kaniulę przez przestrzeń ciała szklistego w kierunku siatkówki, kierując się do obszaru tuż pod głową nerwu wzrokowego.
Pozwól, aby czubek kaniuli powoli dotykał siatkówki, aż do uzyskania widocznego ogniskowego wybielenia. Nie pozwól, aby kaniula przeniknęła do siatkówki, ponieważ może to spowodować krwotok. Teraz, penetrując siatkówkę igłą, wstrzyknij pięćdziesiąt mikrolitrów jodanu sodu podsiatkówkowo w ciągu pięciu sekund.
Ponieważ między siatkówką a leżącym pod nią naczyniówką znajduje się naturalna płaszczyzna rozszczepienia, podczas wstrzyknięcia powinien stopniowo tworzyć się wyraźnie widoczny półprzezroczysty pęcherzyk. Podczas wstrzykiwania powoli wsuwaj igłę, ale upewnij się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks. Po usunięciu kaniuli endoiluminacyjnej i iniekcyjnej należy użyć kleszczy skrzepowych, aby usunąć trokary.
Następnie użyj końcówki lub końca kleszczy, aby wywierać lekki nacisk przez trzydzieści sekund na miękko uszczelniającą sklerotomię bez szwów. Podczas rekonwalescencji należy zająć się zwierzęciem zgodnie z protokołem tekstowym i odczekać siedem dni na przeszczep. Siedem dni po wstrzyknięciu jodanu sodu i po podaniu doszklistkowym triamcynolonu, zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pożywkę różnicującą komórki z dwudziestoczterodołkowej monowarstwy hESC-RPE i użyj pięciuset mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu do przemycia każdej studzienki.
Po próbowaniu komórek przechyl płytkę i ostrożnie usuń trypsynę, aby komórki pozostały przymocowane do płytki. Zebrać komórki w ośmiuset mikrolitrach świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej o temperaturze trzydziestu siedmiu stopni Celsjusza, delikatnie pipetując lub nawet skrobając, jeśli to konieczne, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Używając punktu zerowego dwuprocentowego błękitu trypanowego, policz komórki w komorze hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie dodać pięć mililitrów pożywki różnicującej do zawiesiny komórek i odwirować komórki w ilości trzysta razy g, w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżo przefiltrowanym, wysterylizowanym PBS o końcowym stężeniu tysiąca komórek na mikrolitr. Podziel poprzednią zawiesinę komórkową na sześćset mikrolitrowych podwielokrotności i trzymaj je na lodzie do czasu i podczas operacji.
Po znieczuleniu królika i rozszerzeniu źrenic zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż królika z głową skierowaną w stronę chirurga. Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i sterylnej szmatki, aby usunąć błonę nictitans. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę transszklistkową pars plana z dwoma portami lub opcjonalnie z trzema portami o rozmiarze 25 z trokarami umieszczonymi w tych samych pozycjach, jak pokazano wcześniej w tym filmie.
Jeśli poprzednie sklerotomia są widoczne, wykonaj wprowadzenie trokaru tuż obok tych miejsc wprowadzenia, ale nie przez nie, aby zminimalizować ryzyko wycieku pooperacyjnego. Nałóż syntetyczne łzy na oko, jak poprzednio, i umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na roztworze na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę. Po prawidłowym ustawieniu końcówki i skierowaniu się do środka obszaru wstępnie leczonego jodanu sodu, wyróżniającego się charakterystycznym metalicznym odruchem endorozświetlenia, wstrzyknąć podsiatkówkowo pięćdziesiąt mikrolitrów delikatnie zmieszanej zawiesiny hESC-RPE.
Siatkówka neurosensoryczna powinna łatwo się rozdzielać, tworząc wyraźnie widoczny pęcherzyk. Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks. Po usunięciu kaniuli endoiluminacyjnej i iniekcyjnej użyj kleszczy skrzepowych, aby usunąć trokary i użyj końca kleszczy, aby zastosować lekki nacisk przez trzydzieści sekund, tak jak poprzednio.
Użyj optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej lub urządzenia SD-OCT wraz z dołączonym oprogramowaniem, aby uzyskać przekrojowe skany B leczonych zwierząt, zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść znieczulone zwierzę z rozszerzoną źrenicą w regulowanym mocowaniu, aby uzyskać niezakłóconą ścieżkę od źródła światła instrumentu do siatkówki królika. Aby uniknąć rozmycia obrazu, utrzymuj rogówkę wilgotną, spłukując ją miejscowym roztworem soli fizjologicznej co trzydzieści do sześćdziesięciu sekund.
Uzyskaj co najmniej trzy skany OCT z jednoczesną skaningiem konfokalnym w podczerwieni, oftalmoskopią laserową lub konfokalnymi obrazami referencyjnymi odbicia SLO reprezentującymi górną, środkową i dolną część wstrzykniętego obszaru. Uzyskaj wiele jednoczesnych kolorów laserowych obrazów dna twarzy z konfokalnym SLO niebieskim, zielonym, podczerwonym i wielokolorowym odbiciem laserowym. Rejestruj obrazy autofluorescencji światła niebieskiego za pomocą lasera wykorzystującego światło niebieskie urządzenia SD-OCT.
Reprezentatywne obrazy in vivo BAF, IR-cSLO i SD-OCT normalnej siatkówki królika albinosa są pokazane tutaj. Powiększenie obrazu SD-OCT ilustruje różne warstwy siatkówki z ich charakterystycznymi poziomami odbicia światła uchwyconymi przez instrument SD-OCT. Jak pokazano na tym obrazie SD-OCT, wykonanym trzy miesiące po wstrzyknięciu pięćdziesięciu mikrolitrów jednego milimolowego roztworu jodanu sodu, powstaje pęcherzyk, który ustępuje i stopniowo degeneruje zewnętrzną siatkówkę.
Można zaobserwować ścieńczenie najbardziej zewnętrznych warstw neurosiatkówki w obszarach SD-OCT i hipo-BAF, co odpowiada utracie RPE, tworząc w ten sposób fenotyp podobny do GA. Po zidentyfikowaniu obszaru uszkodzenia, pięćdziesiąt tysięcy komórek hESC-RPE zostało ponownie wstrzykniętych do przeszczepu, tworząc drugi pęcherzyk, który ustąpił. Występują łagodne do umiarkowanych obszary hiper-BAF z ogniskowo zwiększonym hiper-BAF na granicy obszaru uszkodzenia, co wskazuje na przewlekły stres rodzimego RPE.
Dla porównania pokazano pęcherzyk odpowiadający wstrzyknięciu hESC-RPE do oczu niepoddanych wcześniej leczeniu, pokazujący plamy komórek barwnikowych na obrazie MC i dobrze zachowane struktury siatkówki w skanie SD-OCT. Opanowanie tej dość klinicznej metody wstrzykiwania podsiatkówkowego ułatwi kliniczne przeszczepienie leczenia opartego na komórkach w stanach takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustawić zastrzyki podsiatkówkowe w modelu typu życia, jak przygotować ludzkie embrionalne komórki macierzyste pochodzące z komórek macierzystych do wstrzyknięć podsiatkówkowych oraz jak wizualizować integrację komórek dawcy za pomocą optycznej koherentnej tomografii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół stworzenia modelu dużych oczu z geograficzną atrofią w celu ułatwienia przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych zarodkowych. Integrację tych komórek ocenia się za pomocą tomografii koherencyjnej, mając na celu rozwój medycyny regeneracyjnej w leczeniu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Terapia zastępcza komórek
- Oftalmologia
Tło
- Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem jest jedną z głównych przyczyn utraty wzroku.
- Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki są niezbędne dla zdrowia siatkówki.
- Terapia komórkami macierzystymi oferuje potencjał w leczeniu chorób zwyrodnieniowych.
- Stworzenie odpowiedniego modelu zwierzęcego jest niezbędne do testowania terapii.
Cel badania
- Opracowanie modelu zwierzęcego z dużymi oczami dla geograficznej atrofii.
- Ocenienie integracji przeszczepowanych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.
- Zbadanie potencjału terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu chorób siatkówki.
Zastosowane metody
- Stworzenie modelu z dużymi oczami z geograficzną atrofią.
- Przeszczepianie pod siatkówkę komórek pochodzących z ludzkich komórek macierzystych zarodkowych.
- Ocena integracji komórek dawcy za pomocą tomografii koherencyjnej.
- Zastosowanie technik chirurgicznych podobnych do tych stosowanych u pacjentów ludzkich.
Główne wyniki
- Udana transplantacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.
- Skuteczna wizualizacja struktur siatkówki za pomocą tomografii koherencyjnej.
- Wykazane potencjał terapii zastępczej komórkami w zwyrodnieniu plamki żółtej.
- Dostarczenie informacji na temat integracji komórek pochodzących z komórek macierzystych in vivo.
Wnioski
- Protokół oferuje obiecujące podejście do badania terapii siatkówki.
- Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzące z ludzkich komórek macierzystych zarodkowych wykazują potencjał w leczeniu chorób zwyrodnieniowych.
- Ten model może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w medycynie regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol establishes a clinically relevant large-eyed animal model for evaluating stem cell-derived retinal pigment epithelial cell therapies in geographic atrophy, a late-stage manifestation of dry age-related macular degeneration. By enabling subretinal transplantation and longitudinal multimodal imaging, it supports preclinical de-risking of cell replacement strategies. The approach bridges discovery-stage target validation with translational assessment of functional integration and safety in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding RPE cell function and survival in a degenerated retinal microenvironment.
- Operational Value: Provides a reproducible surgical model to assess donor cell engraftment, polarization, and functional support of photoreceptors.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by validating target engagement and biological activity of hESC-RPE in vivo prior to IND-enabling studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable structural and functional readouts via SD-OCT, en-face SLO, and blue light autofluorescence to monitor graft integration and host retinal degeneration.
- Scalability: The two-port 25-gauge transvitreal pars plana technique allows consistent delivery of cell suspensions across study cohorts, supporting dose-response and timing experiments.
- Platform Reuse: Established surgical and imaging workflows can be adapted for evaluating other cell types, gene-edited RPE, or combinatorial therapies in the same model.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: The NaIO3-induced GA-like phenotype recapitulates key features of human geographic atrophy, including RPE loss and outer retinal thinning, enabling translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Longitudinal imaging facilitates assessment of graft stability, host response, and functional rescue over months, informing go/no-go decisions for IND advancement.
- Risk-Adjusted Advancement: Integration metrics derived from OCT layer segmentation and autofluorescence patterns provide objective criteria for evaluating therapeutic potential and safety signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early validation of stem cell-derived RPE products before moving toward GLP toxicology and manufacturing scale-up.
- Discovery Biology: Tests biological de-risking hypotheses by assessing whether transplanted hESC-RPE survive, integrate, and modulate degeneration in a complex tissue environment.
- Screening: Enables standardized preparation and delivery of cell suspensions for comparative evaluation of different differentiation protocols or genetic modifications.
- Analytics: Provides quantitative, multimodal imaging outputs (SD-OCT thickness maps, en-face reflectance, autofluorescence) that allow cross-condition comparison and longitudinal tracking.
- Translational Research: Connects stem cell source validation to preclinical efficacy testing in a model with anatomical and surgical similarity to human procedures.
- Enterprise Reuse: Surgical trocar placement, imaging protocols, and cell handling procedures represent a reusable platform for multiple ophthalmic cell therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into cell-host interactions, reducing ambiguity in therapeutic mechanism and supporting target validation confidence.
- Operational Value: Standardizes microsurgical technique and imaging acquisition, improving inter-site reproducibility and reducing variability in preclinical data.
- Strategic Value: Informs portfolio prioritization by providing early evidence of biological activity and integration quality in a clinically predictive model.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by enabling data-driven decisions on which cell lines or modifications advance to costly IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vitreoretinal surgery, sterile microsurgical technique, and handling of delicate ocular tissues.
- Dependent on access to spectral domain OCT with en-face SLO and autofluorescence capabilities, along with surgical microscopes and vitrectomy systems.
- Necessitates standardized cell preparation protocols, including trypsinization, washing, concentration adjustment, and sterile aliquoting for transplantation.
- Demands adaptation of trocar placement and injection parameters when translating across species or disease models with varying ocular anatomy.
- Limited by the chronicity of the NaIO3 model, which may not fully capture late-stage human GA progression, requiring complementary models for long-term studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Subretinal Injection of Sodium Iodate into a Large-eyed Animal Model
4:36
Subretinal Transplantation of hESC-RPE Cells in Treated Animals
7:35
In Vivo Retinal and Subretinal Imaging
8:47
Results: Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells
10:22
Conclusion
