Name: Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin. Technika ta pozwala badać aktywność onkogenną mutacji napędzających nowotwory krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (R01HL131835), nagrodę dla badacza klinicznego Damona Runyona oraz Starr Cancer Consortium.

1. Projektowanie sgRNA za pomocą narzędzi online13
<ol>
	<li>Zaprojektuj sgRNA ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania, korzystając z ogólnodostępnych narzędzi internetowych.
	<ol>
		<li>Skopiuj i wklej sekwencję referencyjną NCBI interesującego genu do narzędzia internetowego do projektowania sgRNA Broad Institute: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design). 
		UWAGA: To narzędzie identyfikuje sekwencje sgRNA z miejscami rozszczepienia w eksonach i tymi, które rozciągają się na granicy intron/ekson, ale nadal rozszczepiają się w eksonie.</li>
		<li>Pobierz i otwórz tekstowy plik wyjściowy w programie Excel.</li>
		<li>Skoncentruj się na kolumnach wypełnionych sekwencjami sgRNA i sekwencjami kontekstowymi sgRNA. Należy zauważyć, że sekwencje sgRNA nie zawierają motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), ale sekwencje kontekstowe tak.</li>
		<li>Należy pamiętać, że celowa ocena skuteczności zawiera przewidywany wynik wydajności rozszczepienia w skali od 0 do 1, gdzie wynik 1 oznacza wyższą skuteczność rozszczepienia.</li>
		<li>Użyj funkcji "sortuj" programu Excel, aby uporządkować cele według wyniku skuteczności lub według lokalizacji w genie celu za pomocą kolumny "Target Cut %". 
		UWAGA: Sortowanie według lokalizacji w genie jest przydatne do identyfikacji sgRNA, które są ukierunkowane na określoną domenę lub ekson będący przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Wybierz 3-6 sgRNA, które celują w obszar zainteresowania z wysokimi (>0,6) wynikami skuteczności na celu. Przydatne może być poznanie rodzajów mutacji, które mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp (Zobacz Rysunek 1 wyjaśniający strategię celowania zastosowaną dla kalretykuliny). 
		UWAGA: sgRNA poniżej sugerowanego progu skuteczności 0,6 powinny być brane pod uwagę, gdy brakuje innych dobrych kandydatów.</li>
		<li>Użyj internetowego narzędzia do analizy gRNA MIT, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem potencjalnych efektów niedocelowych (http://crispr.mit.edu/). Dla każdego wybranego sgRNA uruchom sekwencję docelową (w tym PAM). 
		UWAGA: Narzędzie internetowe do projektowania sgRNA Broad Institute może być również używane do badania przesiewowego pod kątem efektów niedocelowych (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
		<ol>
			<li>Należy pamiętać, że narzędzie do analizy sgRNA MIT ocenia każde sgRNA w skali od 1 do 100, gdzie wynik 100 oznacza wyższą specyficzność. Wynik większy niż 70 jest idealny i reprezentuje sgRNA z minimalnymi efektami poza celem. Ta strona internetowa generuje również listę niedocelowych trafień wraz z ich lokalizacją w genomie i liczbą niezgodności, które każde z nich ma z przewodnikiem dla kandydatów. 
			UWAGA: Niecelne trafienia z czterema lub więcej niezgodnościami są uważane za bezpieczne14. Niecelne trafienia z mniej niż czterema niezgodnościami mogą być problematyczne, jeśli mieszczą się w exons14.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz 2-3 sgRNA, które są ukierunkowane na różne lokalizacje w regionie zainteresowania genu docelowego i które mają najwyższą wydajność sparowanego cięcia i wyniki poza celem (patrz tabela 1 dla sekwencji sgRNA ukierunkowanych na ekson 9 Calr). 
		UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, większy nacisk można położyć na różne wartości uzyskane z wymienionych narzędzi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Klonowanie sgRNA Oligos13
<ol>
	<li>Wygeneruj oligo do przodu
	<ol>
		<li>Utwórz listę sekwencji sgRNA bez miejsca PAM.</li>
		<li>Dodaj G do końca 5' sekwencji, jeśli koniec 5' sekwencji sgRNA nie jest G. 
		UWAGA: To G jest niezbędne do maksymalizacji poziomu transkrypcji sgRNA sterowanego przez U6. Dodanie G jest konieczne dla m1 sgRNA (Tabela 1).</li>
		<li>Dodać sekwencję "CACC" do końca 5' sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem G (bez PAM) (Tabela 2) w celu wygenerowania zwisów wymaganych do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów do trawionego przez BsmBI wektora lentiGuide (patrz krok 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj odwrócony oligo
	<ol>
		<li>Odwrotne uzupełnienie sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem G (bez PAM).</li>
		<li>Dodaj sekwencję "AAAC" do końca 5' sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem odwrotnego uzupełnienia G (Tabela 2).</li>
		<li>Zamów zaprojektowane oligonukleotydy w firmie zajmującej się syntezą starterów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oligonukleotydy wyżarzania i fosforylanu
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl oligo do przodu (100 μM), 1 μl odwróconego oligo (100 μM), 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) i 6,5 μlH2Odo probówki PCR (łącznie = 10 μL).</li>
		<li>Uruchom następujący program w termocyklerze: 37 °C przez 30 min, 95 °C przez 5 min, rampa od 95 do 25 przy 0,1 °C/s.</li>
		<li>Rozcieńczyć produkt reakcji w stosunku 1:250 wH2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie lentiGuide-Puro Vector13
<ol>
	<li>Skrót wektorowy lentiGuide-Puro
	<ol>
		<li>Zebrać 50 μl reakcji trawienia z następującymi składnikami: 5 μg kolistego plazmidu, 2 μl (30 jednostek) enzymu restrykcyjnego BsmBI, 5 μl buforu enzymu restrykcyjnego i do 50 μlH2O.</li>
		<li>Prowadzić reakcję przez 2 godziny w temperaturze 55 °C. Po pierwszej godzinie dodaj 1 μl więcej enzymu restrykcyjnego BsmBI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Defosforylacja przeciętego kręgosłupa
	<ol>
		<li>Do strawionego wektora dodać 7 μl buforu reakcyjnego fosfatazy i 2 μl enzymu fosfatazy.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR oczyszcza cięty i defosforylowany szkielet za pomocą komercyjnego zestawu. 
	UWAGA: Zastąp dostarczone różowe kolumny niebieskimi kolumnami zestawu miniprep, ponieważ mogą one lepiej pomieścić duże rozmiary plazmidów. Wydajność można zwiększyć, podgrzewając bufor elucyjny w bloku cieplnym o temperaturze 90 °C przed elucją, a następnie dwukrotnie eluując DNA z kolumny na końcu (wymyte DNA z pierwszej elucji przepuścić z powrotem przez drugi raz).</li>
</ol>
4. Podwiązanie wyżarzonych oligonukleotydów do strawionego szkieletu13
<ol>
	<li>Dodać 50 ng strawionego szkieletu, 1 μl wyżarzonego rozcieńczenia oligo, 1 μl 10x buforu do ligacji T4, 1 μl ligazy T4 i do 10 μlH2Odo probówki PCR. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Przekształć komórki Stbl3 za pomocą 2 μl reakcji ligacji. Umieścić na płytce agarowej z bulionu lizogennego (LB) ze 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz 3 kolonie i zaszczep je w mini-kulturze przygotowawczej.</li>
	<li>Sprawdzanie poprawności insercji oligonugoligoscytów
	<ol>
		<li>Wykonaj minipreparację dla każdej kultury i sekwencji przez miejsce insercji oligo, zaczynając od startera w promotorze U6 przy użyciu zestawu komercyjnego.</li>
		<li>Wykonaj midi-prep lub maxi-prep kultury zweryfikowanej pod kątem sekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Generowanie linii komórkowych stabilnie wyrażających SpCas9
UWAGA: Ten protokół obejmuje dostarczenie plazmidu pLX_TRC311-Cas9 przez infekcję lentiwirusową. Protokół ten jest szczegółowo opisany dla mysich komórek pro-B (Ba/F3) zależnych od mysiej interleukiny-3 (mIL-3), zawiesinowej linii komórkowej i może być dostosowany do innych typów komórek przy użyciu preferowanych warunków hodowli dla każdego typu komórki. Pożywka hodowlana dla komórek Ba/F3 składa się z RPMI uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliny/streptomycyny/L-glutaminy i 10 ng/ml mysiej interleukiny 3.
<ol>
	<li>Transfekcyjne komórki HEK-293T
	<ol>
		<li>Wysiew 3 x 106 komórek HEK-293T na 10 cm naczynie do hodowli tkankowej. Przechowuj wysiane komórki przez noc przed transfekcją. 
		UWAGA: Komórki HEK-293T są przylegającą linią komórkową i są rutynowo wykorzystywane do produkcji wirusa. Komórki są utrzymywane w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną/L-glutaminą. Komórki powinny być zlewane w 80% w momencie transfekcji.</li>
		<li>Wstępnie podgrzej zredukowaną pożywkę surowicy (Opti-MEM) i pożywkę wzrostową.</li>
		<li>Dodać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy, 7 μg konstruktu pLX_TRC311-Cas9, 4 μg plazmidu pakującego pCMV-VSV-G lentiwirusa i 4 μg plazmidu pakującego lentiwirusa psPAX2 do probówki 
		UWAGA: Całkowite DNA na 10 cm naczynie komórek 293T wynosi 15 μg.</li>
		<li>Dobrze wymieszać DNA i dodać 45 μl odczynnika do transfekcji. Delikatnie wymieszaj i odstaw na 20 min. 
		UWAGA: Ważne jest, aby używać zredukowanej pożywki surowicy, ponieważ surowica będzie hamować tworzenie się kompleksu między odczynnikiem do transfekcji a plazmidowym DNA.</li>
		<li>Odessać starą pożywkę na płytce 293T i dodać 5 ml nowej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę odczynnika DNA i odczynnika do transfekcji w kroplach do płytki 293T. Delikatnie obracać i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Zbierz supernatanty wirusowe po 24 i 48 godzinach od transfekcji. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i podwielokrotność do probówki kriowialnej (1,6 ml/probówkę i 1,5 ml zostanie użyte do infekcji).</li>
		<li>Przechowywać supernatant wirusowy w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: supernatant lentiwirusowy można zużyć w ciągu 6 miesięcy. Jeśli to możliwe, transdukcję infekcji należy wykonać świeżym wirusem).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infekcja lentiwirusowa komórek Ba/F3
	<ol>
		<li>Rozmrozić wirusowy supernatant na lodzie, jeśli jest zamrożony.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 4 min.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 3 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać 500 μl zawieszonych komórek, 1,5 ml supernatantu wirusa, 4 μl polibrenu (podstawa: 2 mg/ml) i 10 ng/ml m-IL3 do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że dołączasz niezainfekowaną studzienkę z 1,5 ml pożywki zamiast supernatantu wirusowego jako kontrolę. 
		UWAGA: Ilość dodanego supernatantu wirusa powinna odpowiadać wielokrotności infekcji (MOI) <1.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 440 x g przez 120 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z wirówki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozostawić na noc do wzrostu.</li>
		<li>Po 24 godzinach odwirować komórki i ponownie zawiesić z 5 ml świeżej, ciepłej pożywki na płytce 6-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja komórek zakażonych Cas9
	<ol>
		<li>Odwiruj komórki i ponownie zamieszaj ze świeżym, ciepłym podłożem uzupełnionym 5 μg/ml blasticydyny, 48 godzin po infekcji.</li>
		<li>Wybierz komórki na 9 dni z blastycydyną lub do momentu, gdy niezakażone (negatywne) komórki kontrolne umrą.</li>
		<li>Po zakończeniu selekcji przenieś oporne komórki do podłoża o niższym stężeniu blasticydyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Test reporterowy dla aktywności Cas915
<ol>
	<li>Transdukować komórki rodzicielskie i komórki stabilnie eksprymujące Cas9 za pomocą pXPR-011 przez zakażenie lentiwirusowe (patrz kroki 5.1-5.2). 
	UWAGA: Ten wektor zawiera zarówno GFP, jak i przewodnik przeznaczony dla GFP. Komórki zawierające aktywny Cas9 spowodują zmniejszenie GFP (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2).</li>
	<li>Wybierz komórki przez 3 dni z 2 μg/ml puromycyny, 48 godzin po infekcji</li>.
	<li>Analizować próbki pod kątem ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Redukcja GFP o 50% lub więcej stanowi optymalną aktywność Cas9. Wyższe stężenie selekcji blasticydyny może być wykorzystane do zwiększenia aktywności Cas9, jeśli zaobserwuje się zmniejszenie o mniej niż 50%. Nie wszystkie linie komórkowe tolerują selekcję blasticydyny. W takim przypadku może być konieczne użycie wektorów Cas9 z innymi kasetami wyboru. Ponadto nie wszystkie linie komórkowe tolerują stabilną ekspresję Cas9. W takim przypadku można zastosować transfekcję przejściową Cas9.</li>
</ol>
7. Spinfekcja sgRNA do komórek eksprymujących Cas9
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 5.1-5.2 w przypadku lentiwirusowego zakażenia sgRNA do komórek będących przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: W kroku 5.1.3 zamień konstrukcję pLX_TRC311-Cas9 na konstrukcję lentiGuide-Puro zweryfikowaną w sekcji 4.</li>
	<li>48 godzin po infekcji wybierz komórki przez 3 dni za pomocą 2 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Przenieś oporne komórki do pożywki o niższym stężeniu antybiotyków i kontynuuj selekcję przez kolejne 4 dni, aby umożliwić wystarczającą edycję.</li>
</ol>
8. Transformacja komórkowa Ba/F3 i selekcja pozytywna za pomocą wycofania m-IL3
UWAGA: Ten test jest opisany dla komórek Ba/F3 zależnych od mIL-3, ale może być zastosowany do dowolnej linii komórkowej zależnej od cytokin.
<ol>
	<li>Zakręć wykładniczo rosnące komórki Ba/F3 ektopowo eksprymujące Cas9 i interesujące nas sgRNA.</li>
	<li>Odessać supernatant i przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Odwirować komórki i powtórzyć etap płukania w 8.2 cztery razy (ten krok zapewnia, że podłoże jest wolne od IL-3).</li>
	<li>Odessać PBS i ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki bez IL-3.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub analizatora żywotności komórek.</li>
	<li>Wysiewać komórki w trzech egzemplarzach na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o stężeniu 1 x 105 komórek/ml w całkowitej objętości 2 ml świeżej pożywki bez IL-3.</li>
	<li>Monitoruj i licz komórki co 2 dni, w sumie przez 8 dni. 
	UWAGA: Komórki Ba/F3 pozbawione IL-3 zazwyczaj umierają 2 dni po głodzie IL-3. Ważne jest, aby w teście uwzględnić kontrolę ujemną (zazwyczaj jako kontrolę stosuje się przewodnik nieukierunkowany).</li>
</ol>
9. Selekcja pod kątem edycji CRISPR na miejscu
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery przesiewowe CRISPR przed i za miejscem cięcia sgRNA 
	UWAGA: należy stosować startery co najmniej 100 pz od przewidywanego miejsca rozszczepienia, aby upewnić się, że duża insercja i/lub delecja (indel) w miejscu docelowym sgRNA nie wpłynie na wykrywanie.</li>
	<li>Wyizoluj genomowe DNA (gDNA) z transformowanych komórek (na końcu krzywej wzrostu) oraz z komórek przed wycofaniem cytokin. 
	UWAGA: Zawsze dołączaj komórki z nadekspresją przewodnika niedocelowego jako kontrolę do edycji genów. Wyizolowanie gDNA z komórek przed i po transformacji pozwoli zidentyfikować klony, które zostały pozytywnie wyselekcjonowane i mają przewagę proliferacyjną.</li>
	<li>Zbierz 50 μl PCR z następującymi składnikami: 25 μl mieszanki 2x PCR, 1 μl startera do przodu (10 μM), 1 μl startera odwrotnego (10 μM), 50-100 ng gDNA i H2Odo 50 μL. 
	UWAGA: W kroku 9.3 można zastosować wiele polimeraz o wysokiej wierności.</li>
	<li>Badaj próbki w termocyklerze, stosując następujące parametry: 95°C przez 1 min, 30 cykli (94 °C przez 1 min, 52 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s) i 72 °C przez 10 min. Ten PCR jest zoptymalizowany pod kątem starterów Calr wymienionych w tabeli 3. Zoptymalizuj warunki PCR dla pary starterów zaprojektowanej w kroku 9.1 na podstawie testowania jej na gDNA.</li>
	<li>Umieścić 5 μl próbek w 2% żelu agarozowym przy 10 V/cm przy użyciu 1x buforu tris-octano-EDTA (TAE). Zbadaj próbki pod kątem obecności/braku amplifikowanego prążka odpowiadającego wielkością genowi będącemu przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Pozostałą część reakcji PCR (45 μl) należy wykorzystać do przeprowadzenia oczyszczania PCR.</li>
	<li>Sklonuj amplikony za pomocą zestawu do klonowania PCR do wektora plazmidowego. Na przykład zwykle używane są wektory pGEM T-easy.</li>
	<li>Przekształć plazmid w komórki Stbl3 lub inne kompatybilne komórki i umieść je na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem. Wybierz 10-20 kolonii, przygotuj każdą z nich i poddaj każdy klon sekwencjonowaniu Sangera, aby scharakteryzować indele utworzone w wyniku edycji CRISPR/Cas9. 
	UWAGA: W razie potrzeby sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją pojedynczych komórek (FACS) można przeprowadzić na zbiorczo edytowanej populacji w celu wyizolowania klonu z określonym indelem. Co więcej, metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) mogą być wykorzystane do bardziej niezawodnej kwantyfikacji edycji na miejscu przy użyciu głębokiego sekwencjonowania amplikonów PCR obejmujących region docelowy sgRNA. Na przykład, Tracking of Indels by Decomposition lub TIDE może być użyty zamiast subklonowania do precyzyjnego określenia spektrum i częstotliwości docelowych mutacji generowanych w puli komórek (https://tide.nki.nl/#about)16.</li>
</ol>

<ol><li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Trans Med. 8, 360(2016).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li>
<li>Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+%28CRISPRi%29+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+Gene-knockout+screens+and+target+identification+via+Whole+genome+sequencing+uncover+host+genes+required+for+picornavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection.</a> J Biol Chem. 10, 1074(2017).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4160386/">Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q., Baltimore, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3143116">Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v8/n11/full/nprot.2013.143.html">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucl Acid Res. 42, e168(2014).</li>
<li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).</li>
<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).</li>
<li>Elf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Calreticulin+requires+both+its+mutant+C-terminus+and+the+thrombopoietin+receptor+for+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation.</a> Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Genomic+Deletions+in+Mammalian+Cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9.</a> J. Vis. Exp. (95), e52118(2015).</li>
<li>Watanabe-Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+acquired+mutations+in+transgenes+arising+in+Ba%2FF3+transformation+assays%3A+findings+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations.</a> Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22NatBiotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Tutaj pokazujemy zastosowanie edycji genów CRISPR/Cas9 do badania biologicznej funkcji mutacji CALR w komórkach krwiotwórczych. Sukces tego protokołu w dużym stopniu zależy od wielu czynników. Po pierwsze, ważne jest, aby wiedzieć, jakie rodzaje mutacji mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp. W tym protokole odczytem jest transformacja komórek Ba/F3 do niezależności mIL-3, a typami mutacji są indele w eksonie 9 CALR. Jeśli jednak pożądaną mutacją jest substytucja pojedynczej pary zasad, wówczas pre...

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała ostatnio celowaną edycję genomu w żywych komórkach i organizmach. Stał się niezwykle potężnym narzędziem do badań biomedycznych i jest obecnie wykorzystywany jako potencjalna droga do terapii chorób genetycznych1. Podstawą wszystkich narzędzi do edycji genomu jest tworzenie indukowanego przez nukleazę dwuniciowego pęknięcia DNA (DSB) w locus genomu, które ma być modyfikowane. DSB mogą być naprawiane przez niehomologiczne łączenie końcowe (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR)2,3. Przewagą nukleazy Cas9 nad innymi nukleazami inżynierii genomu, takimi jak nukleazy z palcami cynkowymi (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALENs) jest jego zależność od RNA w celu ukierunkowania nukleazy na pożądaną sekwencję DNA, w porównaniu z interakcjami białko-DNA występującymi w ZFN i TALENs2,3.
Po odkryciu szlaku nukleazy CRISPR/Cas9 jako adaptacyjnego układu odpornościowego w komórkach prokariotycznych4,5, wiele wysiłku włożono w dostosowanie ścieżki do użycia w liniach komórkowych ssaków i organizmach modelowych2,3. Jako narzędzie do edycji genów, szlak CRISPR/Cas9 wykorzystuje dwa główne komponenty: nukleazę Cas9 pochodzącą ze Streptococcus pyogenes (Sp) i sgRNA ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania2,3. sgRNA składa się z 20 nukleotydów, które kierują Cas9 do określonego miejsca w genomie poprzez komplementarność par zasad RNA-DNA2,3. Miejsce docelowe sgRNA musi leżeć w sąsiedztwie miejsca sąsiadującego z protospacerem (PAM) w postaci 5' NGG, który jest rozpoznawany przez nukleazę SpCas9. Dzięki tym narzędziom Cas9 może być skierowany do dowolnej sekwencji DNA, projektując sgRNA, które celują w obszar zainteresowania. Oprócz Cas9 pochodzącego z Sp istnieją dodatkowe warianty Cas9 o różnych funkcjach w zależności od konkretnego zastosowania. Na przykład istnieją warianty Cas9 o wyższej swoistości do edycji na miejscu lub zdolności rozszczepiania pojedynczej nici do nacinania DNA6,7. Co więcej, katalitycznie nieaktywny Cas9 został niedawno opracowany do regulacji transkrypcji8. Naukowcy wykorzystali system CRISPR/Cas9 do różnych zastosowań, takich jak knockin i knockout genów do badania biologicznych funkcji genów9, screens biblioteki utraty funkcji i wzmocnienia funkcji10 oraz inżynierii genetycznej organizmów modelowych11.
W tym protokole łączymy metodologię CRISPR/Cas9 z testem transformacji komórkowej Ba/F3, aby zrozumieć biologiczną funkcję mutacji CALR. Komórki Ba / F3 to mysia linia komórek hematopoetycznych zależna od IL-3, która może być niezależna od IL-3 po ekspresji niektórych onkogenów, takich jak BCR-ABL12. Aby zrozumieć, czy zmutowana kalretykulina może przekształcać komórki B/F3 w wzrost niezależny od cytokin, skupiliśmy się na eksonie 9 endogennego locus Calr za pomocą CRISPR / Cas9 w celu wprowadzenia mutacji indelowych, a następnie wycofaliśmy IL-3 z komórek, aby zastosować dodatnią presję selekcyjną, w celu rekapitulacji wzmocnienia funkcji CALR mutacje stwierdzone u pacjentów z MPN. Protokół obejmuje projektowanie, klonowanie i dostarczanie sgRNA, rozwój stabilnych komórek wykazujących ekspresję Cas9 oraz badania przesiewowe w kierunku docelowej edycji genów CRISPR. Protokół ten może być stosowany do różnych genów i różnych linii komórkowych zależnych od cytokin i jest szczególnie cenny w modelowaniu i badaniu funkcji biologicznych genów zaangażowanych w raka.

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15025</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Stbl3</td><td>Life Technologies</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>51985034</tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna/L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>mIL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pLX_TRC311-Cas9</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>pXPR-011</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Genessee Scientific</td><td>25-507</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td> <td>TAEThermo Fisher Scientific</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #52963</td><td></td></tr><tr><td>PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprepu</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie edycji genów crispr/cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) to adaptacyjny system immunologiczny u prokariontów, który został wykorzystany przez naukowców do generowania nukleaz kierowanych RNA, takich jak CRISPR-associated (Cas) 9 do edycji genomu eukariotycznego specyficznego dla miejsca. Inżynieria genomu Cas9 jest wykorzystywana do wydajnej, łatwej i solidnej modyfikacji endogennych genów w wielu istotnych z biomedycznego punktu widzenia liniach komórkowych i organizmach ssaków. Poniżej pokazujemy przykład, jak wykorzystać metodologię CRISPR/Cas9 do zrozumienia biologicznej funkcji określonych mutacji genetycznych. Modelujemy mutacje kalretykuliny (CALR) w mysich komórkach pro-B zależnych od interleukiny-3 (mIL-3) (Ba/F3) poprzez dostarczanie pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA) ukierunkowanych na endogenne locus Calr w określonym regionie, w którym mutacje CALR insercji i / lub delecji (indel) występują u pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi (MPN), rodzajem raka krwi. SgRNA tworzą podwójne pęknięcia nici (DSB) w docelowym regionie, które są naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), aby uzyskać indele o różnych rozmiarach. Następnie stosujemy standardowy test transformacji komórkowej Ba/F3, aby zrozumieć wpływ ekspresji mutacji Calr na poziomie fizjologicznym na hematopoetyczną transformację komórkową. Podejście to można zastosować do innych genów w celu zbadania ich funkcji biologicznej w różnych liniach komórkowych ssaków.

Stosując opisaną tutaj metodę, celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie efektów funkcjonalnych wprowadzenia mutacji typu indel do endogennego Calr locus transformacji komórek krwiotwórczych. System CRISPR/Cas9 jest wykorzystywany jako narzędzie do tworzenia endogennych Calr mutacje w komórkach Ba/F3. Wybrano dwa sgRNA w celu nakierowania na egzon 9 Calr (Rysunek 1), w regionie, w którym zazwyczaj występują mutacje insercyjne i/l...

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów hematologicznych, takie jak biologiczna funkcja mutacji napędzających, gdy są one wyrażane na poziomie fizjologicznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona system edycji genów CRISPR/Cas9 do modelowania i badania funkcji biologicznych genów zaangażowanych w raka.Aby wyżarzyć i fosforylować oligonukleotydów, dodaj odczynniki do łącznie 10 mikrolitrów w probówce PCR trzymanej na lodzie. Ustaw program w termocyklerze. Użyj wody, aby rozcieńczyć reakcję po zakończeniu cyklu.Aby strawić wektor lentiGuide-Puro, należy przygotować 50 mikrolitrów reakcji trawiennej. Następnie rozpocznij reakcję trawienia w temperaturze 55 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Po godzinie dodaj dodatkowy mikrolitr enzymu restrykcyjnego BsmB1 i kontynuuj reakcję przez kolejną godzinę.Aby zdefosforylować odciętą kość, dodaj siedem mikrolitrów buforu reakcyjnego fosfatazy i dwa mikrolitry enzymu fosfatazy do wektora trawiennego. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Oczyść już przeciętą i zdefosforylowaną kość kręgosłupa za pomocą dostępnego w handlu zestawu.Aby przygotować mieszaninę ligacji, dodaj 15 nanogramów strawionej kości kręgosłupa i innych odczynników do probówki PCR trzymanej na lodzie i dostosuj objętość do 10 mikrolitrów wodą. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przekształć komórki kompatybilne z STBL3 za pomocą dwóch mikrolitrów mieszaniny ligacyjnej.A następnie płytka na glizogennym bulionie agarowym zawierającym 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz trzy kolonie i zaszczep je.Wykonaj mini przygotowanie dla każdej kultury i zsekwencjonuj miejsce insercji oligonukleoty za pomocą startera regionu promotora U6. Wysiewaj komórki hek293t na 10-centymetrowej szalce. I pozostaw go do inkubacji na noc.Aby przygotować mieszaninę DNA do transfekcji, należy odpipetować 45 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do DNA. Za pomocą pipety dokładnie wymieszaj DNA i odczynnik do transfekcji i odstaw na 20 minut. Następnie dodaj mieszaninę transfekcji DNA kroplami na wysiane komórki.Delikatnie zakręć talerzami. I inkubować w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza przez jeden dzień. Zebrać wirusa zawierającego supernatent po 24 i 48 godzinach, przepuszczając go przez filtr 0,22 mikromitera.I podwielokrotność 1,6 mililitra supernatentu w każdej fiolce kriogenicznej. Następnie odessać supernatent i ponownie zawiesić komórki Ba/F3 w pożywce, kilkakrotnie pipetując komórki w górę iw dół. Dodaj 500 mikrolitrów zawieszonych komórek, 1,5 mililitra wirusowego supernatantu, cztery mikrolitry polibrenu i 10 nanogramów na mililitr mysiej interleukiny 3 na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej.Odwirować płytkę o sile 440 G przez 120 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieść płytkę do inkubatora w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie wiruj komórki w temperaturze 440 G przez trzy minuty.I ponownie zawiesić w pięciu mililitrach świeżego ciepłego podłoża na płytce z sześcioma dołkami. Aby wybrać komórki zainfekowane Cas9, najpierw obróć komórkę w dół. A następnie ponownie zawiesić w świeżym, ciepłym podłożu uzupełnionym pięcioma mikrogramami na mililitr blasticydyny po 48 godzinach od nagłości.Kontynuuj selekcję komórek przez dziewięć dni za pomocą blasticydyny, aż wszystkie niezainfekowane komórki umrą. Następnie przenieś oporne komórki do pożywki z jednym mikrogramem na mililitr blasticydyny. Transdukuj komórki rodzicielskie i komórki stabilnie eksprymujące Cas9 za pomocą konstruktu reporterowego pXPR-011 poprzez infekcję lentiwirusową.Kontynuuj selekcję komórek z dwoma mikrogramami na mililitr puromycyny przez trzy dni, 48 godzin po infekcji. Zainfekuj komórki wykazujące ekspresję Cas9 pojedynczym przewodnikowym kwasem rybonukleinowym za pomocą lentiwirusa. Następnie użyj dwóch mikrogramów na mililitr puromycyny, aby wybrać komórki przez trzy dni, 48 godzin po infekcji.Umieść wykładniczo rosnące komórki Ba/F3 wykazujące ekspresję ektopowego Cas9 i interesującego nas pojedynczego przewodnikowego kwasu rybonukleinowego. Odessać supernatent i przemyć komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Odwiruj komórki i trzykrotnie przemyj solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.Następnie policz liczbę komórek za pomocą analizatora żywotności komórek. Następnie komórki nasienne w trzech porcjach w dwóch mililitrach świeżej pożywki bez interleukiny 3 w sześciodołkowych płytkach hodowlanych. Rozpocznij monitorowanie i liczenie komórek co dwa dni przez osiem dni.Reprezentatywne dane psychometryczne przepływu wykazujące aktywność Cas9 w rodzicielskiej komórce B/F3 i komórkach Cas9 z nadekspresją B/F3 przedstawiono tutaj. Sygnał białka zielonej fluorescencji jest zmniejszony o 76% w komórkach Cas9 z nadekspresją Ba / F3, co wskazuje na silną aktywność Cas9, podczas gdy w macierzystych komórkach Ba / F3 sygnał białka zielonej fluorescencji pozostaje na poziomie 100%Reprezentatywne krzywe wzrostu dla komórek wykazujących onkogenną aktywność kalretykuliny pokazano tutaj. Mutacja za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz mutacja przesunięcia ramki ramy jednej pary zasad została wprowadzona do locus eksonu dziewiątego kalretykuliny przy użyciu RNazy z pojedynczym przewodnikiem m1 i m2.Krzywe wzrostu komórek Cas9 receptora trombopoetyny Ba/F3 ukierunkowanego na kalretykulinę wykazują niezależny wzrost mysiej interleukiny 3. Jednak krzywe wzrostu dla innych typów komórek nie wykazują żadnego wzrostu niezależnego od cytokin. Wyniki sekwencjonowania potwierdzają docelową edycję endogynicznego eksonu dziewiątego kalretykuliny w komórkach Cas9 receptora trombopoetyny B/F3 ukierunkowanego na kalretykulinę przy użyciu RNazy m1 i m2 z pojedynczym przewodnikiem.Mutacje przesunięcia ramki plus jedna para zasad są oznaczone kolorem czarnym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, ważne jest, aby zrozumieć, jakiego rodzaju mutacje w genie będącym przedmiotem zainteresowania mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp.Po tej procedurze można zastosować inne metody dalszego charakteryzowania mutacji, takie jak jej rola w sygnalizacji komórkowej lub w interakcjach białek białkowych, aby lepiej zrozumieć mechanizm, za pomocą którego powoduje chorobę. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania wpływu mutacji wzmocnienia funkcji na poziomie fizjologicznym na transformację komórkową w komórkach krwiotwórczych Ba/F3. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać metodologię edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności mutacji wzmocnienia funkcji w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin.Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w obiekcie BL2 plus.

using-crisprcas9-gene-editing-to-investigate-oncogenic-activity

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin. Technika ta pozwala badać aktywność onkogenną mutacji napędzających nowotwory krwi.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Przeglądaj więcej filmów