Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów hematologicznych, takie jak biologiczna funkcja mutacji napędzających, gdy są one wyrażane na poziomie fizjologicznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona system edycji genów CRISPR/Cas9 do modelowania i badania funkcji biologicznych genów zaangażowanych w raka.

Aby wyżarzyć i fosforylować oligonukleotydów, dodaj odczynniki do łącznie 10 mikrolitrów w probówce PCR trzymanej na lodzie. Ustaw program w termocyklerze. Użyj wody, aby rozcieńczyć reakcję po zakończeniu cyklu.

Aby strawić wektor lentiGuide-Puro, należy przygotować 50 mikrolitrów reakcji trawiennej. Następnie rozpocznij reakcję trawienia w temperaturze 55 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Po godzinie dodaj dodatkowy mikrolitr enzymu restrykcyjnego BsmB1 i kontynuuj reakcję przez kolejną godzinę.

Aby zdefosforylować odciętą kość, dodaj siedem mikrolitrów buforu reakcyjnego fosfatazy i dwa mikrolitry enzymu fosfatazy do wektora trawiennego. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Oczyść już przeciętą i zdefosforylowaną kość kręgosłupa za pomocą dostępnego w handlu zestawu.

Aby przygotować mieszaninę ligacji, dodaj 15 nanogramów strawionej kości kręgosłupa i innych odczynników do probówki PCR trzymanej na lodzie i dostosuj objętość do 10 mikrolitrów wodą. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przekształć komórki kompatybilne z STBL3 za pomocą dwóch mikrolitrów mieszaniny ligacyjnej.

A następnie płytka na glizogennym bulionie agarowym zawierającym 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz trzy kolonie i zaszczep je.

Wykonaj mini przygotowanie dla każdej kultury i zsekwencjonuj miejsce insercji oligonukleoty za pomocą startera regionu promotora U6. Wysiewaj komórki hek293t na 10-centymetrowej szalce. I pozostaw go do inkubacji na noc.

Aby przygotować mieszaninę DNA do transfekcji, należy odpipetować 45 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do DNA. Za pomocą pipety dokładnie wymieszaj DNA i odczynnik do transfekcji i odstaw na 20 minut. Następnie dodaj mieszaninę transfekcji DNA kroplami na wysiane komórki.

Delikatnie zakręć talerzami. I inkubować w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza przez jeden dzień. Zebrać wirusa zawierającego supernatent po 24 i 48 godzinach, przepuszczając go przez filtr 0,22 mikromitera.

I podwielokrotność 1,6 mililitra supernatentu w każdej fiolce kriogenicznej. Następnie odessać supernatent i ponownie zawiesić komórki Ba/F3 w pożywce, kilkakrotnie pipetując komórki w górę iw dół. Dodaj 500 mikrolitrów zawieszonych komórek, 1,5 mililitra wirusowego supernatantu, cztery mikrolitry polibrenu i 10 nanogramów na mililitr mysiej interleukiny 3 na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Odwirować płytkę o sile 440 G przez 120 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieść płytkę do inkubatora w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie wiruj komórki w temperaturze 440 G przez trzy minuty.

I ponownie zawiesić w pięciu mililitrach świeżego ciepłego podłoża na płytce z sześcioma dołkami. Aby wybrać komórki zainfekowane Cas9, najpierw obróć komórkę w dół. A następnie ponownie zawiesić w świeżym, ciepłym podłożu uzupełnionym pięcioma mikrogramami na mililitr blasticydyny po 48 godzinach od nagłości.

Kontynuuj selekcję komórek przez dziewięć dni za pomocą blasticydyny, aż wszystkie niezainfekowane komórki umrą. Następnie przenieś oporne komórki do pożywki z jednym mikrogramem na mililitr blasticydyny. Transdukuj komórki rodzicielskie i komórki stabilnie eksprymujące Cas9 za pomocą konstruktu reporterowego pXPR-011 poprzez infekcję lentiwirusową.

Kontynuuj selekcję komórek z dwoma mikrogramami na mililitr puromycyny przez trzy dni, 48 godzin po infekcji. Zainfekuj komórki wykazujące ekspresję Cas9 pojedynczym przewodnikowym kwasem rybonukleinowym za pomocą lentiwirusa. Następnie użyj dwóch mikrogramów na mililitr puromycyny, aby wybrać komórki przez trzy dni, 48 godzin po infekcji.

Umieść wykładniczo rosnące komórki Ba/F3 wykazujące ekspresję ektopowego Cas9 i interesującego nas pojedynczego przewodnikowego kwasu rybonukleinowego. Odessać supernatent i przemyć komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Odwiruj komórki i trzykrotnie przemyj solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.

Następnie policz liczbę komórek za pomocą analizatora żywotności komórek. Następnie komórki nasienne w trzech porcjach w dwóch mililitrach świeżej pożywki bez interleukiny 3 w sześciodołkowych płytkach hodowlanych. Rozpocznij monitorowanie i liczenie komórek co dwa dni przez osiem dni.

Reprezentatywne dane psychometryczne przepływu wykazujące aktywność Cas9 w rodzicielskiej komórce B/F3 i komórkach Cas9 z nadekspresją B/F3 przedstawiono tutaj. Sygnał białka zielonej fluorescencji jest zmniejszony o 76% w komórkach Cas9 z nadekspresją Ba / F3, co wskazuje na silną aktywność Cas9, podczas gdy w macierzystych komórkach Ba / F3 sygnał białka zielonej fluorescencji pozostaje na poziomie 100%Reprezentatywne krzywe wzrostu dla komórek wykazujących onkogenną aktywność kalretykuliny pokazano tutaj. Mutacja za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz mutacja przesunięcia ramki ramy jednej pary zasad została wprowadzona do locus eksonu dziewiątego kalretykuliny przy użyciu RNazy z pojedynczym przewodnikiem m1 i m2.

Krzywe wzrostu komórek Cas9 receptora trombopoetyny Ba/F3 ukierunkowanego na kalretykulinę wykazują niezależny wzrost mysiej interleukiny 3. Jednak krzywe wzrostu dla innych typów komórek nie wykazują żadnego wzrostu niezależnego od cytokin. Wyniki sekwencjonowania potwierdzają docelową edycję endogynicznego eksonu dziewiątego kalretykuliny w komórkach Cas9 receptora trombopoetyny B/F3 ukierunkowanego na kalretykulinę przy użyciu RNazy m1 i m2 z pojedynczym przewodnikiem.

Mutacje przesunięcia ramki plus jedna para zasad są oznaczone kolorem czarnym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, ważne jest, aby zrozumieć, jakiego rodzaju mutacje w genie będącym przedmiotem zainteresowania mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp.

Po tej procedurze można zastosować inne metody dalszego charakteryzowania mutacji, takie jak jej rola w sygnalizacji komórkowej lub w interakcjach białek białkowych, aby lepiej zrozumieć mechanizm, za pomocą którego powoduje chorobę. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania wpływu mutacji wzmocnienia funkcji na poziomie fizjologicznym na transformację komórkową w komórkach krwiotwórczych Ba/F3. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać metodologię edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności mutacji wzmocnienia funkcji w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w obiekcie BL2 plus.