Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar ekspresji genów z konstruktów reporterowych po wprowadzeniu ich do komórek aleuronowych jęczmienia poprzez bombardowanie cząstkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekspresji genów regulowanych hormonami roślinnymi, takie jak to, w jaki sposób określone cząsteczki sygnałowe działają w celu regulacji kwasu abscysynowego w genach indukowanych jęczmieniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wyższą przepustowość niż poprzednie metody, co pozwala na przetestowanie dużej liczby konstruktów genów i warunków inkubacji.

Protokół zademonstruje Grace, studentka w moim laboratorium. Najpierw umieść kilka bezzarodkowych ziaren w pokrywie 90-milimetrowej plastikowej szalki Petriego zawierającej 20 mililitrów roztworu do wchłaniania i 20 mikrolitrów chloramfenikolu. Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie usuń przezroczystą okrywę nasienną z każdego ziarna.

Złuszczenie okrywy nasiennej z ziarna jęczmienia jest krytycznym krokiem. Jeśli okrywy nasienne nie zostaną całkowicie usunięte, mikronośniki złota nie będą mogły dostać się do komórek aleuronowych. Ale jeśli peeling zostanie wykonany zbyt szorstko, komórki aleuronowe mogą zostać uszkodzone.

Po obraniu okrywy nasiennej ze wszystkich ziaren przenieś je z szalki Petriego na płytkę wermikulitową. Następnie umieść obrane ziarna bezzarodkowe w inkubatorze w temperaturze 24 stopni Celsjusza na 16-20 godzin. Teraz oznacz jednopunktową pięciomililitrową tubkę z każdego zabiegu, który zostanie włączony do eksperymentu z bombardowaniem.

Do każdej probówki dodać dwa przecinki po pięć mikrogramów plazmidu kontroli wewnętrznej lucyferazy UBI, dwa przecinki po pięć mikrogramów plazmidu reporterowego GUS i żądaną ilość plazmidu efektorowego. Dodaj ultraczystą wodę do każdej tubki, aby uzyskać całkowitą objętość do pięciu mikrolitrów. Do każdego zabiegu dodaj 50 mikrolitrów mikronośników zawieszonych w 50% glicerolu do każdej pięciomililitrowej probówki zawierającej plazmidowe DNA.

Na ostatnim etapie procedury kodowania mikronośników należy odpipetować osiem mikrolitrów zawieszonych mikronośników na każdy z pięciu makronośników i pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu. Ustaw aparat do bombardowania cząstkami, włączając pompę próżniową, otwierając zawór helu, a następnie włączając system dostarczania cząstek. Umieść płytkę bezpieczeństwa o ciśnieniu 1550 psi w nasadce mocującej i zamontuj ją na systemie dostarczania cząstek.

Umieść makronośnik zawierający żądaną kombinację plazmidów z ekranem zatrzymującym w zespole startowym mikronośnika. Włóż zespół do górnego otworu komory bombardowania. Następnie ułóż osiem bezzarodkowych ziaren w ciasny promienisty wzór z cieńszymi końcami skierowanymi do wewnątrz na okręgu z bibuły filtracyjnej, które jest przyklejone płasko do pokrywki 90-mililitrowej szalki Petriego.

Umieść naczynie z ziarnami w komorze bombardowania w odległości sześciu centymetrów od sita zatrzymującego. Zamknij drzwi i naciśnij przełącznik podciśnienia, aby opróżnić komorę bombardowania do 95 kilopaskalów. Szybko przekręć przełącznik podciśnienia do pozycji wstrzymania.

Następnie przytrzymaj wyłącznik przeciwpożarowy, aby zbombardować próbkę. Po zwolnieniu próżni przenieś bombardowane ziarna na oznakowaną 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą cztery mililitry roztworu do wchłaniania z jednym miligramem na mililitr chloramfenikolu. Powtarzaj, aż wszystkie bombardowania zostaną zakończone.

Następnie inkubuj bombardowane ziarna na platformie wytrząsającej z prędkością 100 obr./min w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Za pomocą kleszczy usuń osiem bombardowanych ziaren z 60-milimetrowej szalki Petriego i osusz je do sucha na ręczniku papierowym. Podziel ziarna na dwie oznaczone dwumililitrowe tubki, z których każda zawiera 800 mikrolitrów buforu do mielenia i pięciomilimetrowy koralik ze stali nierdzewnej.

Po powtórzeniu poprzedniego kroku dla wszystkich bombardowanych ziaren, umieść do 48 dwumililitrowych probówek w dwóch stojakach homogenizatora kulkowego. Następnie zamontuj stojaki na homogenizatorze i potrząsaj próbkami z częstotliwością 30 Hz przez trzy minuty. Po zakończeniu wyjmij stojaki z homogenizatora i umieść je na lodzie na pięć minut, aby ponownie schłodzić próbki.

Teraz zamontuj stojaki na homogenizatorze w przeciwnym kierunku. Ponownie wstrząsnąć próbkami z częstotliwością 30 herców przez trzy minuty. Po wyjęciu stojaków z homogenizatora umieść je na lodzie na pięć minut, aby ponownie schłodzić próbki.

Następnie odwirować ekstrakty zbożowe w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Natychmiast po odwirowaniu zdekantować klarowne supernatanty do drugiego zestawu probówek do mikrowirówek. Krótko zmieszaj każdą tubkę i przechowuj na lodzie.

Po przeniesieniu supernatantu odzyskaj kulki ze stali nierdzewnej z granulek, aby można je było umyć i ponownie wykorzystać. Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu testowego GUS do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Umieść 50 mikrolitrów każdego ekstraktu zbożowego w jednym z dołków i wymieszaj z końcówką pipety.

Następnie uszczelnij górną część płyty folią uszczelniającą. Umieść 96-dołkową płytkę w inkubatorze w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 godzin. Po inkubacji odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 4 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po zakończeniu połóż talerz na lodzie. Teraz dodaj 250 mikrolitrów dwumolowego węglanu sodu w punkcie zerowym do każdej studzienki czarnej 96-dołkowej płytki. Dodać sześć przecinków, dwa pięć mikrolitrów każdej odwirowanej mieszaniny testowej GUS do każdego dołka czarnej płytki i wymieszać z końcówką pipety.

Obejmują studzienki z sześcioma punktami dwoma pięcioma mikrolitrami 10-40 przy 100 mikromolach, cztery methylumbelliferone jako standardy. Umieść czarną płytkę we fluorometrze płytkowym. Odczytać fluorescencję metylumbliferonu ustawiającego wzmocnienie przyrządu, tak aby studzienka zawierająca sześć punktów dwa pięć mikrolitrów 40 mikromolowych, cztery metylolumbelliferon i 250 mikrolitrów punktu zerowego dwa molowe węglanu sodu dawały odczyt 100 jednostek fluorescencji.

W tym eksperymencie konstrukt reporterowy HVA1 GUS został wprowadzony do komórek aleuronowych wraz z konstruktem efektorowym UBI TaABF1. Podczas gdy stosunek TaABF1 HVA1 wynoszący zaledwie zero punkt zero jeden był wystarczający, aby spowodować trzykrotną indukcję genu reporterowego HVA1 przy braku egzogenisu kwasu absyssowego lub ABA. Wyższe poziomy konstruktu TaABF1 skutkowały stopniowo większą ekspresją HVA1 w sposób zależny od dawki.

Zarówno egzogenis ABA, jak i TaABF1 mogą silnie indukować ekspresję konstruktu reporterowego HVA1 GUS. W obu przypadkach obecność jednego butanolu silnie hamowała indukcję HVA1, co sugeruje, że fosfolipaza D może odgrywać ważną rolę w aktywacji ekspresji genu HVA1 przez ABA przez TaABF1. Wykazano, że ABA silnie hamuje indukowaną przez giberelinę ekspresję konstruktu reporterowego GUS Amy32b.

Podczas gdy ani nadtlenek wodoru, ani nitroprusydek sodu nie spowodowały znaczącej redukcji. Wyniki te nie potwierdzają zatem roli tlenku azotu i nadtlenku wodoru w odpowiedziach ABA komórek aleuronowych. Po opanowaniu, technika ta może pozwolić na pomiar wielu różnych próbek pod kątem ekspresji genów w stosunkowo krótkim czasie.

Na przykład bombardowanie 200 różnych próbek ziarna może być wykonane przez dwóch badaczy w ciągu kilku godzin. Następnie, następnego dnia, jeden badacz może przygotować wszystkie ekstrakty białkowe w ciągu dwóch godzin. Zmodyfikowany test GUS przeprowadzany na płytkach 96-dołkowych wymaga również znacznie mniej pracy niż inne protokoły, które są stosowane w przyszłych testach probówkowych.