Name: Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę pomiaru ekspresji genów w warstwach aleuronu jęczmienia z wykorzystaniem bombardowania cząstkami i płytek 96-dołkowych. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia badanie regulacji genów indukowanych kwasem abscysynowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Greysonowi Butlerowi i Margaret Barrett za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów, Judy Stone za porady dotyczące homogenizacji ziarna, a Lynn Hannum za porady dotyczące fluorometrii. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauki (IOB 0443676), przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) przyznaną przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach grantu numer P20GM0103423 oraz przez granty z Wydziału Nauk Przyrodniczych Colby College.

1. Przygotowanie konstruktów genów efektorowych i reporterowych
<ol>
	<li>Zbuduj konstrukty efektorowe, które wykorzystują konstytutywny promotor (np. ubikwitynę kukurydzianą, UBI) do kierowania ekspresją z pożądanej otwartej ramy odczytu. Na przykład, skonstruuj plazmid zawierający UBI::TaABF1, aby wysterować silną konstytutywną ekspresję TaABF15.</li>
	<li>Zbuduj konstrukcje reporterowe, które zawierają promotora, którego aktywność ma być mierzona, umieszczonego przed otwartą ramką odczytu, taką jak GUS. Na przykład, skonstruuj plazmid zawierający HVA1::GUS, aby zmierzyć ekspresję z promotora HVA12,5.</li>
	<li>Zbuduj konstrukt kontroli wewnętrznej (np. UBI::luciferase).</li>
	<li>Korzystając z protokołu kolumny wiążącej krzemionkę (patrz Tabela materiałów), przygotuj wysokiej jakości plazmid dla każdego z wymaganych konstruktów genów. Za pomocą spektroskopii ultrafioletowej (patrz Tabela materiałów) dokładnie zmierz stężenie każdego preparatu plazmidowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ziarna jęczmienia do bombardowania
<ol>
	<li>Skonfiguruj arkusz kalkulacyjny (zobacz Rysunek 1 dla przykładu) wskazujący plazmidy, które będą bombardowane, odpowiednie terapie hormonalne i inne istotne informacje dla każdego leczenia, które będzie częścią eksperymentu.</li>
	<li>Za pomocą deski do krojenia i sterylnej żyletki odetnij zarodki z ziaren jęczmienia himalajskiego (po 40 na każdy zabieg uwzględniony w eksperymencie). Wyklucz ziarna, które są przebarwione lub znacznie mniejsze niż przeciętnie.</li>
	<li>Umieść wszystkie ziarna bez zarodków w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 40 ml wody i kołysz przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wylej wodę (aby uniknąć utraty ziaren) i dodaj 40 ml 10% wybielacza. Kołysz się przez 20 minut.</li>
	<li>Wylej wybielacz i dodaj 40 ml sterylnej wody. Kołysz się przez 5 minut. Powtórz to sterylne mycie wodą jeszcze cztery razy.</li>
	<li>Dodać 40 ml roztworu absorpcyjnego (20 ml bursztynianu sodu, 20 mM chlorku wapnia, pH 5,0) i 40 μl roztworu podstawowego chloramfenikolu (10 mg/ml).</li>
	<li>Przenieść większość roztworu do wchłaniania (z chloramfenikolem) z probówki do płytki wermikulitowej (patrz tabela materiałów). Następnie przenieś ziarna na powierzchnię mokrej bibuły filtracyjnej w płytce wermikulitowej. Rozłóż ziarna równomiernie. Wlej tyle roztworu do wchłaniania, aby ziarna były częściowo (ale nie całkowicie) zanurzone. Umieść pokrywkę na wierzchu płytki wermikulitowej.</li>
	<li>Inkubować ziarna bez zarodków w temperaturze 24 °C przez około 48 godzin przy oświetleniu fluorescencyjnym. W razie potrzeby dodaj dodatkowy roztwór do wchłaniania.</li>
	<li>Otwórz plastikową szalkę Petriego o średnicy 90 mm i wlej 20 ml roztworu do wchłaniania do samego naczynia i 20 ml do odwróconej pokrywki. Do każdego z nich dodać 20 μl chloramfenikolu (10 mg/ml). Wysterylizuj dwie pary cienkich kleszczy punktowych, zanurzając je w alkoholu.</li>
	<li>Umieść kilka ziaren bez zarodków w pokrywie szalki Petriego. Za pomocą kleszczy delikatnie usuń (przezroczystą) okrywę nasienną z każdego ziarna. Usuwając okrywę nasienną z gładkiej strony ziarna, nie uszkadzaj leżących pod nią komórek (aleuronowych). Przenieść obrane ziarno na szalkę Petriego zawierającą roztwór do wchłaniania.</li>
	<li>Po obraniu okrywy nasiennej ze wszystkich ziaren włóż je z powrotem na płytkę wermikulitową. Inkubować obrane ziarna bezzarodkowe w temperaturze 24 °C przez 16 - 20 godzin.</li>
	<li>Tuż przed użyciem ziaren do bombardowania usuń wilgoć z powierzchni, potrząsając nimi między bibułami filtracyjnymi na szalce Petriego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie plazmidowego DNA do bombardowania
<ol>
	<li>Oznacz probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdego zabiegu, który zostanie włączony do eksperymentu z bombardowaniem. Do każdej probówki dodać 2,5 μg plazmidu kontroli wewnętrznej UBI::lucyferazy, 2,5 μg plazmidu reporterowego GUS i pożądaną ilość (zwykle 0,025 μg do 2,5 μg) plazmidu efektorowego. Dodaj wodę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 5 μl.</li>
	<li>Przygotuj mikronośniki złota o grubości 1,6 μm (patrz tabela materiałów) zgodnie z opublikowanymi protokołami6.</li>
	<li>Do każdego zabiegu dodaj 50 μl zawieszonych mikronośników do 1,5 ml probówki zawierającej plazmidowe DNA. Pokryj mikronośniki plazmidowym DNA zgodnie z protokołami producenta6.</li>
	<li>Na ostatnim etapie, gdy mikronośniki pokryte plazmidem są zawieszone w 48 μl 100% etanolu, odpipeuj 8 μl zawieszonych mikronośników na każdy z pięciu makronośników i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
</ol>
4. Bombardowanie cząstkami bezzarodkowych ziaren jęczmienia
<ol>
	<li>Ustaw aparat do bombardowania cząstkami (patrz Tabela materiałów)6.</li>
	<li>Umieść płytkę bezpieczeństwa 1550 psi w nasadce mocującej i zamontuj ją na instrumencie.</li>
	<li>Umieść makronośnik zawierający żądaną kombinację plazmidów (wraz z ekranem zatrzymującym) w zespole startowym mikronośnika. Włóż zespół do górnego otworu komory bombardowania. Ustaw odległość między nasadką ustalającą płytkę bezpieczeństwa a pokrywą pokrywy makronośnika w standardowej odległości (6 mm) i umieść wspornik ekranu oporowego w (standardowym) środkowym położeniu, umożliwiając odległość przesuwu makronośnika 11 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Ułóż 8 bezzarodkowych ziaren w ciasny promienisty wzór (z cieńszymi końcami skierowanymi do wewnątrz) na kółku z bibuły filtracyjnej, które jest przyklejone płasko do pokrywy płytki Petriego o średnicy 90 mm (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Umieść naczynie z ziarnami w komorze bombardowania, w odległości 6 cm od sita zatrzymującego.</li>
	<li>Opróżnić komorę bombardowania do temperatury 95 kPa, a następnie zbombardować próbkę.</li>
	<li>Po zwolnieniu próżni przenieś bombardowane ziarna na oznakowaną szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 4 ml roztworu do wchłaniania zawierającego 1 mg/ml chloramfenikolu.</li>
	<li>Powtarzaj, aż wszystkie bombardowania zostaną zakończone. Inkubować (na platformie wytrząsającej z prędkością 100 obr./min) w temperaturze 24 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja rozpuszczalnego białka z bombardowanych ziaren
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń 8 bombardowanych ziaren z szalki Petriego o średnicy 60 mm i osusz je na ręczniku papierowym. Podziel ziarna na dwie oznakowane probówki o pojemności 2,0 ml (4 ziarna na probówkę) każda zawierająca 800 μl buforu do mielenia (100 mM Na fosforan pH 7,2, 5 mM DTT, 10 μg/ml leupeptyny, 20% glicerolu) i kulkę ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm. Powtórz ten proces dla wszystkich bombardowanych ziaren.</li>
	<li>Umieść (do 48) probówek o pojemności 2,0 ml w dwóch stojakach homogenizatora kulek (patrz Tabela materiałów). Zamontuj stojaki na homogenizatorze.</li>
	<li>Potrząsać próbkami z częstotliwością 30 Hz przez 3 minuty.</li>
	<li>Wyjmij stojaki homogenizatora z homogenizatora i umieść je na lodzie (5 min) w celu ponownego schłodzenia próbek.</li>
	<li>Zamontuj stojaki z powrotem na homogenizatorze - w przeciwnej orientacji. Ponownie wstrząsnąć próbkami przy 30 Hz przez 3 minuty.</li>
	<li>Ostudzić ruszty na lodzie, a następnie powtórzyć kroki od 5.3 do 5.5. Da to w sumie 12 minut potrząsania.</li>
	<li>Odwirować ekstrakty zbożowe w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Natychmiast po odwirowaniu zdekantować klarowne supernatanty do drugiego zestawu probówek do mikrowirówek. Daj każdej tubie szybki wir. Przechowuj probówki na lodzie.</li>
	<li>Po przeniesieniu supernatantu odzyskaj stalowe kulki z granulek, aby można je było umyć i ponownie wykorzystać.</li>
</ol>
6. Pomiar aktywności lucyferazy z ekstraktów zbożowych
<ol>
	<li>Dla każdej probówki z ekstraktem zbożowym, która ma być oznaczona, przygotuj szklaną probówkę o wymiarach 12 mm x 75 mm zawierającą 200 μl mieszaniny testowej lucyferazy (45 mM Trisiarczan pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, 1 mM lucyferyna, 1 mM ATP).</li>
	<li>Dodać 100 μl ekstraktu z pierwszego ziarna do pierwszej probówki testowej. Szybko zmieszaj, aby dobrze wymieszać. Natychmiast umieść rurkę w uchwycie rurki luminometru i zamknij drzwiczki. Po zakończeniu pomiaru wyjmij rurkę z luminometru – pozostawiając otwarte drzwiczki do umieszczenia następnej rurki.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces, aż wszystkie próbki zostaną zmierzone.</li>
</ol>
7. Pomiar aktywności GUS z ekstraktów zbożowych
<ol>
	<li>Dodać 200 μl buforu testowego GUS (50 mM Na fosforan pH 7,2, 2,5 mM 4-metylobemolliferyl-D-glukuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 μg/ml leupeptyny, 20% metanolu, 0,02% azydku sodu) do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieść 50 μl każdego ekstraktu zbożowego w odpowiednim dołku. Po dodaniu wymieszać końcówką. Uszczelnij górę folią uszczelniającą.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C w ciemności przez 20 godzin.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę o sile 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i umieścić ją na lodzie.</li>
	<li>Dodać 250 μl 0,2 M Na2CO3 do każdego dołka czarnej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 6,25 μl każdej odwirowanej mieszaniny testowej GUS do odpowiedniego dołka (zawierającego 0,2 M Na2CO3) czarnej płytki 96-dołkowej. Po dodaniu wymieszać końcówką. Jako wzorce należy uwzględnić studzienki zawierające 6,25 μl 10 μM, 40 μM i 100 μM 4-metylolumbelliferonu.</li>
	<li>Umieścić czarną płytkę we fluorometrze płytkowym i odczytać fluorescencję metylulumbelliferonu. Odczyty należy wykonywać przy długości fali wzbudzenia 360 nm i długości fali emisji 460 nm. Ustaw wzmocnienie przyrządu tak, aby studzienka zawierająca 6,25 μL 40 μM 4-metylolumbelliferonu i 250 μL 0,2 M Na2CO3 dawała odczyt 1000 jednostek fluorescencji.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Wprowadź wartości testów lucyferazy i GUS do arkusza kalkulacyjnego. Należy wykluczyć z rozważań każdą próbkę, w której odczyt lucyferazy jest niższy niż 20 000 względnych jednostek luminescencyjnych s-1, ponieważ oznacza to, że konstrukty genów nie zostały pomyślnie dostarczone do komórek aleuronowych.</li>
	<li>Dla każdego pomyślnie zbombardowanego ekstraktu zbożowego (reprezentującego grupę czterech ziaren bezzarodkowych) oblicz znormalizowane wyrażenie GUS na podstawie surowych danych GUS i lucyferazy w następujący sposób: znormalizowany GUS = [(wyrażenie GUS - ślepa próba GUS) x (2 000 000)] / (wyrażenie lucyferazy – ślepa próba lucyferazy). 
	UWAGA: Normalizuje to ilość aktywności GUS do tego, co można by zaobserwować podczas bombardowania, które dałoby odczyt lucyferazy na poziomie 2 000 000.</li>
	<li>Należy podać względny poziom ekspresji danego konstruktu reporterowego w obecności badanych konstruktów efektorowych lub terapii hormonalnej, porównując go z poziomem ekspresji przy braku efektorów lub hormonów.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
<li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li>
<li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+nature+of+abscisic+acid+%28ABA%29+response+complexes%3B+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li>
<li>Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin%2Fabscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells%3A+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li>
<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
<li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+Res%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li>
<li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+ABA-response+complexes%3A+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+%28Hordeum+vulgare%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li>
<li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li>
<li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li>
<li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li>
<li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin%2Fabscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wprowadzenie konstruktów genów efektorowych poprzez bombardowanie cząstkami, a następnie przejściową ekspresję konstruktów reporterowych jest cenną strategią do analizy roli poszczególnych aktorów w sygnalizacji GA / ABA i w wynikającej z tego ekspresji genów regulowanych hormonami. Jednak istniejące protokoły przeprowadzania takich eksperymentów w komórkach jęczmieniaaleuronowego 2,3,4,5,6 są bardzo pracochłonne.<sup clas...

Warstwa aleuronowa jęczmienia jest dobrze znanym modelowym systemem do badania regulowanej hormonalnie ekspresji genów w roślinach1. W szczególności szereg genów niezbędnych do kiełkowania lub wczesnego rozwoju siewek jest aktywowanych przez giberelinę (GA), podczas gdy geny związane z reakcjami na stres są aktywowane przez kwas abscysynowy (ABA). Szlaki sygnałowe GA i ABA są ze sobą powiązane, ponieważ ekspresja niektórych genów aktywowanych przez GA jest hamowana przez ABA i odwrotnie1.
Cenną strategią dla zrozumienia roli poszczególnych aktorów w sygnalizacji GA/ABA było wprowadzenie konstruktów genów efektorowych poprzez bombardowanie cząsteczkami, a następnie przejściową ekspresję konstruktów reporterowych, które pozwalają na określenie wynikowego wpływu na ekspresję genów w dalszej części strumienia. Zastosowanie genów reporterowych, takich jak GUS (β-glukuronidaza) lub lucyferazy, pozwala na czuły i ilościowy pomiar ekspresji genów specyficznie w komórkach, które otrzymały konstrukt efektorowy. Na przykład wprowadzenie konstruktu efektorowego kodującego czynnik transkrypcyjny TaABF15,6 ustaliło, że geny indukowane przez ABA, takie jak HVA1, są indukowane przez TaABF1, podczas gdy geny indukowane przez GA, takie jak Amy32b, są represjonowane. Bombardowanie cząstkami jako strategia eksperymentalna było wykorzystywane przez wiele laboratoriów do badania różnych aspektów sygnalizacji GA/ABA. Takie prace doprowadziły do identyfikacji elementów promotorowych ważnych dla aktywacji zarówno genów indukowanych przez GA2, jak i indukowanych przez ABA3, oraz do odkrycia kinaz białkowych4 i czynników transkrypcyjnych5, które regulują ekspresję tych genów.
Istniejące protokoły2,3,4,5,6 do bombardowania cząstkami i późniejszego pomiaru przejściowej ekspresji genów są dość pracochłonne, ponieważ każdy zestaw bombardowanych ledwo co drobnych ziaren jest homogenizowany ręcznie w moździerzu i tłuczku, a testy enzymatyczne są przeprowadzane indywidualnie. Niniejszy manuskrypt informuje o ulepszonym protokole, który częściowo automatyzuje i usprawnia etap homogenizacji i testy GUS, aby umożliwić znacznie większą przepustowość, umożliwiając przetestowanie większej liczby zabiegów w tym samym eksperymencie i/lub włączenie większej liczby powtórzeń do każdego zabiegu w celu uzyskania bardziej wiarygodnych statystycznie wyników. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla ekspresji konstruktów reporterowych HVA1 i Amy32b, regulowanych przez czynnik transkrypcyjny TaABF1, a także przez GA, ABA i inne cząsteczki regulatorowe.

<table><tbody><tr><td>Zestaw plazmidowy GeneElute HP Maxiprep</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-vis</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ziarna jęczmienia himalajskiego</td> <td>/</td><td>/</td><td>Odmiana jęczmienia bez łuski (przechowywać w ciemności w temperaturze 4&deg; C)</td></tr> <tr><td>bursztynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Odczynnik do roztworu do wchłaniania</td></tr><tr><td>chlorek wapnia (dihydrat)</td> <td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Odczynnik do wchłaniania roztworu</td></tr><tr><td>Roztwór do wchłaniania</td><td>domowej roboty</td> <td>/</td> <td>20 mM bursztynian sodu, 20 mM chlorek wapnia, pH 5,0. Przed użyciem sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml w 70% etanolu.</td></tr><tr><td>wermikulit</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Używany do płytek wermikulitowych.</td></tr><tr><td>krążki z bibuły filtracyjnej (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Używany do wermikulitu i do przygotowania ziarna przed bombardowaniem</td></tr><tr><td>Talerze wermikulitowe</td><td>domowej roboty</td><td>/</td><td>Dodaj 50 ml wermikulitu do szklanej szalki Petriego. Umieść papierowe kółko o średnicy 90 mm na wierzchu wermikulitu. Autoklaw.</td></tr><tr><td>kleszcze (drobno spiczaste)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Służy do usuwania okrywy nasiennej z ziaren jęczmienia.</td></tr><tr><td>kleszcze (ultra cienki punkt)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Służy do usuwania okrywy nasiennej z ziaren jęczmienia.</td></tr><tr><td>Mikronośniki złota (1,6 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>makronośniki</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia (dwuwodny)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Przygotować 2,5 M roztwór podstawowy i przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy i przechowywać 500 &mu; L podwielokrotności przy -20&deg; C (zużyć w ciągu 2 miesięcy).</td></tr><tr><td>płytki bezpieczeństwa (1550 psi)</td><td>Sitka</td> zatrzymujące <td>1652331</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>Uchwyty</td> makronośników 1652336 <td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistyczny system dostarczania cząstek</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodu fosforan jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Odczynnik do 1M fosforanu sodu pH 7,2</td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Odczynnik do 1M fosforanu sodu pH 7,2</td></tr><tr><td>1M fosforanu sodu pH 7,2</td><td>domowej roboty</td> <td>/</td> <td>Połącz 6,9 g jednowodnego fosforanu sodu jednowodnego z 7,1 g dwuzasadowego fosforanu sodu. Dodaj wodę do 100 ml. Dodaj NaOH, aby uzyskać pH 7,2.</td></tr><tr><td>ditiotrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Rozpuścić w wodzie do 1 M. Przechowywać w temperaturze -20& w 1 ml porcji.</td></tr><tr><td>leupeptyna</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Rozpuścić w wodzie do 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20&deg; </td></tr><tr><td>C.glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Przygotować 50% roztwór w wodzie.</td></tr><tr><td>Bufor mielący</td><td>domowej roboty</td> <td>/</td> <td>Połącz 10 ml 1 M fosforanu sodu pH 7,2, 500 &mu; L z 1 M DTT, 100 &mu; L 10 mg/ml leupeptyny i 40 ml 50% glicerolu. Dodaj wodę do 100 ml.</td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Ten konkretny model probówki jest zalecany do stosowania z homogenizatorem.</td></tr><tr><td>homogenizator perełkowy (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm szklane probówki</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lucyferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Przygotować 25 mM roztwór podstawowy i przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20& C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Przygotuj roztwór podstawowy 100 mM i przechowuj 250 &mu; L podwielokrotności przy -20&deg; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Odczynnik do 1M Tris sulfate pH 7,7.</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Odczynnik do 1M Trisiarczanu pH 7,7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7,7</td><td>domowej roboty</td><td>/</td><td>Rozpuść 12,1 g bazy Tris w 100 ml wody. Dostosuj pH do 7,7 za pomocą kwasu siarkowego.</td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Rozpuścić w wodzie do 2 M.</td></tr><tr><td>Bufor do oznaczania lucyferazy (LAB)</td> <td>domowej roboty</td> <td>/</td> <td>Połącz 3 ml 1 M Trisiarczan pH 7,7, 500 &mu; L 2 M chlorku magnezu, 1 ml 1 M DTT i 200 &mu; L 0,5 M EDTA. Dodaj wodę do 50&nbsp; Ml.</td></tr><tr><td>Mieszanina do oznaczania lucyferazy domowej</td><td>roboty</td> <td>/</td> <td>Połącz 15 ml LAB, 800 &mu; L lucyferyny 25 mM, 200 &mu; L 100 mM ATP i 4 ml wody. To sprawia, że wystarczająca ilość mieszaniny testowej (20&nbsp; mL) dla 100 testów lucyferazy.</td></tr><tr><td>luminometr (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&beta;-D-glukuronid (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Rozpuścić w DMSO do 100 mM.</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Przygotować 2% roztwór podstawowy w wodzie i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20& stopni C.</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe (standardowe)</td><td>Bufor</td><td></td> testowy Fisher 12565501 <td></td></tr><tr><td>GUS</td><td>domowej roboty</td><td>/</td><td>Połącz 2,5 ml MUG, 5 ml 1 M fosforanu sodu pH 7,2, 400 &mu; L 0,5 M EDTA, 1 ml 1 M DTT, 100 &mu; L 10 mg/ml leupeptyny, 20 ml metanolu i 1 ml 2% azydku sodu. Dodaj wodę do 100 ml.</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca TempPlate</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe (czarne)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>węglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Przygotować 200 mM roztwór w wodzie.</td></tr><tr><td>4-metylombelliloron</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Przygotuj 100 &mu; M roztwór w wodzie. Zamrozić 1 ml porcji w temperaturze -20& deg; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>czytnik fluureesencji mikropłytki</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Warstwa aleuronowa ziarna jęczmienia jest ważnym modelowym systemem dla regulowanej hormonalnie ekspresji genów w roślinach. W komórkach aleuronowych geny niezbędne do kiełkowania lub wczesnego rozwoju siewek są aktywowane przez giberelinę (GA), podczas gdy geny związane z reakcjami na stres są aktywowane przez kwas abscysynowy (ABA). Mechanizmy sygnalizacji GA i ABA można badać, wprowadzając konstrukty genów reporterowych do komórek aleuronowych poprzez bombardowanie cząstkami, a wynikową przejściową ekspresję mierzy się za pomocą testów enzymatycznych. Poinformowano o ulepszonym protokole, który częściowo automatyzuje i usprawnia etap homogenizacji ziarna i testów enzymatycznych, umożliwiając znacznie większą przepustowość niż istniejące metody. Homogenizacja próbek ziarna odbywa się za pomocą automatycznego homogenizatora tkankowego, a testy GUS (β-glukuronidazy) są przeprowadzane przy użyciu systemu 96-dołkowych. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu protokołu sugerują, że aktywność fosfolipazy D może odgrywać ważną rolę w aktywacji ekspresji genu HVA1 przez ABA za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego TaABF1.

Opisana tutaj technika może być wykorzystana do wprowadzenia dowolnego testowego konstruktu genu do komórek aleuronu ziaren jęczmienia. Poziom ekspresji testowego genu można następnie wygodnie zmierzyć (Rysunek 2). Przedstawiony tutaj protokół o wyższej przepustowości znacznie zwiększa wydajność etapów mielenia nasion oraz analizy enzymatycznej. Metoda ta została zastosowana do oceny zdolności czynnika transkrypcyjnego TaABF15,</s...

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar ekspresji genów z konstruktów reporterowych po wprowadzeniu ich do komórek aleuronowych jęczmienia poprzez bombardowanie cząstkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekspresji genów regulowanych hormonami roślinnymi, takie jak to, w jaki sposób określone cząsteczki sygnałowe działają w celu regulacji kwasu abscysynowego w genach indukowanych jęczmieniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wyższą przepustowość niż poprzednie metody, co pozwala na przetestowanie dużej liczby konstruktów genów i warunków inkubacji.Protokół zademonstruje Grace, studentka w moim laboratorium. Najpierw umieść kilka bezzarodkowych ziaren w pokrywie 90-milimetrowej plastikowej szalki Petriego zawierającej 20 mililitrów roztworu do wchłaniania i 20 mikrolitrów chloramfenikolu. Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie usuń przezroczystą okrywę nasienną z każdego ziarna.Złuszczenie okrywy nasiennej z ziarna jęczmienia jest krytycznym krokiem. Jeśli okrywy nasienne nie zostaną całkowicie usunięte, mikronośniki złota nie będą mogły dostać się do komórek aleuronowych. Ale jeśli peeling zostanie wykonany zbyt szorstko, komórki aleu

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Poznaj metodę pomiaru ekspresji genów w warstwach aleuronu jęczmienia z wykorzystaniem bombardowania cząstkami i płytek 96-dołkowych. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia badanie regulacji genów indukowanych kwasem abscysynowym.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Przeglądaj więcej filmów