Name: Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę analizy mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego do badania dynamiki pojedynczych cząsteczek na powierzchniach metalowych nanocząstek srebra.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Prof. Y. Ozaki (Uniwersytet Kwansei Gakuin) i Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) za owocną dyskusję na temat tej pracy. Prace te były wspierane przez KAKENHI (Grant-in-Aid for Scientific Research C) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (nr 16K05671).

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie koloidalnych nanocząsteczek srebra20
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć koloidalne nanocząstki srebra, rozpuścić 0,030 g azotanu srebra i 0,030 g cytrynianu trisodu dwuwodnika w 150 mL wody w kolbie okrągłodennej o pojemności 200 mL.</li>
		<li>Wyposażyć kolbę w chłodnicę zwrotną (Dimrotha).</li>
		<li>Mieszać roztwór w kolbie za pomocą mieszadła magnetycznego i Magnetycznego mieszadełka. Następnie podgrzewać mieszany roztwór w kolbie w łaźni olejowej w temperaturze 150 °C przez 60 min. 
		UWAGA: Roztwór zmieni kolor na żółty, a następnie na mlecznoszary.</li>
		<li>Schłodzić zawiesinę do temperatury pokojowej, a następnie przechowywać zawiesinę w kolbie owiniętej folią aluminiową w lodówce. 
		UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół. Koloidalne nanocząstki, po przechowywaniu w lodówce, należy wykorzystać w ciągu jednego miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki do wielobarwnej emisji migoczącej11
	<ol>
		<li>Aby przygotować szkiełko mikroskopowe, umyć ręcznie szklaną płytkę mydłem i opłukać ją wodą.</li>
		<li>Nanieść na szklaną płytkę 0,1% wodny roztwór poli-L-lizyny, a następnie usunąć nadmiar roztworu za pomocą gruszki dmuchawki.</li>
		<li>Nanieść na szklaną płytkę koloidalną zawiesinę srebra i usunąć nadmiar zawiesiny za pomocą gruszki dmuchawki.</li>
		<li>Wyznaczyć obszar kropli na szklanej płytce za pomocą płynnego markera do blokowania.</li>
		<li>Nanieść kroplę wody destylowanej na szklaną płytkę i przykryć ją drugą szklaną płytką, aby stworzyć preparat mikroskopowy i zapobiec parowaniu wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki do jednobarwnego migoczącego SERS7,8,9,10
	<ol>
		<li>Aby przygotować szkiełko mikroskopowe, umyć ręcznie szklaną płytkę mydłem i opłukać ją wodą.</li>
		<li>Wymieszać koloidalną zawiesinę srebra z barwnikiem tiacyjaninowym lub tiakarbocyjaninowym (odpowiednio 25 lub 4 µM) oraz wodnym roztworem NaCl (10 mM) w stosunku objętościowym 2:1:1.</li>
		<li>Nanieść zawiesinę próbki na szklaną płytkę i usunąć nadmiar zawiesiny za pomocą gruszki dmuchawki.</li>
		<li>Wyznaczyć obszar kropli na szklanej płytce za pomocą płynnego markera do blokowania.</li>
		<li>Nanieść wodny roztwór NaCl (1 M) na szklaną płytkę w celu unieruchomienia nanocząsteczek srebra i przykryć go drugą szklaną płytką, aby stworzyć preparat mikroskopowy i zapobiec parowaniu roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obserwacja migotania nanocząsteczek srebra
<ol>
	<li>Oświetlenie próbki
	<ol>
		<li>Umieścić szklaną płytkę z próbką przygotowaną zgodnie z protokołem 1.2 lub 1.3 na stole mikroskopu odwróconego.</li>
		<li>Oświetlić szklaną płytkę z próbką światłem białym poprzez kondensor ciemnego pola i ustawić ostrość na kolorowe plamki (niebieskie, zielone, żółte i czerwone) na płytce szklanej przy użyciu obiektywu (60X).</li>
		<li>Oświetlić szklaną płytkę z próbką za pomocą osłabionej wiązki z lasera DPSS (diode pumped solid state) w trybie ciągłym (cw), dostarczanej pod kątem 30° względem powierzchni próbki przez filtr interferencyjny.</li>
		<li>Aby wykorzystać oświetlenie laserowe do obserwacji nanoagregatów srebra jako jednobarwnych plamek w otoczeniu o tym samym kolorze, przesunąć obszar oświetlenia laserowego na środek pola widzenia i ustawić ostrość na plamki na płytce szklanej poprzez regulację stołu w kierunku z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja migotania
	<ol>
		<li>Wstawić filtr długoprzepustowy za obiektywem i oświetlić szklaną płytkę z próbką wiązką lasera DPSS cw dostarczaną pod kątem 30° względem powierzchni próbki przez filtr interferencyjny.</li>
		<li>Znaleźć migoczące plamki, jak pokazano na Rysunku 1 (patrz również Rysunek S1 w materiale uzupełniającym), przesuwając stół w kierunkach x i y.</li>
		<li>Nagrywać wideo migoczących plamek mikroskopem odwróconym sprzężonym z chłodzoną cyfrową kamerą CCD o rozdzielczości czasowej 61 – 120 ms przez 20 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza migotania SERS
<ol>
	<li>Wyznaczanie profilu czasowego z nagrania wideo
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu sterującym kamerą CCD otwórz plik wideo.</li>
		<li>Aby zaznaczyć migoczące punkty i obszar ciemny, przeciągnij obszary osobno pokrywające regiony z punktami i bez punktów na obrazie wideo.</li>
		<li>Aby wyznaczyć profile czasowe intensywności sygnału z migoczących punktów i obszarów ciemnych w nagraniu wideo, wybierz Temporal Analysis w menu Analysis, a następnie kliknij Calculate w oknie Temporal Analysis.</li>
		<li>Zapisz dane jako plik tekstowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza profilu czasowego
	<ol>
		<li>Wypłaszcz linię bazową profilu czasowego poprzez odjęcie profilu czasowego z obszaru ciemnego i/lub dopasowanie funkcji wielomianowej, jak pokazano na rycinach 2A i 2B.</li>
		<li>Wyznacz średnią intensywność linii bazowej składającą się z około 2000 punktów, Ibase, oraz odchylenie standardowe intensywności linii bazowej, σ, jak pokazano na rycinach 2C i 2D.</li>
		<li>Odróżnij zdarzenia jasne od ciemnych, przyjmując wartości intensywności wyższe niż próg Ibase + 3σ, i zapisz czas trwania każdego zdarzenia. Na przykład na rycinie 3 zapisz zdarzenie od 0 do 3,5476 s jako zdarzenie ciemne (o czasie trwania t = 3,5476 s), a zdarzenie od 3,5476 do 4,0981 s zapisz jako zdarzenie jasne (o czasie trwania t = 0,5505 s). Powtórz procedurę zgodnie z tabelą 1.</li>
		<li>Policz liczbę zdarzeń jasnych i ciemnych dla każdego czasu trwania, zgodnie z pierwszym i drugim wierszem tabeli 2.</li>
		<li>Zsumuj liczbę zdarzeń dla każdego czasu trwania, z wyjątkiem zdarzeń krótszych niż czas t. Na przykład, zgodnie z drugim i trzecim wierszem tabeli 2, zsumuj liczbę zdarzeń dla każdego czasu trwania (z wyjątkiem zdarzeń dla t = 0,0612 s) jako 41 + 18 + 9 + …; wynik równy jest sumie dla t = 0,1223 s, t.j. 103.</li>
		<li>Podziel sumy przez odpowiedni czas trwania, a następnie je znormalizuj. Na przykład, zgodnie z tabelą 2, podziel sumę dla czasu trwania t = 0,0612 s przez czas 0,0612 s. Wynik wynosi 3,351.5791. Następnie podziel ten wynik przez sumę wyników w czwartym wierszu tabeli 2. Wyznaczony rozkład prawdopodobieństwa wynosi 0,64494.</li>
		<li>Przedstaw rozkłady prawdopodobieństwa dla zdarzeń jasnych Pon(t) w funkcji ich czasu trwania t na wykresie logarytmicznym i dopasuj Log10Pon(t) do Log10(<img alt="Równanie matematyczne A_on t^α_on, istotne dla analizy procesów dynamicznych, przedstawione w formie obrazu wzoru." src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">), aby wyznaczyć wykładnik prawa potęgowego αon dla konkretnego migoczącego punktu. Jeśli Pon(t) jest dopasowane do <img alt="Równanie matematyczne A_on t^α_on, istotne dla analizy procesów dynamicznych, przedstawione w formie obrazu wzoru." src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">, dopasowana linia odbiega od punktów pomiarowych przy małych wartościach Pon(t), co pokazano linią przerywaną na rycinie 4A.</li>
		<li>Przedstaw rozkłady prawdopodobieństwa dla zdarzeń ciemnych Poff(t) w funkcji ich czasu trwania t na wykresie logarytmicznym i dopasuj Log10Poff(t) do Log10(<img alt="Równanie zaniku wykładniczego A_off t^α_off exp(-t/τ) dla analizy absorpcji przejściowej." src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">), aby wyznaczyć wykładnik prawa potęgowego αoff oraz czas obcięcia τ  dla tego samego migoczącego punktu. Jeśli Poff(t) jest dopasowane do <img alt="Równanie zaniku wykładniczego A_off t^α_off exp(-t/τ) dla analizy absorpcji przejściowej." src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">, dopasowana krzywa odbiega od punktów pomiarowych przy małych wartościach Poff(t).</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.2.1 do 3.2.8 dla pozostałych migoczących punktów w nagraniu wideo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Qian, X. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%3A+from+fundamental+mechanisms+to+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).</li>
<li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).</li>
<li>Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+-a+single-molecule+and+nanoscale+tool+for+bioanalytics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).</li>
<li>Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKitahama%2C+Y+%22Frontiers+of+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%3A+Single-Nanoparticles+and+Single+Cells%22">Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells</a>. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).</li>
<li>Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2016-1245.ot001">Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245)</a>. , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).</li>
<li>Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L%C3%A9vy+Statistics+of+Vibrational+Mode+Fluctuations+of+Single+Molecules+from+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).</li>
<li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+analysis+of+surface-plasmon-enhanced+electromagnetic+field+dependence+of+blinking+SERS+of+thiacyanine+or+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).</li>
<li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitation+laser+intensity+dependence+of+blinking+SERRS+of+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+using+a+power+law+with+an+exponential+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function.</a> Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).</li>
<li>Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp312530j">Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths.</a> J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).</li>
<li>Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+behaviour+of+molecules+in+dark+SERS+state+on+colloidal+Ag+nanoparticles+estimated+by+truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).</li>
<li>Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.5079/abstract">Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law.</a> J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Surface+Enhanced+Resonance+Raman+Spectroscopy+of+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).</li>
<li>Weiss, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0126863">Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics.</a> J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).</li>
<li>Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examining+the+origins+of+spectral+blinking+in+single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS.</a> Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).</li>
<li>Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+blinking+in+surface+enhanced+resonance+Raman+scattering+and+fluorescence+by+electromagnetic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism.</a> J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).</li>
<li>Willets, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+SERS+hot+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of SERS hot spots.</a> Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).</li>
<li>Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Frequency+Domain+Existence+Proof+of+Single-Molecule+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).</li>
<li>Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029407000726">Power-law intermittency of single emitters.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).</li>
<li>Tang, J., Marcus, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fluorescence+blinking+in+semiconductor+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots.</a> J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).</li>
<li>Lee, P. C., Meisel, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100214a025?src=recsys">Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols.</a> J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).</li>
<li>Krichevsky, O., Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/65/2/203/meta">Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications.</a> Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).</li>
<li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+Chemical+Applications+of+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review.</a> Biochemistry. 41, 697-705 (2002).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Sygnał SERS jest emitowany z złączy nanoagregatów srebra. W związku z tym należy przygotować nanoagregaty, a nie koloidalne nanocząstki pokryte anionami cytrynianu. Agregaty srebra powstają w wyniku efektu wysalania wywołanego dodaniem poli-L-lizyny, która posiada grupę -NH3+ i jest źródłem SERS, lub kationów Na+ z NaCl, jak pokazano na Rysunku S2 w materiale uzupełniającym. Ponadto, aby oświetlić wiele punktów na szerokim obszarze, niefokusowana wiązka lasera jest dostar...

Rozpraszanie Ramana wzmocnione powierzchniowo (SERS) to bardzo czuła spektroskopia Ramana z powierzchni metalu szlachetnego. Ponieważ widmo Ramana dostarcza szczegółowych informacji o strukturze molekularnej w oparciu o ostre pozycje pików, poprzez tryby wibracyjne grup funkcyjnych w cząsteczkach, informacje o pojedynczej cząsteczce na powierzchni metalu można badać za pomocą SERS1,2,3. Z nanoagregatu srebra z adsorbatem na poziomie pojedynczej cząsteczki obserwuje się sygnał1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, a zakres się zmienia1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Mruganie może być wywołane przez pojedynczą cząsteczkę, która losowo porusza się do i ze wzmocnionego pola elektromagnetycznego (EM) na złączu nanoagregatów srebra o rozmiarach nanometrów. Dlatego mruganie jest uważane za prosty dowód na wykrywanie pojedynczych cząsteczek, w porównaniu z techniką wykorzystującą rozkład Poissona intensywności SERS i bi-analit2,3,17. Jednak szczegółowe mechanizmy widma mrugającego i fluktuacyjnego, które może silnie zależeć od zachowania molekularnego na powierzchni Ag, są nadal kontrowersyjne.
W poprzednich badaniach, mrugający SERS był analizowany za pomocą funkcji autokorelacji, która może obliczyć współczynnik dyfuzji i stężenie cząsteczek poruszających się do i z ulepszonego pola EM12,13,14. Co więcej, znormalizowany wynik odchylenia standardowego, który reprezentuje niestabilność całkowitej intensywności, został uzyskany na podstawie profilu czasowego signal15. Jednak te podejścia analityczne mogą opierać się na zachowaniu kilku cząsteczek. W przeciwieństwie do tego, w obrazowaniu mrugającym SERS w superrozdzielczości, można zidentyfikować zachowanie pojedynczej cząsteczki w wzmocnionym polu EM16. Jednak techniki te mogą uzyskać takie parametry tylko w wzmocnionym polu EM. Losowe zachowanie pojedynczej cząsteczki w szerokim zakresie (na przykład w SERS) może być reprezentowane jako prawo potęgowe, a nie średnia4,5,6,7,8,9,10,11, podobnie jak fluorescencja z pojedynczej półprzewodnikowej kropki kwantowej (QD)18,19. Korzystając z analizy prawa potęgowego4,5,6,7,8,9,10,11, zachowanie molekularne można oszacować zarówno w stanie jasnym (w rozszerzonym polu EM), jak i ciemnym10; Oznacza to, że można oszacować zachowanie cząsteczki na całej powierzchni srebra.
Do tej techniki używane są koloidalne nanoagregaty srebra4,5,6,7,8,9,10,11. Te nanoagregaty wykazują różne zlokalizowane pasma powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR), które silnie wpływają na wzmocnione pola elektromagnetyczne, gdy są wzbudzane na określonych długościach fal. W ten sposób aktywne nanocząstki srebra SERS występują w zawiesinie koloidalnej, a niektóre dane można natychmiast uzyskać. W przypadku prostych nanostruktur, które mają określone rozmiary, kształty i układy, zależność LSPR od mrugania SERS może ukrywać inne zależności7; Mianowicie, jeśli zastosuje się dobrą lub złą nanostrukturę do LSPR, parametry będą stałe, a zatem inne zależności będą ukryte. Analiza prawa potęgowego została wykorzystana do odkrycia różnych zależności SERS od koloidalnych nanoagregatów srebra4,5,6,7,8,9,10,11.

<table><tbody><tr><td>Azotan srebra, 99,8%</td><td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny, 99. %</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Wodny roztwór poli-L-lizyny, 0,1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-disulfopropylotiacyjanina, trietyloamina</td><td>Hayashibara Laboratoria Biochemiczne</td><td>NK-2703</td><td>rodzaj barwników tiacyjaninowych</td></tr><tr><td>Sól jodowa 3,3'-dietylo-5,5'-dichloro-9-metylotiakarbocyjaniny</td><td>Hayashibara Laboratoria Biochemiczne</td><td>SMP-9</td><td>rodzaj barwników tiakarobocyjaninowych</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 99,5%</td> <td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Skraplacz Dimroth</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>wyprowadzony z AS ONE</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel olejowa</td><td>Advantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płytka</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>Szkiełko mikroskopowe</td></tr><tr><td>Dmuchawa</td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>Pył powietrzny</td></tr><tr><td>Długopis blokujący płyn</td><td>Daido Sangyo</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Gotowy do użycia hydrofobowy długopis barierowy przeznaczony do zastosowań immunohistochemicznych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60 razy;</td><td>NA 0.7</td></tr><tr><td>Kondensor ciemnego pola</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8&ndash; 0.92</td></tr><tr><td>Chłodzona cyfrowa kamera CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>sterowana za pomocą oprogramowania Aqua Cosmos</td></tr><tr><td>Software dla chłodzonej cyfrowej kamery CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>służy również do wyznaczania profili czasowych z punktów na filmie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolorowa kamera CCD</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>nie służy do analizy</td></tr>, <tr><td>laserowy system laserowy DPSS</td><td>RGB</td><td>NovaPro532-75</td><td>&lambda; = 532 nm; 60 mW (odpowiada gęstości mocy 600 W/cm2)</td></tr><tr><td>Filtr interferencyjny</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rozróżniania i zliczania jasnych/ciemnych zdarzeń</td><td>pokojówka</td><td></td><td>zaprogramowana przez C++</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do montażu według prawa mocy</td><td>LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania ramana wzmocnionego

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Z pojedynczej cząsteczki na styku nanoagregatów srebra obserwuje się mrugające, powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS). W tym miejscu przedstawiono protokół dotyczący przygotowania aktywnego nanoagregatu srebra SERS, nagrania wideo niektórych punktów na obrazie mikroskopowym oraz analizy statystyk mrugania. W tej analizie prawo potęgowe odtwarza rozkłady prawdopodobieństwa jasnych zdarzeń w stosunku do czasu ich trwania. Rozkłady prawdopodobieństwa dla ciemnych zdarzeń są dopasowane przez prawo potęgowe z funkcją wykładniczą. Parametry prawa potęgowego reprezentują zachowanie molekularne zarówno w stanach jasnych, jak i ciemnych. Można oszacować model losowego spaceru i prędkość cząsteczki na całej powierzchni srebra. Jest to trudne do oszacowania nawet przy użyciu średnich, funkcji autokorelacji i obrazowania SERS o wysokiej rozdzielczości. W przyszłości analizy praw potęgowych powinny być łączone z obrazowaniem spektralnym, ponieważ pochodzenia mrugania nie da się potwierdzić samą tą metodą analizy.

W przypadku nanoagregatów srebra z poli-L-lizyną przygotowanych zgodnie z protokołem 1.2 obserwuje się wielokolorowe migoczące plamki w SERS i fluorescencji wzmocnionej powierzchniowo, co przedstawiono na Rysunku 111. W przeciwieństwie do tego, dla nanoagregatów srebra z cząsteczkami barwnika przygotowanych zgodnie z protokołem 1.37,8,9,<...

Ten protokół opisuje analizę mrugającego, wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana spowodowanego losowym chodzeniem pojedynczej cząsteczki po powierzchni srebra przy użyciu praw potęgowych.

Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...

Ogólnym celem tej analizy rozpraszania Ramana wzmocnionego mrugającą powierzchnią jest zbadanie zachowania pojedynczych cząsteczek na powierzchniach nanocząstek metalowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w nauce o interfejsach i koralowcach dotyczące zachowania roboczego granic faz ciał stałych i cieczy Główną zaletą tej techniki jest to, że można zebrać wiele danych, ponieważ w jednym filmie można jednocześnie zaobserwować około tuzina punktów. Aby rozpocząć tę procedurę, umyj dwa szklane szkiełka mikroskopowe płynnym detergentem i wodą z kranu.Opłucz szkiełka wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie nałóż wodny roztwór 0,1% poli-l lizyny na jedno suche szkiełko. Pozostaw roztwór na szkiełku przez dwie do trzech sekund.Następnie za pomocą dmuchawy sprężonego powietrza usuń nadmiar roztworu i wysusz szkiełko. Następnie nałóż zawiesinę koloidalnych nanocząstek srebra na szkiełko. Pozostaw zawieszenie na dwie do trzech sekund.Osuszyć szkiełko sprężonym powietrzem. Następnie użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby całkowicie zamknąć obszar o wymiarach 26 milimetrów na 26 milimetrów na szkiełku. Poczekaj, aż bariera wyschnie.Wrzuć wodę destylowaną na szkiełko, aby wypełnić zamknięty obszar. Przykryj szkiełko drugim czystym, suchym szkiełkiem, aby zapobiec parowaniu wody. Umieść zespół szkiełek na stoliku na próbki odwróconego mikroskopu.Oświetl szkiełko białym światłem przez kondensator ciemnego pola. Skoncentruj się na plamach o różnych kolorach, zmieniając soczewkę obiektywu z 2x na soczewkę obiektywu 60x. Następnie użyj pompowanego diodą lasera półprzewodnikowego o fali ciągłej 532 nanometrów, filtra interferencyjnego pasmowego i soczewki, aby oświetlić próbkę osłabioną wiązką pod kątem 30 stopni w stosunku do powierzchni próbki.Przesuń oświetlenie lasera na środek view i nieznacznie dostosuj kierunek z stolika na próbkę, aby poprawić ostrość na miejscach. Obserwuj skupiska jako monotonne plamy na jednolitym tle. Następnie wyłącz laser i włóż długi filtr krawędziowy za soczewką obiektywu.Oświetl próbkę laserem pod kątem 30 stopni w stosunku do powierzchni próbki, przez filtr interferencyjny i soczewkę zewnętrzną. Przesuń stolik w kierunku x i y, aby znaleźć miejsca. Następnie użyj głębokiej, chłodnej cyfrowej kamery CCD o czasie klatek od 61 do 120 milisekund, aby uzyskać 20-minutowy film z plamami.Aby rozpocząć analizę, otwórz pozyskany obraz wideo w oprogramowaniu kamery CCD. Kliknij i przeciągnij, aby zaznaczyć obszary z plamami i bez nich. Wykonaj analizę czasową, aby uzyskać profil czasowy intensywności sygnału dla plam i ciemnych obszarów.W ten sposób uzyskaj profile dla wszystkich punktów i ciemnych obszarów zainteresowania. Następnie wygeneruj rozkłady prawdopodobieństwa dla jasnych i ciemnych zdarzeń w stosunku do czasu ich trwania. Wielobarwne mrugające plamki zaobserwowano w SERS z nano agregatów srebra, przygotowanych za pomocą szkiełek pokrytych poli-l lizyną.sygnał przypisuje się losowemu spacerowi pojedynczych cząsteczek na połączeniach nano agregatów srebra. Sygnały z pojedynczego nano agregatu wykazywały różną intensywność w czasie, w przeciwieństwie do fluorescencji kropki kwantowej. Próg dla jasnych zdarzeń został ustawiony na trzy odchylenia standardowe powyżej intensywności linii bazowej, a czas trwania jasnych i ciemnych zdarzeń został określony dla każdego punktu.Rozkład prawdopodobieństwa jasnych zdarzeń został wykreślony w stosunku do czasu trwania zdarzenia w postaci linii i wykresu logarytmicznego, podczas gdy rozkład prawdopodobieństwa ciemnych zdarzeń został wykreślony w stosunku do czasu trwania jako krzywa. Ponieważ czas trwania ciemnych zdarzeń był na ogół dłuższy niż czas trwania jasnych parzystych, wykładniki prawa potęgowego dla jasnych zdarzeń były zwykle mniejsze niż te dla ciemnych zdarzeń. Krótsze czasy skracania dla ciemnych zdarzeń wskazywały na szybszy molekularny losowy chód, wyższą barierę energetyczną ze stanu nieemisyjnego do stanu emisyjnego lub kombinację obu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować i analizować zjawisko mrugania SERS.

observation-and-analysis-of-blinking-surface-enhanced-raman-scattering

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Opisujemy konstrukcję spektrometru CW-SBS do szybkiego rozpraszania Brillouiny stymulowanego falami ciągłymi. Spektrometr wykorzystuje lasery diodowe o pojedynczej częstotliwości i atomowy filtr wycinający do pozyskiwania widm transmisyjnych mętnych/niemętnych próbek o wysokiej rozdzielczości spektralnej przy prędkościach do 100 razy większych niż w przypadku istniejących spektrometrów CW-SBS. To ulepszenie umożliwia szybką analizę materiału Brillouina.<br...

Szybki spektrometr rozpraszania Brillouina stymulowany falami ciągłymi do analizy materiałów

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

Poznaj metodę analizy mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego do badania dynamiki pojedynczych cząsteczek na powierzchniach metalowych nanocząstek srebra.

Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego

Przeglądaj więcej filmów