Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego
11 stycznia 2018
Ten protokół opisuje analizę mrugającego, wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana spowodowanego losowym chodzeniem pojedynczej cząsteczki po powierzchni srebra przy użyciu praw potęgowych.
Ogólnym celem tej analizy rozpraszania Ramana wzmocnionego mrugającą powierzchnią jest zbadanie zachowania pojedynczych cząsteczek na powierzchniach nanocząstek metalowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w nauce o interfejsach i koralowcach dotyczące zachowania roboczego granic faz ciał stałych i cieczy Główną zaletą tej techniki jest to, że można zebrać wiele danych, ponieważ w jednym filmie można jednocześnie zaobserwować około tuzina punktów. Aby rozpocząć tę procedurę, umyj dwa szklane szkiełka mikroskopowe płynnym detergentem i wodą z kranu.
Opłucz szkiełka wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie nałóż wodny roztwór 0,1% poli-l lizyny na jedno suche szkiełko. Pozostaw roztwór na szkiełku przez dwie do trzech sekund.
Następnie za pomocą dmuchawy sprężonego powietrza usuń nadmiar roztworu i wysusz szkiełko. Następnie nałóż zawiesinę koloidalnych nanocząstek srebra na szkiełko. Pozostaw zawieszenie na dwie do trzech sekund.
Osuszyć szkiełko sprężonym powietrzem. Następnie użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby całkowicie zamknąć obszar o wymiarach 26 milimetrów na 26 milimetrów na szkiełku. Poczekaj, aż bariera wyschnie.
Wrzuć wodę destylowaną na szkiełko, aby wypełnić zamknięty obszar. Przykryj szkiełko drugim czystym, suchym szkiełkiem, aby zapobiec parowaniu wody. Umieść zespół szkiełek na stoliku na próbki odwróconego mikroskopu.
Oświetl szkiełko białym światłem przez kondensator ciemnego pola. Skoncentruj się na plamach o różnych kolorach, zmieniając soczewkę obiektywu z 2x na soczewkę obiektywu 60x. Następnie użyj pompowanego diodą lasera półprzewodnikowego o fali ciągłej 532 nanometrów, filtra interferencyjnego pasmowego i soczewki, aby oświetlić próbkę osłabioną wiązką pod kątem 30 stopni w stosunku do powierzchni próbki.
Przesuń oświetlenie lasera na środek view i nieznacznie dostosuj kierunek z stolika na próbkę, aby poprawić ostrość na miejscach. Obserwuj skupiska jako monotonne plamy na jednolitym tle. Następnie wyłącz laser i włóż długi filtr krawędziowy za soczewką obiektywu.
Oświetl próbkę laserem pod kątem 30 stopni w stosunku do powierzchni próbki, przez filtr interferencyjny i soczewkę zewnętrzną. Przesuń stolik w kierunku x i y, aby znaleźć miejsca. Następnie użyj głębokiej, chłodnej cyfrowej kamery CCD o czasie klatek od 61 do 120 milisekund, aby uzyskać 20-minutowy film z plamami.
Aby rozpocząć analizę, otwórz pozyskany obraz wideo w oprogramowaniu kamery CCD. Kliknij i przeciągnij, aby zaznaczyć obszary z plamami i bez nich. Wykonaj analizę czasową, aby uzyskać profil czasowy intensywności sygnału dla plam i ciemnych obszarów.
W ten sposób uzyskaj profile dla wszystkich punktów i ciemnych obszarów zainteresowania. Następnie wygeneruj rozkłady prawdopodobieństwa dla jasnych i ciemnych zdarzeń w stosunku do czasu ich trwania. Wielobarwne mrugające plamki zaobserwowano w SERS z nano agregatów srebra, przygotowanych za pomocą szkiełek pokrytych poli-l lizyną.
sygnał przypisuje się losowemu spacerowi pojedynczych cząsteczek na połączeniach nano agregatów srebra. Sygnały z pojedynczego nano agregatu wykazywały różną intensywność w czasie, w przeciwieństwie do fluorescencji kropki kwantowej. Próg dla jasnych zdarzeń został ustawiony na trzy odchylenia standardowe powyżej intensywności linii bazowej, a czas trwania jasnych i ciemnych zdarzeń został określony dla każdego punktu.
Rozkład prawdopodobieństwa jasnych zdarzeń został wykreślony w stosunku do czasu trwania zdarzenia w postaci linii i wykresu logarytmicznego, podczas gdy rozkład prawdopodobieństwa ciemnych zdarzeń został wykreślony w stosunku do czasu trwania jako krzywa. Ponieważ czas trwania ciemnych zdarzeń był na ogół dłuższy niż czas trwania jasnych parzystych, wykładniki prawa potęgowego dla jasnych zdarzeń były zwykle mniejsze niż te dla ciemnych zdarzeń. Krótsze czasy skracania dla ciemnych zdarzeń wskazywały na szybszy molekularny losowy chód, wyższą barierę energetyczną ze stanu nieemisyjnego do stanu emisyjnego lub kombinację obu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować i analizować zjawisko mrugania SERS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje analizę migotania w powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu Ramanowskim wynikającego z błądzenia losowego pojedynczej cząsteczki na powierzchni srebra. Metoda ta umożliwia jednoczesną obserwację wielu migoczących punktów, dostarczając cennych danych na temat zachowania cząsteczek na granicach faz ciało stałe-ciecz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramanowskie
- Analiza pojedynczych cząsteczek
- Oddziaływania nanocząstek metali
Wstęp
- Bada zachowanie pojedynczych cząsteczek na powierzchniach metali.
- Odpowiada na kluczowe pytania z zakresu nauki o interfejsach i koralowcach.
- Wykorzystuje migoczące plamki do gromadzenia danych.
- Koncentruje się na dynamice interfejsu ciało stałe-ciecz.
Cel badania
- Analiza migotania w powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramanowskiej.
- Zrozumienie błądzenia losowego pojedynczych cząsteczek.
- Zebranie obszernych danych na temat oddziaływań międzycząsteczkowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szklanych lam';ek mikroskopowych.
- Nakładanie roztworu poli-L-lizyny.
- Obserwacja migoczących punktów za pomocą wideo.
- Analiza danych z wykorzystaniem praw potęgowych.
Główne wyniki
- Pomyślna obserwacja wielu migoczących plamek.
- Wnioski dotyczące chaotycznego ruchu cząsteczek.
- Dane wspierające zrozumienie zachowania cząsteczek.
- Potwierdzenie skuteczności zastosowanej techniki.
Wnioski
- Technika ta dostarcza cennych informacji na temat dynamiki molekularnej.
- Może być stosowana w różnych badaniach naukowych.
- Umożliwia lepsze zrozumienie granic faz ciało stałe-ciecz.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza migotania w powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramanowskiej (SERS) z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez ujawnienie dynamiki molekularnej na interfejsach metalicznych. Statystyczne modelowanie czasu trwania zdarzeń jasnych i ciemnych za pomocą prawa potęgowego zapewnia pewność prognostyczną w interpretacji zachowania cząsteczek w złożonych środowiskach nanoagregatów. Wnioski te wspierają rzetelną walidację punktów uchwytu i stanowią podstawę do opracowania testów dla biofarmaceutycznych zastosowań wrażliwych powierzchniowo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań molekularnych na granicach faz ciało stałe-ciecz w kontekście wiązania leku z celem terapeutycznym.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację dynamiki błądzenia losowego pojedynczych cząsteczek na powierzchniach nanocząstek.
- Dostarcza parametrów statystycznych do funkcjonalnej walidacji celu w procesach pośredniczonych przez powierzchnię.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie powtarzalnych podłoży aktywnych w SERS do późniejszych analiz ilościowych.
- Zapewnia standaryzowany, wysokoprzepustowy pomiar danych dotyczących zdarzeń migotania w celu zapewnienia powtarzalności testów.
- Umożliwia zastosowanie stabilnego progu odcięcia oraz analizę czasu trwania zdarzeń, co wspiera wiarygodny screening związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje ilościowe ramy pozwalające na powiązanie zachowania powierzchni molekularnych z potencjalnymi biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, dostarczając wglądu mechanistycznego w oddziaływania powierzchniowe.
- Zwiększa wartość prognostyczną w celu zoptymalizowania ryzyka przy wdrażaniu modalności ukierunkowanych na powierzchnię.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda analizy migotania SERS integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, zapewniając ilościowe i powtarzalne odczyty dynamiki molekularnej na granicach międzyfazowych nanoagregatów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w odniesieniu do zdarzeń molekularnych zachodzących na powierzchniach.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych rozkładów czasu trwania zdarzeń w celu standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne – takie jak wykładniki prawa potęgowego i czasy ucięcia – do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Koreluje zachowanie molekuł na powierzchniach z potencjalnym opracowaniem biomarkerów, przy wsparciu dodatkowym obrazowaniem spektralnym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku ramy analityczne dla różnorodnych badań nad nanocząsteczkami i interfejsami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach oddziaływań powierzchniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pozyskiwanie i analizę danych dla skalowalnych, reprodukowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację zachowania cząsteczek na krytycznych interfejsach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów odkrywczych ukierunkowanych na powierzchnie z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu SERS, analizy statystycznej oraz obrazowania pojedynczych cząsteczek.
- Niezbędny jest dostęp do zaawansowanej mikroskopii, oświetlenia laserowego oraz infrastruktury kamer CCD.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów progowania zdarzeń i analizy danych.
- Możlijna jest konieczność adaptacji metody dla różnych układów nanocząsteczek lub chemii powierzchni.
- Interpretacja przyczyn migotania może wymagać uzupełniającego obrazowania spektralnego w celu pełnego wyjaśnienia mechanizmu.
