Pobieranie i ekstrakcja próbek powietrza w miejscu pracy do analizy DNA grzybów

Ogólnym celem tej metodologii pobierania próbek powietrza i ekstrakcji DNA jest uzyskanie genomowego DNA grzybów, które można amplifikować, sekwencjonować i umieszczać taksonomicznie w celu identyfikacji potencjalnych zagrożeń grzybiczych w środowisku zawodowym. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie oceny narażenia zawodowego, takie jak zagrożenia związane z grzybami, na jakie narażeni są pracownicy, a które mogą mieć negatywny wpływ na zdrowie. Główną zaletą tej techniki jest to, że gatunki grzybów, które pozostają niewykryte za pomocą metod opartych na hodowli lub mikroskopii, można wyjaśnić za pomocą metod opartych na sekwencjonowaniu.

Aby zmontować kasetę filtra do pobierania próbek powietrza, umieść celulozową podkładkę filtracyjną na siatkowej powierzchni podstawy, a następnie za pomocą kleszczyków filtracyjnych umieść filtr na podkładce nośnej filtra stroną zbierającą skierowaną do góry. Po zmontowaniu należy uszczelnić kasetę filtra, wkładając osłonę przedłużającą i dociskając ją mocno i równomiernie prasą ręczną lub pneumatyczną. Następnie zamontuj zmontowaną kasetę na próbniku aerozolu NIOSH i dociśnij tak mocno, jak to możliwe.

Użyj kawałka 19-milimetrowej taśmy, aby owinąć wokół zewnętrznej strony kasety filtracyjnej i próbnika, przytrzymując kasetę filtra na miejscu i działając jako uszczelnienie zapasowe, aby zapobiec wyciekom. Przykręcić probówki zbiorcze mocno i całkowicie do próbnika, aż osiągną dno, a następnie owinąć taśmę uszczelniającą wokół probówek, działającą jako wtórne uszczelnienie przed wyciekiem. W celu pobrania osobistego próbki aerozolu należy umieścić próbnik w strefie oddychania danej osoby.

Przymocuj próbnik do klapy, ramienia lub klatki piersiowej, a następnie trzymaj pompę do pobierania próbek na wysokości pasa lub w plecaku. Włącz pompy i po minucie sprawdź, czy pompa działa. Po zakończeniu pobierania próbek powietrza należy pobrać próbnik powietrza od badanego.

Usuń taśmę uszczelniającą, odkręć rurki, a następnie załóż na nie nakrętkę. Umieść trzeci kawałek kasety filtra nad filtrem. Najpierw przetrzyj kasetę do pobierania próbek 70% etanolem, a następnie użyj narzędzia do otwierania kasety, aby otworzyć kasetę do pobierania próbek podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

Następnie użyj podnośnika filtra, aby podnieść podkładkę nośną i przefiltrować do góry. Następnie użyj kleszczyków filtrujących, aby wyjąć filtr i umieścić go na sterylnej szalce Petriego. Pokrój filtr na sześć równych części za pomocą sterylnego skalpela, a następnie umieść je w dwumililitrowej wzmocnionej tubie zawierającej 300 miligramów szklanych kulek o grubości od 200 do 500 mikrometrów.

Zanurz rurkę zawierającą filtr w ciekłym azocie na 30 sekund, a następnie szybko umieść ją w homogenizatorze młynka perełkowego z prędkością 4,5 metra na sekundę na 30 sekund. Dodaj 0,5 mililitra buforu do lizy do probówek zawierających pozostałe małe kawałki nienaruszonego filtra, a następnie dodaj 0,3 mililitra buforu do lizy do probówek zbiorczych 15 i 1,5 mililitra próbnika powietrza i wiruj probówki w pozycji pionowej i odwróconej odpowiednio przez 10 do 15 sekund. Przenieś bufor do lizy z każdej probówki zbiorczej do dwumililitrowych wzmocnionych probówek zawierających 300 miligramów szklanych kulek.

Przetwarzaj probówki w homogenizatorze młynka perełkowego przez 30 sekund, a następnie odwiruj próbki przy 20 000 razy większej grawitacji przez jedną minutę w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś supernatant do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówek i ponownie odwiruj supernatant pod ciśnieniem 20 000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po dodaniu 30 mikrolitrów odczynnika do lizy inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Następnie dodać 0,2 mililitra buforu wiążącego i 100 mikrogramów na mililitr proteinazy K do probówki, a następnie pozostawić probówki do inkubacji w podgrzewaczu blokowym w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów izopropanolu do każdej probówki. Następnie umieść rurki filtracyjne z włókna szklanego o pojemności 700 mikrolitrów w dwumililitrowych probówkach zbiorczych i przenieś do nich roztwory ekstraktu.

Po przeniesieniu odwirować probówki zbiorcze pod ciśnieniem 20 000 razy większym niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu włóż szklane włókno filtracyjne do świeżych probówek zbiorczych i wyrzuć probówkę zbiorczą. Do każdej probówki dodaj 0,5 mililitra buforu do usuwania inhibitora i prowadź wirowanie przy 20 000 razy grawitacji przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść probówki filtracyjne w nowych probówkach zbiorczych. Następnie dodaj 0,5 mililitra buforu do przemywania do każdej probówki i ponownie poddaj wirowaniu w temperaturze 20 000 razy większej niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Wyrzuć probówkę zbiorczą i zastąp ją świeżymi po odwirowaniu.

Ponownie dodaj 0,5 mililitra buforu do płukania do każdej probówki i odwiruj przy 20 000 razy grawitacji przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby usunąć resztki buforu do mycia, na koniec odwirować probówki zbiorcze pod ciśnieniem 20 000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę w temperaturze 22 stopni Celsjusza, a następnie wyrzucić probówki zbiorcze i zastąpić je świeżymi. Po dodaniu 100 mikrolitrów ciepłego buforu elucyjnego, inkubować probówki na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch minut i odwirować probówki zbiorcze przy 20 000 razy grawitacji przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Umieść probówki filtracyjne w sterylnej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i ponownie nałóż eluaty do kolejnego okrągłego wirowania. Użyj 0,5 mililitrowych probówek PCR, aby ustawić 50-mikrolitrowe reakcje w trzech egzemplarzach z pięcioma mikrolitrami już wyekstrahowanego DNA dla każdej reakcji, a następnie zaprogramuj termocykler i rozpocznij cykl. Wymieszaj wszystkie trzy reakcje PCR razem w sterylnych 1,5 mililitrowych probówkach do mikrowirówek.

Dodać 750 mikrolitrów buforu wiążącego i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół 10 razy. Dodać 450 mikrolitrów całkowitej mieszaniny do kolumn wirowych umieszczonych w probówkach zbiorczych i rozpocząć wirowanie przy 17 900-krotności grawitacji przez 30 sekund, a następnie wyrzucić filtrat i dodać pozostałe 450 mikrolitrów mieszaniny do drugiej rundy wirowania. Ponownie wyrzucić filtrat i dodać 750 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumn wirujących i odwirować przy 17 900-krotności grawitacji przez 30 sekund w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Na koniec wyrzuć filtrat i ponownie odwiruj puste kolumny pod ciśnieniem 17 900 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu kolumn wirowych do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra, należy odpipetować 45 mikrolitrów buforu elucyjnego i inkubować probówki na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odwiruj kolumny pod ciśnieniem 17 900 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Zanurz 1% żel agarozowy w jednokrotnym buforze TAE w komorze elektroforetycznej, a następnie wymieszaj dwa mikrolitry pięciokrotnego buforu ładującego z ośmioma mikrolitrami amplifikowanego DNA. Na koniec załaduj całe 10 mikrolitrów próbki na żel wraz z drabinką DNA. Uruchom żel pod napięciem 75 V przez około 90 minut.

Reprezentatywny żel agarozowy wykazuje amplifikację wewnętrznych transkrybowanych regionów dystansowych genomowego DNA grzybów pochodzących z próbek powietrza zawodowego. Pas po lewej stronie reprezentuje pas znacznika DNA. Pasma po prawej stronie reprezentują wewnętrzne transkrybowane obszary dystansowe wzmocnione z różnych próbek powietrza zawodowego o rozmiarach od 750 do 1 000 par zasad.

Reprezentatywny wykres korony pokazuje obecność różnych taksonomicznych gatunków grzybów w środowisku wewnętrznym. Próbnik cyklonów bioaerozolowych NIOSH był używany w domach do zbierania bioaerozoli przez jedną godzinę w celu określenia obecnych gatunków grzybów. Dane tabelaryczne reprezentują wskaźniki różnorodności i bogactwa gatunków grzybów w środowiskach wewnętrznych.

Dane wskazują na wyższe wskaźniki bogactwa Chao-1, wskaźniki różnorodności Shannona i współczynniki odmienności Braya-Curtisa w klimatyzowanych i chłodniejszych środowiskach wyparnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pobierać próbki powietrza w pomieszczeniach i miejscach pracy oraz ekstrahować genomowe DNA do analizy populacji drobnoustrojów. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stosowaniu najlepszych metod aseptycznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikrobiologicznym próbek.