Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Ogólnym celem tego preparatu do rozprzestrzeniania chromatyny jest chronologiczna wizualizacja dynamicznych wzorców lokalizacji białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów oocytów w całej oogenezie ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu kobiet, takie jak parowanie chromosomów homologicznych, synapsa, naprawa DNA i segregacja chromosomów mejotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wyraźne znakowanie immunologiczne i wizualizację białek związanych z chromosomami oraz ocenę ploidii oocytów.

Oogeneza jest podatna na błędy, a błędna segregacja chromosomów często prowadzi do chorób genetycznych. Metoda ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia matczynych przyczyn aneuploidii i niepłodności. Po eutanazji samicy myszy, która jest od 14 do 19 dni po stosunku, wykonaj otwór w kształcie litery V do jamy brzuszno-miednicznej.

Następnie usuń róg macicy matki. Następnie należy oddzielić zarodki od łożyska i złożyć je w ofierze przez ścięcie. Następnie przenieś je na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś jedno szczenię do osobnego naczynia, również załadowanego ciepłym PBS. Po eutanazji płodu wykonaj cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej tylnej połowy, wzdłuż przedniej połowy poniżej kończyn przednich i bezpośrednio nad kończynami tylnymi i ogonem. Następnie otwórz brzuch zarodka za pomocą 3,5-calowych nożyczek.

Za pomocą kleszczy z cienką końcówką przemieszcz lub usuń wątrobę i pętle jelit, odsłaniając gonady. Teraz określ, czy gonady są gonadami męskimi czy żeńskimi. Jajniki znajdują się bezpośrednio poniżej i za nerką, w kierunku tylnej ściany jamy otrzewnej.

Usuń oba jajniki za pomocą kleszczy z cienką końcówką i przenieś je do małego pojemnika zawierającego PBS, który jest utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przystąp szybko, aby pobrać jajniki ze wszystkich płodów. Następnie w nowym małym pojemniku całkowicie zanurz każdy oddzielny zestaw jajników w pół mililitra świeżo przygotowanego buforu hipoekstrakcyjnego.

Pozwól im inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut, ale nie dłużej niż 30 minut. Podczas inkubacji użyj hydrofobowego pisaka PAP z barierą, aby narysować dwa kwadraty o wymiarach 22 na 22 milimetry na czystym szkiełku podstawowym. Przygotuj jedno szkiełko dla każdego zestawu jajników.

Po zakończeniu inkubacji dodaj 50-mikrolitrową kroplę 100-milimolowej sacharozy do czystego szkiełka i przenieś jedną parę jajników do kropli. Teraz użyj dwóch igieł o rozmiarze 27, aby drażnić jajniki i uwalniać znajdujące się w nich komórki. Za pomocą kleszczy usuń i wyrzuć duże kawałki jajnika.

Następnie ostrożnie odpipetować roztwór sacharozy, aby rozproszyć uwolnione komórki. Następnie załaduj każdy kwadrat na szkiełko 40 mikrolitrami 1%PFA z 0,2%Triton X-100. Rozprowadź roztwór po kwadracie za pomocą końcówki pipety lub kołysząc szkiełkiem w przód iw tył.

Następnie dla każdej puli roztworu sacharozy z komórkami załaduj dwie kałuże utrwalające 20 mikrolitrami zawieszonych komórek, tak aby każde szkiełko zawierało komórki z jednego zestawu jajników. W przypadku pobierania komórek jajowych MI lub MII, najpierw przygotuj i poddaj eutanazji mysz dawczyni. Następnie wykonaj duży otwór w kształcie litery V w jamie brzuszno-miednicznej i użyj kleszczy, aby przemieścić jelita, aby zlokalizować każdy róg macicy.

Znajdź jajniki proksymalnie do klatki piersiowej. Przytrzymaj jajowód cienkimi kleszczami i odetnij tłuszcz nad jajnikiem za pomocą nożyczek preparacyjnych. Trzymając jajowód, użyj cienkich kleszczyków, aby uwolnić jajnik z kaletki i przenieś jajniki do naczynia zbiorczego zawierającego pożywkę utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby pobrać oocyty w stadium GV, użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 27, aby uwolnić kompleksy wzgórek-oocyty poprzez ręczne nakłucie dużych pęcherzyków antralnych. Aby zebrać oocyty w stadium MII, wyrwij otwór w bańce jajowodu, aby je uwolnić, zamiast po prostu wykonywać nakłucie. Teraz zbierz oocyty za pomocą szklanej pipety lub kapilary obsługiwanej przez usta lub użyj ręcznej strzykawki mikrometrycznej.

Niektóre oocyty mogą być otoczone komórkami wzgórka, inne nie. W przypadku oocytów MI przygotuj świeżą hialuronidazę w MEM-alfa/BSA, aby usunąć oocyty z otaczających komórek wzgórka. Dla każdej kolekcji oocytów traktuj je w inkubatorze 2,5 mililitra przygotowanej hialuronidazy przez trzy minuty.

Następnie przenieś oocyty MI do świeżo przygotowanej ciepłej pożywki MEM-alfa/BSA. Tam użyj szklanej pipety obsługiwanej przez usta, aby zapewnić siłę ścinającą potrzebną do całkowitego odłączenia komórek wzgórka. Ogólnie rzecz biorąc, powodzenie tej procedury wymaga opanowania pobierania i manipulacji oocytami za pomocą szklanych pipet lub naczyń włosowatych obsługiwanych przez usta.

Pozwól oocytom zregenerować się w inkubatorze. W międzyczasie do rozgrzanej szklanej płytki z dziewięcioma dołkami załaduj 300 mikrolitrów ciepłego roztworu Tyrode. Załaduj dwie studzienki 300 mikrolitrami ciepłego MEM-alpha/BSA i załaduj jedną studzienkę 300 mikrolitrami ciepłej pożywki Waymouth.

Aby usunąć osłonkę przejrzystą, przenieś pięć do 10 oocytów w stadium MI lub MII do kąpieli z roztworem Tyrode'a na zaledwie 30 do 45 sekund, obserwując je pod mikroskopem preparacyjnym. Gdy osłonka przejrzysta widocznie się rozpuści, natychmiast przenieś oocyty do pożywki za pomocą pipety zwilżonej pożywką MEM-alfa/BSA. Następnie przenieś oocyty do drugiej kąpieli w podgrzanym podłożu.

Po drugiej kąpieli przenieś oocyty do ogrzanej pożywki Waymouth i pozwól im dojść do siebie w inkubatorze przez 30 minut. Aby przygotować się do rozprzestrzeniania chromatyny, użyj pisaka PAP, aby narysować prostokąt o wymiarach 11 na 44 milimetry na szkiełku podstawowym. Następnie pokryj szkiełko cienką warstwą 1%PFA z 0,2%Triton X-100 w wodzie, a następnie kołysz szkiełkiem w przód iw tył, aby rozprowadzić roztwór.

Następnie stuknij w slajd, aby usunąć nadmiar. Teraz wysysaj od pięciu do 10 oocytów z minimalną ilością pożywki. Następnie przenieś oocyty na przygotowane szkiełko, jednocześnie przeciągając końcówkę pipety przez roztwór utrwalający i upuszczając oocyty na szkiełko z około jednego centymetra powyżej.

Oocyty powinny natychmiast pęknąć, rozprowadzając chromatynę na szkiełku. Teraz inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w zamkniętej wilgotnej komorze. Pozwól im osiąść na noc, aby chromatyna przylegała do szkiełka.

Opisaną kolekcję chromatyny embrionalnej wykorzystano do ilościowej analizy powstawania krzyżówek w oocytach pobranych z zarodków C57 czarnych/6J. Preparaty rozprowadzające chromatynę profazę znakowano immunologicznie w celu wykrycia SYCP3, SYCP1 i MLH1 oraz barwiono DAPI. Chromosomy w stadium pachytenu miały 27 ognisk MLH1 rozmieszczonych wzdłuż 20 w pełni zmontowanych struktur SC.

Gdy preparat do rozprzestrzeniania się był nieoptymalny, a poszczególne chromosomy były nie do odróżnienia, preparat nie został uwzględniony w ocenie. W dobrych preparatach SMC6 został wzbogacony w regionie heterochromatyny pericentromerowej i wzdłuż ramion chromosomów, a ogniska MLH1 rozmieszczono wzdłuż SC w stadium pachytenu. Liczba krzyżówek MLH1-dodatnich z 15 dobrych preparatów typu dzikiego wynosiła około 24.

Metodę pobierania oocytów wykorzystano do oceny morfologii chromatyny w oocytach po wznowieniu mejozy. Lokalizacja białek, jak również ploidalność, były łatwe do oceny, ujawniając potencjalne przyczyny błędów segregacji chromosomów. Topoizomerazę II-alfa można było zaobserwować wzdłuż ramion chromosomów i heterochromatyny pericentromerowej.

W oocytach MII sparowane chromatydy siostrzane można było rozróżnić na podstawie morfologii chromosomów i centromerów. Po opanowaniu, techniki te bez lub po hodowli można ukończyć w ciągu jednej lub dwóch godzin na mysz. Po tej procedurze można wykonać inne metody uzupełniające, takie jak znakowanie immunologiczne oocytów całej komórki i obrazowanie żywych komórek, w celu oceny chromosomów homologicznych i chromatyd siostrzanych w kontekście komórki.

Podsumowując, opisane tutaj metody rozprzestrzeniania chromatyny można łatwo zastosować do oceny oogenezy ssaków i dymorficznych cech płciowo dynamiki chromosomów i białek podczas mejozy.