Name: Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę stabilnej integracji genu w ludzkich komórkach pierwotnych przy użyciu systemu Sleeping Beauty zapakowanego w wadliwe wektory lentiwirusowe. Technika umożliwia skuteczną terapię genową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Zappavignie, University of Modena i Reggio Emilia, Modena, Włochy za dostarczenie nam plazmidu pCCL-PGKrtTA2S-M2. Doceniamy również prof. Z. Ivicsa (Paul Ehlrich Institute, Langen, Niemcy) i prof. Z. Izvaka (Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrucka, Berlin, Niemcy) za plazmidy pCMVSB100X i pT2/BH. Prace te były wspierane przez DEBRA International oraz włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań.

<ol><li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+system+to+redirect+T-cell+specificity+for+human+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.</a> J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Belay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hyperactive+transposons+for+genetic+modification+of+induced+pluripotent+and+adult+stem+cells%3A+a+nonviral+paradigm+for+coaxed+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation.</a> Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).</li>
<li>Grabundzija, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-based+system+for+cellular+reprogramming+and+targeted+gene+insertion+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).</li>
<li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+sleeping+beauty+transposon-mediated+porcine+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).</li>
<li>Turchiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Sleeping+Beauty+transposon+integration+in+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells.</a> PLoS One. 9 (11), e112712(2014).</li>
<li>Jin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).</li>
<li>Latella, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+Recessive+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa+by+Transposon-Mediated+Integration+of+COL7A1+in+Transplantable+Patient-Derived+Primary+Keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+and+safety+of+an+adenovirus+hybrid-vector+utilizing+hyperactive+sleeping+beauty+transposase+for+somatic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration.</a> PLoS One. 8 (10), e75344(2013).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+adeno-associated+viral+vectors+utilizing+transposase-mediated+somatic+integration+for+stable+transgene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76771(2013).</li>
<li>Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty-baculovirus+hybrid+vectors+for+long-term+gene+expression+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye.</a> J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).</li>
<li>Galla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+cytotoxicity+of+transposases+by+dose-controlled+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).</li>
<li>Moldt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomic+integration+profiling+of+Sleeping+Beauty+transposons+mobilized+with+high+efficacy+from+integrase-defective+lentiviral+vectors+in+primary+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells.</a> Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).</li>
<li>Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+of+functional+transgenes+into+the+human+genome+by+adeno%2FAAV+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors.</a> Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).</li>
<li>Urlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+sequence+space+for+tetracycline-dependent+transcriptional+activators%3A+novel+mutations+yield+expanded+range+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).</li>
<li>Cocchiarella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally+regulated+and+nontoxic+delivery+of+the+hyperactive+Sleeping+Beauty+Transposase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).</li>
<li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+DNA+transposable+elements+from+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mob+Genet+Elements%22%5BJournal%5D)">Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors.</a> Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , 4th edition, (2012).</li>
<li>Dellambra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrective+transduction+of+human+epidermal+stem+cells+in+laminin-5-dependent+junctional+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa.</a> Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię stabilnej integracji GOI z genomem komórek docelowych poprzez transpozycję, w której pośredniczy Śpiąca Królewna. Chociaż system SB został opracowany w celu zapewnienia niewirusowej metody edycji genomu, konieczne jest efektywne dostarczanie maszynerii integracyjnej (transpozazy i transpozonu T2). W związku z tym, aby zastosować system SB na trudno przepuszczalnych komórkach pierwotnych, w ostatnich latach kontynuowano dostarczanie składników SB przez wirusa<s...

Hiperaktywna transpozaza SB100X sprzężona z transpozonem opartym na T2 została już wykorzystana w przedklinicznych zastosowaniach terapii genowej1,2,3, modyfikacje genomu4,5, oraz przeprogramowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)6,7. Zazwyczaj składniki SB są przejściowo dostarczane przez transfekcję plazmidu, a silny promotor konstytutywny napędza ekspresję transpozazy. Jednak pomimo ulepszonych nowych metod transfekcji, dostarczenie systemu dwuskładnikowego pozostaje wyzwaniem dla wielu zastosowań. W związku z tym opracowanie nowego protokołu dostawy cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Oprócz metod transfekcji dla plazmidu8 i mRNA9, dostarczanie wirusa oparte na adenoviral10,11, adenowirus związany (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 i wektory lentiwirusowe15 proponowano to w przeszłości. Warto zauważyć, że wybrany system musi gwarantować przejściowe dostarczanie składników SB bez integracji wektora wirusowego. Niemniej jednak konstytutywna ekspresja transpozazy budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa ze względu na ryzyko niekontrolowanego ponownego skakania transpozonu.
Dlatego pierwszym wyzwaniem jest regulacja transkrypcji SB100X za pomocą wyrafinowanego systemu Tet-ON. Zmodyfikowany promotor reagujący na Tet, uzyskany przez zastąpienie pierwotnie opracowanego minimalnego promotora wirusa cytomegalii (CMV) minimalnym promotorem (-81) genu kinazy bojaźliwej (TK) wirusa opryszczki pospolitej-1 (HSV-1)<klasa sup = "xref">16, jest klonowany przed cDNA SB100X (pTetOTKSB100X). Zmutowany transaktywator odwróconej tetracykliny rtTA2s-M217 ulega ekspresji pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego (promotora fosfoglicerynianu, PGK) sklonowanego w innym plazmidzie (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Po dodaniu do pożywki hodowlanej, dox wiąże modulator rtTA2 s-M2 i wiąże kompleks promotora Tet lub, co skutkuje ściśle regulowaną indukcją SB100X expression18.
Drugim dużym wyzwaniem jest nieefektywna transfekcja ludzkich komórek pierwotnych za pomocą kilku metod fizycznych i chemicznych. Aby skutecznie dostarczać transpozazę do komórek ludzkich odpornych na transfekcję, kasety ekspresyjne SB100X i rtTA2s-M2 są pakowane w dwa wadliwe wektory lentiwirusowe (IDLVs)19: IDLVTKSB i IDLVrtTA2s-M2. Wektory wirusowe są przejściowo wytwarzane jako wektory trzeciej generacji w komórkach HEK293T20 i pseudotypowane glikoproteiną G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G), która nadaje szerokie spektrum infekcji. Cząstki wektorowe są zagęszczane przez ultrawirowanie i miareczkowane przez immunowychwytywanie HIV-1 Gag p24. Aby przetworzyć linie komórkowe i komórki pierwotne, cząstki wektorowe są skompleksowane z polibrenem i są inkubowane z komórkami docelowymi w obecności lub bez dox. Zależną od leku aktywację ekspresji SB100X w transdukowanych komórkach mierzy się za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR)18.
Po zademonstrowaniu regulowanej przez Tet ekspresji SB100X, transpozycja GOI (np. białka zielonej fluorescencji, GFP) do genomu komórki docelowej następuje zgodnie ze zdarzeniami molekularnymi wyraźnie opisanymi przez Baka i Mikkelsena21. Trzeci wektor IDLV zawierający kasetę ekspresyjną dla rządu Indii sklonowaną między transpozonami T2 IR (IDLVT2) musi zostać skonstruowany i zapakowany w sposób opisany powyżej. Wreszcie, trzy wektory IDLV mogą być wykorzystane do efektywnej transdukcji komórek ludzkich (np. pierwotnych keratynocytów) in vitro i integracji GOI w obecności doksycykliny18.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka z 4,5 g / l glukozy bez L-Glutaminy</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>HyClone Płodowa surowica bydlęca (USA), scharakteryzowana</td> przez <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td>Surowica stosowana HEK293T hodowli komórkowej do produkcji cząstek lentiwirusa.</td></tr><tr><td>Penicylina 10.000 UI/ml Streptomycyna 10.000 UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Odczynniki do pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Odczynnik do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Odczynnik do preparatu HBS 2X.</td></tr><tr><td>Bufor HEPES, 1M Zapas w soli fizjologicznej</td><td>Lonza</td><td>BE17-737E</td><td>Odczynnik do przygotowania HBS 2X.</td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy dwuwodny (Na2HPO4&middot; 2H2O), 99.5%</td><td>Merck</td><td>106580</td><td>Odczynnik do przygotowania HBS 2X.</td></tr><tr><td>Kwas solny - odczynnik ACS 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Odczynnik do preparatu HBS 2X.</td></tr><tr><td>Sterylna woda do wstrzykiwań</td><td>Fresenius</td> <td>Kabi-Odczynnik</td> <td>do preparatu HBS 2X.</td></tr><tr><td>0,45 &mikro; m Filtr PESS</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td>Filtry używane do usuwania resztek komórkowych z supernatantu wirusowego.</td></tr><tr><td>Poliallomer Rurki Beckman</td><td>Coulter</td><td>326823</td><td>Rurki do zagęszczania wektorów IDLV przez ultrawirowanie.</td></tr><tr><td>PBS-1X w/o Ca, Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Bufor do przemywania komórek i resuspensji cząstek lentiwirusa.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td> <td>(opcjonalnie) Bufor do resuspensji cząstek lentiwirusa.</td></tr><tr><td>Zestaw do wychwytywania immunologicznego HIV-1 Gag p24</td><td>Zestaw Perkin Elmer</td><td>NEK50001KT</td><td>do miareczkowania cząstek IDLV.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>Odczynnik zwiększający wydajność transdukcji.</td></tr><tr><td>Trypsyna (10X) 2,5% w HBSS bez Ca, Mg</td><td>GIBCO</td><td>BE17-160E</td><td>Odczynnik do oddzielania komórek HeLa (roztwór podstawowy, do rozcieńczenia).</td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>100938B</td><td>Odczynnik AnalaR BDH</td><td>do przygotowania roztworu roboczego trypsyny.</td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA, bez czerwieni fenolowej (10X)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Odczynnik do oddzielania keratynocytów (roztwór podstawowy, do rozcieńczenia).</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dawcy, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>GIBCO</td><td>16030-074</td><td>Serum do hodowli komórek 3T3-J2 myszy szwajcarskiej (warstwa zasilająca).</td></tr><tr><td>Szynka" s F12 media</td><td>GIBCO</td><td>21765</td><td>Pożywka dla keratynocytów.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Serum do pożywki do hodowli komórek HeLa.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenie australijskie</td><td>GIBCO</td><td>10099-141</td><td>Surowica do hodowli ludzkich pierwotnych keratynocytów.</td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Odczynniki do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>VWR</td><td>1152-25</td><td>Odczynniki do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>VWR</td><td>3867-1</td><td>Odczynniki do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Toksyna z Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Odczynniki do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>Odczynniki do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Ludzkie odczynniki EGF</td><td>Austral Biological</td><td>GF-010-9</td><td>do wzrostu keratynocytów.</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-feederowe sprzężone z APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-099</td><td>Do oznaczania warstwy podajnika.</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Zestaw do oczyszczania RNA.</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18080051</td><td>Zestaw do odwrotnej transkryptazy.</td></tr><tr><td>Mieszanina deoksynukleotydów, 10 mM (dNTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7295</td><td>Odczynnik do półilościowego PCR.</td></tr><tr><td>Ultraczysty odczynnik do wody destylowanej bez DNaz / RNaz</td> <td>(dowolny)</td><td></td> <td>do półilościowego PCR i do qRT-PCR.</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Gorący start Polimeraza</td><td>Promega</td><td>M740B</td><td>Polimeraza Taq.</td></tr><tr><td>Agaroza, do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td><td>Invitrogen</td><td>15581028</td><td>Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym, do rozcieńczenia (1X) w ddH2O.</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9891</td><td>lek do indukowania ekspresji transpozazy w komórkach HeLa i keratynocytach</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4304437</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix wraz ze starterami i sondą.</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa z polipropylenu o wysokiej przejrzystości 15 ml, stożkowe dno, z nakrętką z uszczelką kopułkową, sterylne</td> probówki <td>352096 Falcon Corning</td><td></td><td>do zbierania komórek i przygotowania rozcieńczania wektorów.</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm poddane działaniu TC z siatką 20 mm, sterylne</td> naczynie <td>do hodowli komórkowych Falcon Corning</td><td>353025</td><td>do produkcji wirusów.</td></tr><tr><td>6 Dobrze przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem poddawana działaniu TC, z pokrywką, indywidualnie pakowana, sterylna</td> płytka <td>do hodowli komórkowej Falcon Corning</td><td>353046</td><td>do transdukcji HeLa i ludzkich pierwotnych keratynocytów.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, pojemność 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>Probówki do przygotowania rozcieńczalnika.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, pojemność 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Probówki do przygotowania rozcieńczalnika.</td></tr><tr><td>Probówki PCR o pojemności 0,2 ml z płaskimi nakrętkami, probówkami wolnymi od RNazy, DNazy, DNA i inhibitorów PCR</td> (<td>dowolnymi)</td><td></td> <td>do półilościowego PCR.</td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystem</td><td>4346906</td><td>96-dołkowa do qRT-PCR.</td></tr><tr><td>5 ml rurka polistyrenowa z okrągłym dnem, bez nasadki</td><td>Probówki BD Falcon</td><td>352052</td><td>do akwizycji cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne, polistyrenowe, pakowane pojedynczo, sterylne (różne objętości)</td> <td>(dowolne)</td> <td>-</td> <td>pipety do sterylnych zastosowań w hodowli tkanek.</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące, sterylne i wolne od RNaz, DNaz, DNA i pirogenów (różne objętości)</td> <td>(dowolne)</td> <td>-</td> <td>Końcówki filtrujące do zastosowań w sterylnych tkankach i biologii molekularnej.</td></tr><tr><td>pH-metr</td> <td>(dowolny)</td><td>-</td><td>Sprzęt do pomiaru pH HBS 2X.</td></tr><tr><td>PCR Termocykler</td> <td>(dowolny)</td> <td>-</td><td>Sprzęt do półilościowego PCR.</td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym</td> <td>(dowolny)</td> <td>-</td> <td>Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym półilościowego PCR.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td> <td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td><td>BD.</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Zastosowany Biosystem</td><td>7900HT</td><td>Sprzęt do qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Wirówki stołowe do wydajnego przetwarzania próbek w hodowlach komórkowych, chłodzone, z wiadrami na mikropłytki.</td><td>(dowolna)</td><td>-</td><td>Wirówka do przetwarzania kultur komórkowych i spinokulacji.</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L-90K wyposażona w wirnik SW32TI</td><td>Beckman Coulter-Ultrawirówka</td><td></td> <td>do produkcji cząstek lentiwirusowych.</td></tr><tr><td>Sprzęt do laboratorium hodowli komórkowych i biologii molekularnej (np. okap laminarny klasy II przeznaczony do pracy z materiałami BSL2, inkubator kultur komórkowych, lodówki i zamrażarki (+4 & C, -20 &stopnie; C, -80 &deg; C), mikropipety i pomoce do pipetowania).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ochronne fartuchy laboratoryjne, rękawice, środki ochrony twarzy zgodnie z regulaminem Instytutu, w szczególności w zakresie wytwarzania i transdukcji cząstek lentiwirusa.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Transpozon Śpiącej Królewny (SB) to niewirusowy system integrujący o udowodnionej skuteczności w transferze genów i genomice funkcjonalnej. Aby zoptymalizować maszynerię transpozonów SB, stosuje się transpozynę hiperaktywną regulowaną transkrypcją (SB100X) i transpozon oparty na T2. Zazwyczaj transpozaza i transpozon są dostarczane przejściowo przez transfekcję plazmidu, a ekspresja SB100X jest napędzana przez konstytutywny promotor. Tutaj opisujemy skuteczną metodę dostarczania składników SB do komórek ludzkich, które są odporne na kilka metod transfekcji fizycznej i chemicznej, w celu kontrolowania ekspresji SB100X i stabilnej integracji genu zainteresowania (GOI) poprzez mechanizm SB "wytnij i wklej". Ekspresja transpozazy nadaktywnej jest ściśle kontrolowana przez system Tet-ON, szeroko stosowany do kontroli ekspresji genów od 1992 roku. Interesujący gen jest otoczony odwróconymi powtórzeniami (IR) transpozonu T2. Oba składniki SB są upakowane w wadliwe wektory lentiwirusowe przejściowo wytwarzane w komórkach HEK293T. Komórki ludzkie, zarówno linie komórkowe, jak i pierwotne komórki z tkanki ludzkiej, są in vitro przejściowo transdukowane wektorami wirusowymi. Po dodaniu doksycykliny (analogu dox, tetracykliny) do pożywki hodowlanej, mierzy się precyzyjne dostrojenie ekspresji transpozazy, co skutkuje długotrwałą integracją genu będącego przedmiotem zainteresowania w genomie leczonych komórek. Metoda ta jest skuteczna i ma zastosowanie do linii komórkowej (np. komórek HeLa) i komórek pierwotnych (np. ludzkich keratynocytów pierwotnych), a zatem stanowi cenne narzędzie do inżynierii genetycznej i terapeutycznego transferu genów.

Wykorzystując przedstawioną tutaj procedurę, zapakowano trzy wektory IDLV przenoszące regulowane komponenty SB (SB100X, rtTA2S-M2 oraz transpozon T2-GFP), które następnie wykorzystano do wydajnego dostarczenia i ścisłej regulacji systemu SB w komórkach ludzkich. Rysunek 1A przedstawia schemat transdukcji komórek HeLa in vitro, która została przeprowadzona w celu oceny regulacji transkrypcyjnej transpozazy SB przy zastosowaniu optymalnej ko...

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Ogólnym celem tej metody jest osiągnięcie stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem komórek pierwotnych przez regulowany transkrypcyjnie system Sleeping Beauty zapakowany w wadliwe wektory lentiwirusowe z utworzoną integracją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii genowej, takie jak integracja genu będącego przedmiotem zainteresowania z komórkami pierwotnymi za pomocą systemu Sleeping Beauty. Główną zaletą tej techniki jest to, że indukowalny, nadpobudliwy system Sleeping Beauty skutecznie dostarcza pierwotne komórki odporne na kilka metod transfekcji.Procedurę zademonstruje Daniela Benati, post-doc w moim laboratorium. Przed dniem transdukcji ludzkie pierwotne keratynocyty są hodowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odłączyć subkonfluentne keratynocyty w hodowli, usuń pożywkę, umyj komórki 1X PBS i dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego roztworu roboczego trypsyny do każdej studzienki.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Dokładnie zawiesić komórki studzienki i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej zawierającej dwa mililitry pożywki zawierającej surowicę. Przepłukać studzienkę raz trzema mililitrami 1X PBS i dodać wypłukany roztwór do probówki wirówkowej z zawiesiną komórek.Odwirować w temperaturze 580 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Umyj komórki pięcioma mililitrami 1X PBS, odwiruj przy 580 razy g przez pięć minut i wyrzuć supernatant. W 15-mililitrowej probówce polipropylenowej rozcieńczyć 1,6 razy 10 do piątych keratynocytów w jednym mililitrze pożywki CFAD.Przygotować jedno rozcieńczenie dla każdego warunku. Trzy wektory Integration Defect Lentiviral lub IDLV zostały przygotowane wcześniej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. IDLVTKSB posiada regulowane przez TET nadpobudliwe transpozycje SB100X.IDLVrtTA koduje modulator, a IDLVT2 przenosi gen będący przedmiotem zainteresowania. GFP w tym przykładzie otoczony powtórzeniami odwróconymi transpozonami. Rozcieńczyć wektory lentiwirusowe w jednym mililitrze pożywki CFAD w obecności 20 mikrolitrów polibrenu, jak wskazano w tej tabeli.Jeden, dwa i trzy to kontrole ujemne bez wektorów. Cztery i pięć zawierają IDLVTKSB i IDLVrtTA. Sześć, siedem, osiem i dziewiątka zawierają wszystkie trzy wektory lentiwirusowe.Transdukcja komórek w zawiesinie przez dodanie każdego rozcieńczenia wektora lentiwirusowego do odpowiedniej zawiesiny keratynocytów. Usuń pożywkę ze śmiertelnie napromieniowanych komórek zasilających 3T3-J2, które cofnęły się dzień temu, i umieść na nich transdukowane keratynocyty. Po przeprowadzeniu studni przejdź do następnej.Inkubować w temperaturze 25 stopni przez 30 minut. Następnie przenieś komórki do 37 stopni na sześć godzin. Po sześciu godzinach dodaj jeden mililitr pożywki CFAD do każdej studzienki.Dodaj jeden mikromol doksycykliny do studzienek piątej, ósmej i dziewiątej. Przywróć komórki do 37 stopni Celsjusza. Następnie przetwórz komórki w każdej studzience zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Do analizy cytofluorymetrycznej transdukowane pierwotne keratynocyty oderwane w trzecim i szóstym dniu muszą zostać odróżnione od warstwy zasilającej 3T3-J2 poprzez znakowanie komórek mysim monoklonalnym przeciwciałem antyfeederowym sprzężonym APC. Przygotuj cztery mililitry buforu barwiącego dla każdej próbki, łącząc 5% FBS, 500 milimolowych EDTA i 1X PBS. Umyj oderwane komórki jednym mililitrem buforu barwiącego.Odwirować w temperaturze 580 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. W probówce do akwizycji cytometrii przepływowej ponownie zawiesić pięć razy 10 do czwartej komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego. Dodać dwa mikrolitry przeciwciała antyfeederowego w rozcieńczeniu od jednego do 50 i dobrze wymieszać.Inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut. Po 30 minutach przemyć dwoma mililitrami buforu barwiącego. Wirować z prędkością 580 razy g przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Użyj cytometru przepływowego skonfigurowanego z niebieskim laserem, czerwonym laserem i filtrami do wykrywania fluorescencji GFP i APC, aby uzyskać sygnały APC i GFP. Frakcja komórek GFP dodatnia w populacji komórek APC ujemnych wskazuje na transdukowane keratynocyty.Aby przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym, należy przeprowadzić reakcje w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce w końcowej objętości reakcji 25 mikrolitrów. Każda reakcja zawiera jeden mikrolitr cDNA, 12,5 mikrolitra 2X master mix, 1,25 mikrolitra starterów w mieszance 20X probbe i 10,25 mikrolitra sterylnej wody. Uruchom PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z tym programem PCR, jeden cykl w 95 stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie 40 cykli w 95 stopniach Celsjusza przez 15 sekund i 60 stopni Celsjusza przez jedną minutę i przytrzymaj w czterech stopniach Celsjusza.Na koniec przeanalizuj dane PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Analiza ekspresji komórek HeLa transdukowanych rosnącymi dawkami transpozycji w wektorach modulatora plus lub minus doksycyklina wykazała, że wysokie dawki obu IDLV były wymagane do silnej indukcji ekspresji SB100X. Analiza ilościowa ekspresji SB100X na komórkach HeLa transdukowanych wektorem transponującym w obecności lub braku wektora modulatora ujawniła ośmiokrotną aktywację na tle w obecności doksycykliny.Regulowany transkrypcją system Sleeping Beauty może być również stosowany w komórkach pierwotnych. Ekspresja SB100X na keratynocytach transdukowanych za pomocą transpozycji i wektorów modulatora wykazała 15-krotną aktywację w stanie wyłączenia. Eksperyment transpozycji przeprowadzony w keratynocytach transdukowanych trzema wektorami IDLV plus lub minus doksycykliną wykazał, że 12% komórek leczonych doksycykliną stabilnie zintegrowało co najmniej jedną kopię GFP w swoim genomie.Po opanowaniu, niezbędną transdukcję w komórkach pierwotnych można wykonać w ciągu ośmiu godzin, analizę cytofluorymetryczną w dwie godziny, a analizę ekspresji w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji kombinacji dawek wektorowych stosowanych do transdukcji komórek pierwotnych i osiągnięcia wyższego poziomu ekspresji indukowalnej transpozycji Śpiącej Królewny. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR i PCR za pośrednictwem łącznika, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii transpozonów na komórkę i integracja w celu wypełnienia genomu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią genową do zbadania zastosowania systemu Śpiącej Królewny w inżynierii komórek o znaczeniu klinicznym. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak najpierw transdukować pierwotne keratynocyty za pomocą wektorów IDLV. Po drugie, zmierz ekspresję nadpobudliwych transpozycji w stanie doksycykliny i na koniec śledź transpozycję za pomocą cytometrii przepływowej.Nie zapominaj, że praca z wektorami wirusowymi może być bardzo niebezpieczna, dlatego środki ostrożności, takie jak BCL, aby powstrzymać poziom i jednorazowy zapas, powinny być zawsze zabierane ze sobą podczas wykonywania tych procedur.

an-efficient-vitro-transposition-method-transcriptionally-regulated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Ten film opisuje wstrzyknięcie projądrkowe wektorów lentiwirusowych do przestrzeni okołokomórkowej zapłodnionego zarodka myszy. Lentiwirus zawiera transgen, który jest włączany do genomu zapłodnionego zarodka, ostatecznie dając początek transgenicznym myszom.

Wstrzyknięcie periviteliny opartej na wektorze lentiwirusowym: metoda transdukcji interesującego genu do zapłodnionych jednokomórkowych oocytów myszy

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Jaja zapłodnione myszami i zarodki we wczesnym stadium są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów. W artykule opisano protokół perforacji zony za pomocą lasera w celu transdukcji komórek embrionalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych i stworzenia myszy transgenicznych.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Poznaj metodę stabilnej integracji genu w ludzkich komórkach pierwotnych przy użyciu systemu Sleeping Beauty zapakowanego w wadliwe wektory lentiwirusowe. Technika umożliwia skuteczną terapię genową.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Przeglądaj więcej filmów