Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją
12 stycznia 2018
Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.
Ogólnym celem tej metody jest osiągnięcie stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem komórek pierwotnych przez regulowany transkrypcyjnie system Sleeping Beauty zapakowany w wadliwe wektory lentiwirusowe z utworzoną integracją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii genowej, takie jak integracja genu będącego przedmiotem zainteresowania z komórkami pierwotnymi za pomocą systemu Sleeping Beauty. Główną zaletą tej techniki jest to, że indukowalny, nadpobudliwy system Sleeping Beauty skutecznie dostarcza pierwotne komórki odporne na kilka metod transfekcji.
Procedurę zademonstruje Daniela Benati, post-doc w moim laboratorium. Przed dniem transdukcji ludzkie pierwotne keratynocyty są hodowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odłączyć subkonfluentne keratynocyty w hodowli, usuń pożywkę, umyj komórki 1X PBS i dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego roztworu roboczego trypsyny do każdej studzienki.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Dokładnie zawiesić komórki studzienki i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej zawierającej dwa mililitry pożywki zawierającej surowicę. Przepłukać studzienkę raz trzema mililitrami 1X PBS i dodać wypłukany roztwór do probówki wirówkowej z zawiesiną komórek.
Odwirować w temperaturze 580 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Umyj komórki pięcioma mililitrami 1X PBS, odwiruj przy 580 razy g przez pięć minut i wyrzuć supernatant. W 15-mililitrowej probówce polipropylenowej rozcieńczyć 1,6 razy 10 do piątych keratynocytów w jednym mililitrze pożywki CFAD.
Przygotować jedno rozcieńczenie dla każdego warunku. Trzy wektory Integration Defect Lentiviral lub IDLV zostały przygotowane wcześniej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. IDLVTKSB posiada regulowane przez TET nadpobudliwe transpozycje SB100X.
IDLVrtTA koduje modulator, a IDLVT2 przenosi gen będący przedmiotem zainteresowania. GFP w tym przykładzie otoczony powtórzeniami odwróconymi transpozonami. Rozcieńczyć wektory lentiwirusowe w jednym mililitrze pożywki CFAD w obecności 20 mikrolitrów polibrenu, jak wskazano w tej tabeli.
Jeden, dwa i trzy to kontrole ujemne bez wektorów. Cztery i pięć zawierają IDLVTKSB i IDLVrtTA. Sześć, siedem, osiem i dziewiątka zawierają wszystkie trzy wektory lentiwirusowe.
Transdukcja komórek w zawiesinie przez dodanie każdego rozcieńczenia wektora lentiwirusowego do odpowiedniej zawiesiny keratynocytów. Usuń pożywkę ze śmiertelnie napromieniowanych komórek zasilających 3T3-J2, które cofnęły się dzień temu, i umieść na nich transdukowane keratynocyty. Po przeprowadzeniu studni przejdź do następnej.
Inkubować w temperaturze 25 stopni przez 30 minut. Następnie przenieś komórki do 37 stopni na sześć godzin. Po sześciu godzinach dodaj jeden mililitr pożywki CFAD do każdej studzienki.
Dodaj jeden mikromol doksycykliny do studzienek piątej, ósmej i dziewiątej. Przywróć komórki do 37 stopni Celsjusza. Następnie przetwórz komórki w każdej studzience zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Do analizy cytofluorymetrycznej transdukowane pierwotne keratynocyty oderwane w trzecim i szóstym dniu muszą zostać odróżnione od warstwy zasilającej 3T3-J2 poprzez znakowanie komórek mysim monoklonalnym przeciwciałem antyfeederowym sprzężonym APC. Przygotuj cztery mililitry buforu barwiącego dla każdej próbki, łącząc 5% FBS, 500 milimolowych EDTA i 1X PBS. Umyj oderwane komórki jednym mililitrem buforu barwiącego.
Odwirować w temperaturze 580 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. W probówce do akwizycji cytometrii przepływowej ponownie zawiesić pięć razy 10 do czwartej komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego. Dodać dwa mikrolitry przeciwciała antyfeederowego w rozcieńczeniu od jednego do 50 i dobrze wymieszać.
Inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut. Po 30 minutach przemyć dwoma mililitrami buforu barwiącego. Wirować z prędkością 580 razy g przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Użyj cytometru przepływowego skonfigurowanego z niebieskim laserem, czerwonym laserem i filtrami do wykrywania fluorescencji GFP i APC, aby uzyskać sygnały APC i GFP. Frakcja komórek GFP dodatnia w populacji komórek APC ujemnych wskazuje na transdukowane keratynocyty.
Aby przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym, należy przeprowadzić reakcje w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce w końcowej objętości reakcji 25 mikrolitrów. Każda reakcja zawiera jeden mikrolitr cDNA, 12,5 mikrolitra 2X master mix, 1,25 mikrolitra starterów w mieszance 20X probbe i 10,25 mikrolitra sterylnej wody. Uruchom PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z tym programem PCR, jeden cykl w 95 stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie 40 cykli w 95 stopniach Celsjusza przez 15 sekund i 60 stopni Celsjusza przez jedną minutę i przytrzymaj w czterech stopniach Celsjusza.
Na koniec przeanalizuj dane PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Analiza ekspresji komórek HeLa transdukowanych rosnącymi dawkami transpozycji w wektorach modulatora plus lub minus doksycyklina wykazała, że wysokie dawki obu IDLV były wymagane do silnej indukcji ekspresji SB100X. Analiza ilościowa ekspresji SB100X na komórkach HeLa transdukowanych wektorem transponującym w obecności lub braku wektora modulatora ujawniła ośmiokrotną aktywację na tle w obecności doksycykliny.
Regulowany transkrypcją system Sleeping Beauty może być również stosowany w komórkach pierwotnych. Ekspresja SB100X na keratynocytach transdukowanych za pomocą transpozycji i wektorów modulatora wykazała 15-krotną aktywację w stanie wyłączenia. Eksperyment transpozycji przeprowadzony w keratynocytach transdukowanych trzema wektorami IDLV plus lub minus doksycykliną wykazał, że 12% komórek leczonych doksycykliną stabilnie zintegrowało co najmniej jedną kopię GFP w swoim genomie.
Po opanowaniu, niezbędną transdukcję w komórkach pierwotnych można wykonać w ciągu ośmiu godzin, analizę cytofluorymetryczną w dwie godziny, a analizę ekspresji w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji kombinacji dawek wektorowych stosowanych do transdukcji komórek pierwotnych i osiągnięcia wyższego poziomu ekspresji indukowalnej transpozycji Śpiącej Królewny. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR i PCR za pośrednictwem łącznika, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii transpozonów na komórkę i integracja w celu wypełnienia genomu.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią genową do zbadania zastosowania systemu Śpiącej Królewny w inżynierii komórek o znaczeniu klinicznym. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak najpierw transdukować pierwotne keratynocyty za pomocą wektorów IDLV. Po drugie, zmierz ekspresję nadpobudliwych transpozycji w stanie doksycykliny i na koniec śledź transpozycję za pomocą cytometrii przepływowej.
Nie zapominaj, że praca z wektorami wirusowymi może być bardzo niebezpieczna, dlatego środki ostrożności, takie jak BCL, aby powstrzymać poziom i jednorazowy zapas, powinny być zawsze zabierane ze sobą podczas wykonywania tych procedur.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji genu o zainteresowaniu w ludzkim genomie za pomocą transkrypcyjnie regulowanego systemu Śpiąca Piękność. Proces obejmuje przygotowanie defektywnych w integracji wektorów lentiwirusowych, in vitro transdukcję ludzkich komórek oraz analizy molekularne na transdukowanych komórkach.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Genoterapia
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Tło
- System Śpiąca Piękność jest metodą opartą na transpozonach do dostarczania genów.
- Integracja genów w ludzkim genomie jest kluczowa dla stabilnego ekspresji.
- Komórki pierwotne często są odporne na tradycyjne metody transfekcji.
- Ta metoda ma na celu poprawę efektywności integracji genów w komórkach pierwotnych.
Cel badania
- Osiągnięcie stabilnej integracji genu w pierwotnych ludzkich komórkach.
- Wykorzystanie systemu Śpiąca Piękność do efektywnego dostarczania genów.
- Rozwiązanie wyzwań w terapii genowej związanych z transfekcją komórek pierwotnych.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie defektywnych w integracji wektorów lentiwirusowych.
- In vitro transdukcja ludzkich pierwotnych keratynocytów.
- Analizy molekularne do oceny integracji genów.
- Zastosowanie trypsyny do oderwania komórek przed transdukcją.
Główne wyniki
- Demonstracja stabilnej integracji genu w komórkach pierwotnych.
- Efektywne dostarczanie genów za pomocą systemu Śpiąca Piękność.
- Skuteczna transdukcja ludzkich pierwotnych keratynocytów.
- Walidacja analiz molekularnych do oceny integracji.
Wnioski
- System Śpiąca Piękność jest skuteczny w integracji genów w komórkach pierwotnych.
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do zastosowań w terapii genowej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole do badania innych genów o zainteresowaniu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in gene therapy: achieving stable transgene integration in primary human cells resistant to conventional transfection. By combining a transcriptionally regulated hyperactive Sleeping Beauty transposase with integration-defective lentiviral delivery, it enables tunable, efficient genomic modification in therapeutically relevant cell types. The approach supports preclinical de-risking by providing a reproducible platform for functional validation before clinical translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of gene function through stable, inducible genomic integration in primary cells.
- Operational Value: Overcomes transfection limitations in hard-to-transduce primary cells, expanding target validation scope.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isogenic cell populations with defined transgene copy number for consistent phenotypic screening.
- Operational Value: Provides quantitative GFP-based readout via flow cytometry to assess integration efficiency across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports dose-dependent transgene expression tuning via doxycycline, enabling mechanistic de-risking of therapeutic constructs.
- Operational Value: Demonstrated 12% stable integration in primary keratinocytes, establishing a benchmark for preclinical efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling stable cell line generation for target validation and lead optimization studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing controlled, long-term transgene expression in disease-relevant primary cells.
- Screening: Enables assay-ready cell populations with reproducible integration for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantifiable endpoints (GFP+ fraction, qPCR validation) to compare transduction conditions and optimize vector dosing.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by validating transgene performance in primary cells prior to in vivo studies.
- Enterprise Reuse: The IDLV-based delivery system can be adapted across multiple genes of interest and cell types, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in transgene behavior through stable, inducible integration reducing epigenetic silencing risks.
- Operational Value: Standardized workflow using lentiviral transduction and doxycycline induction ensures reproducibility across labs and cell types.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by confirming functional integration before investing in downstream development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene therapy candidates based on demonstrable primary cell engineering efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, primary cell culture, and inducible expression systems.
- Dependent on access to HEK293T packaging cells, flow cytometry, and qPCR instrumentation for validation.
- Necessitates standardization of vector dosing and doxycycline concentration across cell types to ensure consistent transposition efficiency.
- Adaptation to diverse primary cell models may require optimization of transduction conditions and selection markers.
- Practical limitation: Efficiency depends on achieving sufficient co-delivery of transposase, modulator, and transposon vectors, necessitating titer optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Transduction of Human Primary Keratinocytes
4:31
Cytofluorimetric Analysis of Transduced Primary Keratinocytes
6:24
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
7:24
Results: Sleeping Beauty System Achieves Stable Integration of a GOI in the Human Genome
8:40
Conclusion
