Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Ogólnym celem połączenia sieciowania z natywną spektrometrią mas jest uzyskanie uzupełniających informacji strukturalnych na temat wielopodjednostkowych zespołów białkowych, które pomagają wyjaśnić ich trójwymiarowy układ. Sieciowanie chemiczne i natywna spektrometria mas pomagają odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej, takie jak skład, łączność i stechiometria. Główną zaletą łączenia kilku technik jest to, że uzyskuje się informacje uzupełniające, które nie są dostępne tylko za pomocą jednej techniki.

Nasz przepływ pracy można zastosować do każdego innego kompleksu białkowego. Może być oczyszczony z soli lub tkanek lub może być odtworzony z oczyszczonych białek. Najpierw nałóż 7,5 mikrolitra czterokrotnego prostego buforu i trzy mikrolitry 10-krotnego środka redukującego na żądany kompleks białkowy.

Wiruj próbkę przez jedną minutę przy 16 200-krotności grawitacji. Po odwirowaniu podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Przygotuj żel o gradinie od 4 do 12% do elektroforezy i umieść żel w komorze elektroforezy.

Wcześniej przygotowany bufor bieżący rozcieńczyć 20 razy wodą i napełnić komorę elektroforezy. Następnie dodaj 0,5 mililitra antytlenu do komory wewnętrznej. Załadować odpowiedni marker białkowy do pierwszej jamy żelu, a próbki białka do pozostałych jam

Następnie oddziel białka na odpowiedni czas pod napięciem 200 woltów. Aby zabarwić pasma białkowe, przenieś żel do pudełka do barwienia żelu i przykryj żel stojącym roztworem Coomassie na bazie wody. Inkubować żel przez noc w temperaturze pokojowej na poziomym wytrząsarce do żelu.

Następnego dnia odplamić żel, zastępując roztwór barwiący wodą. Powtórz poprzedni krok około trzy do pięciu razy, aż tło żelu stanie się czyste. Teraz odetnij pasma białkowe, które są uwidocznione przez niebieskie plamy Coomassie z żeli za pomocą skalpela.

Ostrożnie pokrój pasma białkowe na małe kawałki o objętości około jeden na jeden mililitr. Następnie umyj pasma białkowe wodą i acetonitrylem. Zredukuj wiązania dwusiarczkowe za pomocą DTT, a następnie alkiluj reszty cysteiny jodoacetamidem.

Następnie trawić białka trypsyną, jak opisano w protokole tekstowym. Aby wyekstrahować peptydy, należy inkubować kawałki żelu z wodorowęglanem amonu i acetonitrylem i zebrać supernatant zawierający peptydy. Następnie inkubować kawałki żelu z 5% kwasem mrówkowym i acetonitrylem i zebrać supernatant zawierający peptydy.

Po zebraniu supernatantu zawierającego peptydy połączyć oba supernatanty i wysuszyć wyekstrahowane peptydy poprzez odparowanie rozpuszczalników w wirówce próżniowej. Po wyschnięciu peptydów wymieszaj je z 20 mikrolitrami 2% roztworu acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Rozpuść peptydy w kąpieli sonikacyjnej przez dwie do trzech minut.

Następnie odwiruj próbkę w wirówce pod ciśnieniem 16 200 razy większym od grawitacji przez 30 minut. Po przeniesieniu próbki do fiolki automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć pięć mikrolitrów do systemu nano LC-MS/MS i załadować mieszaninę peptydów do kolumny wstępnej C18 z odwróconą fazą w celu odsalenia i skoncentrowania peptydów w trybie online. Usunąć bufor magazynowy z kolumny wirowej wykluczającej rozmiar, wirując pod ciśnieniem 1 000 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę.

Po odrzuceniu przepływu, przemyć kolumnę trzykrotnie, dodając 500 mikrolitrów 200 milimolowego octanu amonu, a następnie odwirować. Po odwirowaniu załadować 20 mikrolitrów próbki białka na kolumnę i odwirować przy 1000-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez cztery minuty. Teraz umieść wcześniej przygotowaną kapilę pokrytą złotem w uchwycie kapilarnym.

Otwórz końcówkę igły i wypełnij kapilatę jednym do czterech mikrolitrów próbki białka. Połącz uchwyt kapilarny ze źródłem nanoelektrorozpylania spektrometru masowego i umieść końcówkę kapilary w odległości od 0,5 do 1,5 centymetra od otworu stożka. Użyj od 80 do 150 litrów gazu nanoflow na godzinę, aby zainicjować natryskiwanie i dostosować przepływ gazu, aby utrzymać stabilny rozpylanie.

Dostosuj parametry i stronę strojenia instrumentu Q-TOF. Następnie rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Zdobądź i połącz jak najwięcej skanów, aby uzyskać dobre widmo masowe. Rozpuść 1,43 miligrama BS3 i 100 mikrolitrów wody, aby przygotować 25-milimolowy roztwór podstawowy.

Następnie dodaj BS3 do kompleksu białkowego. Użyj różnych ilości BS3, aby określić optymalne stężenie środka sieciującego. Mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę w termomikserze.

Teraz wykonaj stronę SDS usieciowanych białek za pomocą żelu o gradiacji od czterech do 12%. Przetnij pasma żelu i strawij białko przez trawienie w żelu, jak opisano wcześniej. Po uzyskaniu peptydów z trawienia w żelu należy przeprowadzić spektrometrię mas sprzężoną z chromatografią cieczową, jak opisano wcześniej.

Wszystkie podjednostki białkowe heterododekameru RvB1/B2 i heterooktamerycznych kompleksów CPS zidentyfikowano z dużą pewnością. Widmo masowe RvB1/RvB2 ujawnia dwa gatunki, które odpowiadają podwójnym pierścieniom heksamerycznym i dodekamerycznym. Struktura krystaliczna kompleksu RvB1/B2 pokazuje układ podwójnego pierścienia.

Dodanie BS3 do kompleksu RvB1 / RvB2 powoduje kowalencyjne wiązanie białek, w wyniku czego powstają prążki białkowe o większej masie cząsteczkowej. A rosnące ilości BS3 dają większe ilości usieciowanych gatunków, podczas gdy nieusieciowane podjednostki białkowe są zmniejszone. Widmo usieciowanych dipeptydów pokazuje szereg jonów Y obu peptydów, potwierdzając tę interakcję białkową.

Wyniki sieciowania BS3 są wizualizowane w sieci interakcji pokazującej interakcje wewnątrzcząsteczkowe, a także interakcje między różnymi podjednostkami. Natywne widmo masowe CPS pokazuje heterodimer, heterotetramer i heterooktamer. Tandemowa spektrometria mas tetramicznego i oktamerycznego CPS ujawnia dysocjację małej podjednostki CPS.

Chemiczne sieciowanie CPS z sieciownikiem BS3 pokazuje kilka wewnątrzcząsteczkowych wiązań krzyżowych między dwiema kopiami dużej podjednostki CPS. Struktura krystaliczna ujawnia, że powierzchnia oddziaływania między rdzeniem tetramicznym a obwodowymi małymi podjednostkami jest bardzo mała, co może wyjaśniać brak oddziaływań międzypodjednostkowych. Po opanowaniu nasz przepływ pracy może zostać wykonany w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Ponieważ składanie białek jest zbyt złożone, potrzebny jest dodatkowy czas na analizę danych. Po tej procedurze można następnie przeprowadzić modelowanie obliczeniowe w celu uzyskania trójwymiarowych modeli kompleksów białkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z sieciowaniem chemicznym i natywną spektrometrią mas, dopóki te dwie uzupełniające się techniki nie pomogą wyjaśnić struktur zespołów białek.