Name: Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę łączącą chemiczne sieciowanie z natywną spektrometrią mas do badania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych. Technika ta pozwala uzyskać uzupełniające informacje strukturalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym kolegom za pomocne dyskusje. Dziękujemy również Ilme Schlichting i Karlowi-Peterowi Hopfnerowi za dostarczenie kompleksów białkowych. Potwierdzamy dofinansowanie z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF, program ZIK, 03Z22HN22), Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRE, ZS/2016/04/78115) i MLU Halle-Wittenberg dla C.S. oraz finansowanie z Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) dla A.P.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podano protokoły do analizy strukturalnej opartej na spektrometrii mas wielopodjednostkowych kompleksów białkowych. Obie techniki, opisane w protokole, w większości dostarczają uzupełniających się wyników i są dobrze przystosowane do uzyskania wglądu w układy strukturalne w kompleksach białkowych (-ligandowych), które są trudne do zbadania za pomocą konwencjonalnych technik strukturalnych. Natywna spektrometria mas zapewnia wgląd w stechiometrię białek, a także interakcje białek poprzez analizę podkompleksów i stabilnych modułów interakcji. Z drugiej strony linkowanie krzyżowe daje informacje o miejscach bezpośredniego kontaktu. W zależności od zastosowanego cross-linkera, analiza może lub powinna uwzględniać pewną elastyczność.
Dostarczone protokoły są na ogół łatwe do wykonania i nie są czasochłonne. Cały protokół można wykonać w ciągu tygodnia i można go zastosować do prawie wszystkich kompleksów białkowych, chociaż do pomyślnej analizy wymagana jest pewna ilość kompleksu białkowego. Przygotowanie próbki jest proste i nie wymaga specjalnie oczyszczonych kompleksów białkowych. Jednak jedną z powszechnych pułapek jest zanieczyszczenie próbki podczas przygotowywania próbki do identyfikacji białek na podstawie spektrometrii mas. Zanieczyszczenia te w większości przypadków obejmują keratyny, które pochodzą z kurzu, skóry lub włosów. Dlatego podczas przygotowywania próbki do identyfikacji białek na podstawie spektrometrii mas należy zachować szczególną ostrożność, taką jak noszenie rękawic i fartuchów laboratoryjnych, filtrowanie wodnych i stosowanie rozpuszczalników o wysokiej czystości. Inne białka zanieczyszczające, takie jak białka opiekuńcze, są zwykle wprowadzane podczas oczyszczania białek, np. podczas stosowania znaczników powinowactwa. W takich przypadkach należy usprawnić oczyszczanie białka, na przykład poprzez zwiększenie liczby etapów mycia. W każdym razie zanieczyszczenia białkowe w próbce można łatwo zidentyfikować podczas przeszukiwania bazy danych poprzez pominięcie filtra taksonomii (tj. wyszukiwanie białek ze wszystkich gatunków). Jeśli zaobserwuje się tylko kilka peptydów (tj. można uzyskać niskie pokrycie białkiem), nawet jeśli dostępna jest wystarczająca próbka, może być konieczne użycie innej proteinazy podczas trawienia. Ogólnie rzecz biorąc, trypsyna daje wystarczającą liczbę peptydów; Jednak w niektórych przypadkach, takich jak białka błonowe lub domeny błonowe białek, liczba miejsc rozszczepienia tryptycznego jest zmniejszona, a lepszym wyborem są inne enzymy ukierunkowane na aminokwasy hydrofobowe.
Jeśli chodzi o oprzyrządowanie, wymagany jest specjalnie zmodyfikowany przyrząd do natywnej spektrometrii mas, który utrzymuje oddziaływania niekowalencyjne podczas transferu do fazy gazowej. Wprowadzono kilka typów instrumentów, w tym Q-ToF i instrumenty orbitrapowe. Podczas gdy zmodyfikowane spektrometry mas Q-ToF są dostępne na rynku dla natywnej spektrometrii mas od kilku lat, te ostatnie zostały wprowadzone dopiero niedawno i w większości przypadków wymagają specjalistycznej modyfikacji45. Jednak zastosowanie instrumentów o wysokiej rozdzielczości pozwoliło na zbadanie wiązania wielu ligandów i ich kwantyfikację46,47 i jest obiecujące dla przyszłych zastosowań.
Aby zidentyfikować usieciowane di-peptydy za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową, można zastosować standardowe procedury z niewielkimi modyfikacjami. Jednak przeszukiwanie baz danych jest czynnikiem ograniczającym, ponieważ specjalistyczne oprogramowanie rzadko radzi sobie z dużymi bazami danych i wymagane są zredukowane bazy danych zawierające podjednostki białkowe kompleksów. W ostatnich badaniach wykorzystano sieciujące metodą spektrometrii mas ukierunkowane na interakcje białek w lizatach całych komórek48,49. Zastosowanie chemicznych środków sieciujących, które ulegają fragmentacji w eksperymentach tandemowej spektrometrii mas, w większości daje peptydy liniowe (zmodyfikowane przez środek sieciujący), które można zidentyfikować przez dalszą fragmentację i przeszukiwanie bazy danych peptydów liniowych, a to skraca czas wyszukiwania i przestrzeń obliczeniową wyszukiwania. Jednak do przeprowadzenia tych eksperymentów wymagany jest analizator masy z pułapką jonową lub hybrydowy spektrometr masowy z pułapką jonową. Ogólnie rzecz biorąc, ponieważ wyniki fałszywie dodatnie są ważną kwestią, widma masowe usieciowanych peptydów są często weryfikowane ręcznie na podstawie jakości ich widm fragmentów, co znacznie wydłuża czas analizy danych. Opracowanie solidnych systemów punktacji, które można stosować bez dalszych etapów walidacji, jest zatem potencjalnymi przyszłymi zastosowaniami. Jednym ze sposobów na usprawnienie analizy danych i zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich było wprowadzenie obliczeń współczynnika fałszywych wykryć i ich zastosowanie do sieciowania zestawów danych50.
Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj techniki można uzupełnić dalszymi technikami spektrometrii mas (np. znakowaniem kowalencyjnym) w celu zwiększenia wyników analizy. Inne modyfikacje i ulepszenia protokołów można łatwo wdrożyć. W związku z tym porównawcze sieciowanie34 odkrywa zmiany konformacyjne w składaniu białek. Dalszy rozwój natywnej spektrometrii mas pozwala obecnie na analizę białek błonowych51,52 i ich interakcji z lipidami 28,52,53,54. Nowe osiągnięcia spektrometrów masowych o wysokiej rozdzielczości do natywnej spektrometrii mas rozszerzyły zastosowanie, a wiązanie ligandów, np. wiązanie lipidów z białkami błonowymi, może być teraz włączone do analizy45,46. W połączeniu z podejściami do modelowania obliczeniowego, techniki te mogą dostarczyć modele strukturalne o różnej rozdzielczości55. Jeśli nie są dostępne żadne struktury krystaliczne dla nienaruszonego kompleksu lub pojedynczych podjednostek, spektrometria mas może dostarczyć pierwszych informacji na temat interakcji białek i topologii nieznanego kompleksu. W zależności od zastosowanych technik i uzyskanych wyników, można uzyskać modele nieznanego kompleksu o niskiej rozdzielczości 56,57,58. Jeśli dostępne są struktury krystaliczne lub modele homologii, informacje strukturalne otrzymane ze spektrometrii mas mogą dostarczyć nawet modeli zbliżonych donatywnych59.
W porównaniu z innymi technikami strukturalnymi, spektrometria mas ma tę zaletę, że wymaga niewielkich ilości próbek, może radzić sobie z próbkami niejednorodnymi i ma zastosowanie do kompleksów białkowych o nieograniczonej wielkości. Ponadto spektrometria mas pozwala na badanie dynamicznych układów białkowych. Różne populacje białka lub kompleksu białkowego, które istnieją w roztworze, są zwykle analizowane razem, a zatem, w przeciwieństwie do innych technik strukturalnych, które wymagają selekcji określonych populacji, wszystkie konformacje są utrzymywane podczas analizy i można je ocenić w jednym doświadczeniu. Niedawno wprowadzono ilościowe podejścia do sieciowania 34,60,61 i są obiecujące dla przyszłych zastosowań opisujących zmiany konformacyjne w różnych warunkach.

Badanie strukturalne zespołów białek stało się szczególnie ważne dla zrozumienia procesów komórkowych. W związku z tym wiele technik zostało opracowanych i ulepszonych w biologii strukturalnej1. Jednak zastosowanie tych technik jest czasami ograniczone ze względu na wielkość, elastyczność lub niejednorodność badanych kompleksów białkowych. Spektrometria mas może poradzić sobie z tymi wyzwaniami i dlatego stała się potężnym narzędziem w biologii strukturalnej2,3,4,5. Największą zaletą spektrometrii mas jest jednak możliwość jednoznacznej identyfikacji białek nawet w złożonych i niejednorodnych mieszaninach6. W tym celu białka są zwykle trawione za pomocą endoproteinaz, a powstała mieszanina peptydów jest rozdzielana za pomocą chromatografii cieczowej i bezpośrednio eluowana do spektrometru masowego. Następnie określa się masy peptydów i wybiera jony prekursorowe do dalszej fragmentacji peptydów. Białka są następnie identyfikowane poprzez przeszukiwanie peptydów i odpowiadających im mas fragmentów w znanej bazie danych. Procedura ta pozwala nie tylko na identyfikację peptydów/białek, ale także na ich modyfikacje potranslacyjne, które powodują przesunięcie masy peptydów prekursorowych i jonów fragmentacyjnych przenoszących modyfikację7. Niektóre z wielu technik strukturalnej spektrometrii mas opierają się na tej zasadzie4,8. Na przykład techniki etykietowania, takie jak wymiana deuteru wodorowego9,10, strategie etykietowania chemicznego11,12, lub odcisk stopy rodnika hydroksylowego13,14, dają wgląd w dostępność powierzchniową białek w określonych warunkach.
Inną techniką jest (chemiczne) sieciowanie polegające na kowalencyjnym wiązaniu aminokwasów znajdujących się w bliskim sąsiedztwie poprzez ich grupy funkcyjne. W tym celu stosuje się odczynniki chemiczne, odczynniki aktywowane promieniami UV lub aminokwasy15,16. Po usieciowaniu białka są zwykle hydrolizowane proteazami, a usieciowane dipeptydy są analizowane za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową. Identyfikacja produktów sieciowania poprzez przeszukiwanie baz danych wymaga jednak użycia specjalistycznego oprogramowania, które łączy sekwencje peptydowe różnych białek i różnych regionów17,18,19. Zastosowanie chemicznych środków sieciujących ma tę zaletę, że można je zastosować do prawie każdego kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania i nie wymaga wprowadzania aminokwasów aktywowanych promieniowaniem UV, co można osiągnąć tylko podczas ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach gospodarza. W związku z tym sieciowanie jest wszechstronnym narzędziem i zostało z powodzeniem zastosowane w wielu badaniach strukturalnych nawet dużych zespołów białek20.
Spektrometria mas nienaruszonych kompleksów białkowych (czasami nazywana 'natywną' spektrometrią mas), z drugiej strony, polega na analizie nienaruszonych białek i kompleksów białkowych bez hydrolizy do peptydów. Ujawnia skład, niejednorodność, stechiometrię, topologię i interakcje podjednostek kompleksów białkowych21,22. W połączeniu z ruchliwością jonów, natywna spektrometria mas pozwala dodatkowo określić ich konformację23,24. To sprawia, że jest to potężne narzędzie do badań strukturalnych kompleksów białkowych, które są trudne do oceny za pomocą konwencjonalnych technik strukturalnych. Jednak natywna spektrometria mas wymaga analitycznych, które utrzymują niekowalencyjne oddziaływania białek podczas jonizacji elektrorozpylania. Zwykle osiąga się to za pomocą wodnych, lotnych, takich jak octan amonu25. Ponadto konieczne są modyfikacje przyrządu, aby zapobiec dysocjacji podczas transmisji do fazy gazowej spektrometru mas26. Zastosowano w ten sposób wiele (dużych) kompleksów białkowych. Imponującymi przykładami są badania nienaruszonych rybosomów27, ATP synthase28 lub wirusy29.
Połączenie natywnej spektrometrii mas i sieciowania okazało się szczególnie skuteczne w poprzednich badaniach. Na przykład, stechiometrie kompleksów opiekuńczych, w tym nieoczekiwany dimer Hsp70, można było uzyskać z eksperymentów spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych, podczas gdy chemiczne sieciowanie ujawniło ułożenie białek w zespołach30,31. W innym badaniu badano wpływ modyfikacji potranslacyjnych na nienaruszony kompleks syntazy ATP. Natywna spektrometria mas dostarczyła informacji na temat stabilności kompleksu białkowego w obecności lub braku fosforylacji lub acetylacji32,33. Porównawcza strategia sieciowania34 ujawniła następnie zmiany konformacyjne kompleksu białkowego w różnych warunkach.
Tutaj udostępniamy protokoły identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas, (chemicznego) sieciowania i natywnej spektrometrii mas, w tym analizy i interpretacji danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Pokazano kombinację uzupełniających się wyników uzyskanych tymi metodami za pomocą dwóch dobrze scharakteryzowanych kompleksów białkowych35. Nasz protokół można zastosować do dowolnego zestawu białek, które można oczyścić przy określonej czystości i stężeniu. Podejście to jest w niektórych przypadkach ograniczone przez analizę danych sieciujących, tj. wielkość zastosowanej bazy danych, która określa wymaganą przestrzeń i czas wyszukiwania. Ponadto często wymagana jest ręczna walidacja zidentyfikowanych wiązań, co dodatkowo zmniejsza wydajność. Natywna spektrometria mas jest w dużej mierze ograniczona jakością próbki, np. i adduktami stosowanymi podczas oczyszczania oraz możliwością ich wymiany na wodne i lotne. Jednak kompleksy białkowe oczyszczone do analizy strukturalnej zwykle mają jakość wymaganą do pomyślnej analizy za pomocą naszych protokołów.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, odczynniki, materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy kwas (HEPES)</td><td>Bufor Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitryl Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Amicon Ultra odśrodkowy urządzenia (różne MWCO)</td><td>Millipore</td>, <td>tj.</td><td>UFC500396 wymiana buforowa, stężenie</td></tr><tr><td>Roztwór octanu amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>natywny MS</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>trawienie w żelu</td></tr><tr><td>Roztwór amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>środek sieciujący</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>środek sieciujący</td></tr><tr><td>Jodek cezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203033</td><td>kalibracja</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>trawienie w żelu</td></tr><tr><td>Kapilary (1,0 OD i razy; 0,78 ID & razy; 100 L mm)</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0038</td><td>natywny MS</td></tr><tr><td>Suberat disuccinimidylu (DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>środek sieciujący</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>trawienie w żelu</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Rozpuszczalnik Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>rozpuszczalnik Kwas mrówkowy Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>suplement rozpuszczalnikowy</td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie roztwór barwiący</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>roztwór barwiący do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% żele Bis-Tris (1 mm, 10 dołków)</td><td>technologie życia</td><td>NP0323BOX</td><td>elektroforezie żelowej</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Trawienie w żelu</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy, klasa HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 kolumn</td><td>Wymiana buforu</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td></tr><tr><td>Bufor do biegania NuPAGE Antioxidant</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>, elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPAGE LDS (4 &razy;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>bufor do ładowania próbek (nieredukcyjny) do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Technologie żywotności bufora biegowego</td><td></td><td>NP0001</td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Technologie żywotności bufora biegowego</td><td></td><td>NP0001</td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki (10 &razy;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>środek redukujący do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>PBS - sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Bufor Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>wstępnie barwiony marker białkowy do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>wytrącanie etanolu</td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetyl)aminometan (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>252859 bufor</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>trawienie w żelu</td></tr><tr><td>Urządzenia odśrodkowe Vivaspin (różne MWCO)</td><td>Sartorius</td><td>tj. VS0101</td><td>wymiana buforowa, stężenie</td></tr><tr><td>Woda do HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Instrumenty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Fresco 21, wirówka stołowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Płonący / brązowy ściągacz do mikropipet Model P-1000</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Komora do elektroforezy żelowej Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Pozioma wytrząsarka żelowa Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Q-TOF Ultima, ulepszenie wysokiej masy MS Vision</td><td></td> <td>Kolumna</td> analityczna C18 z odwróconymi fazami Uznanie <td></td></tr><tr><td>PepMap (C18, średnica wewnętrzna 75 mm, 50 cm, rozmiar porów 3 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>kolumna wstępna C18 z odwróconą fazą (C18, średnica wewnętrzna 150 mm, 2 cm, pory 5 mm)</td><td>Skalpel Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P wirówka próżniowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td></td> Pęseta 5382000015 <td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa USC-TH, kąpiel sonikująca</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>System UltiMate Dionex 3000 nano-LC, sprzężony z hybrydowym spektrometrem masowym Q-Exactive plus (źródło nano-ESI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software, Software Tools, Database search</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do konwersji pXtract</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, MT Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Białka oddziałują ze swoimi ligandami, tworząc aktywne i dynamiczne zespoły, które pełnią różne funkcje komórkowe. Wyjaśnienie tych interakcji ma zatem fundamentalne znaczenie dla zrozumienia procesów komórkowych. Jednak wiele kompleksów białkowych to dynamiczne złożenia, które nie są dostępne za pomocą konwencjonalnych technik strukturalnych. Spektrometria mas przyczynia się do badań strukturalnych tych zespołów, a w szczególności połączenie różnych technik spektrometrii mas dostarcza cennych informacji na temat ich strukturalnego układu.
W tym artykule opisujemy zastosowanie i kombinację dwóch uzupełniających się technik spektrometrii mas, a mianowicie chemicznego sieciowania sprzężonego ze spektrometrią mas i natywnej spektrometrii mas. Sieciowanie chemiczne polega na kowalencyjnym wiązaniu aminokwasów w bliskiej odległości za pomocą odczynników chemicznych. Po trawieniu z proteazami, usieciowane di-peptydy są identyfikowane za pomocą spektrometrii mas i odkrywane są miejsca interakcji białek. Z drugiej strony natywna spektrometria mas to analiza nienaruszonych zespołów białek w fazie gazowej spektrometru masowego. Ujawnia stechiometrie białek, a także interakcje białek i ligandów. Obie techniki dostarczają zatem uzupełniających się informacji na temat struktury zespołów białko-ligand, a ich połączenie okazało się skuteczne we wcześniejszych badaniach.

Analiza strukturalna białek oraz tworzonych przez nie kompleksów jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji. Spektrometria mas wnosi znaczny wkład w badania strukturalne, ponieważ może być stosowana do niemal każdego interesującego kompleksu, niezależnie od jego wielkości lub heterogeniczności próbki. Ilustrujemy ten protokół na przykładzie dwóch dobrze scharakteryzowanych kompleksów białkowych; pierwszym z nich jest hetero-dodekamer RvB1/B2 z C. thermophilum a po drugie, hetero-oktameryczny kompleks CPS z E. coli.
W pierwszej kolejności zidentyfikowano składniki białkowe obu kompleksów. W tym celu białka rozdzielono metodą SDS-PAGE (Rysunek 2) i z żelu wycięto prążki. Po trawieniu białek w żelu mieszaninę peptydów przeanalizowano za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas, a masy peptydów i fragmentów poddano przeszukiwaniu baz danych. Stosując ten schemat postępowania, z wysokim stopniem pewności zidentyfikowaliśmy wszystkie podjednostki białkowe obu kompleksów, t.j.zaobserwowano wysoką liczbę peptydów z odpowiednimi wynikami (peptide scores), co przełożyło się na wysoki stopień pokrycia sekwencji dla wszystkich podjednostek białkowych (Tabela 1).
Następnie przeanalizowano nienaruszony kompleks RvB1/B2 za pomocą natywnej spektrometrii mas (Rysunek 3A). Widmo masy ujawniło dwa gatunki: jeden przy wartości około 8 000 m/z oraz drugi przy wartości około 11 000-12 000 m/z. Obliczone masy dla tych gatunków odpowiadają heksamerycznemu pierścieniowi (RvB1)3(RvB2)3 (około 310 kDa) oraz dodekamerycznemu podwójnemu pierścieniowi (RvB1)6(RvB2)6 (około 620 kDa). Obie serie piko wykazują dwie populacje; wynikają one z obecności mieszaniny podjednostek RvB2 z tagiem His oraz bez tagu w kompleksach. Struktura krystaliczna kompleksu RvB1/B2 została uzyskana wcześniej36 i ukazuje układ podwójnego pierścienia (Rysunek 3B). Natywne widmo masy potwierdza zatem stechiometrię nienaruszonego dodekameru i dodatkowo ujawnia stabilny podkompleks. Ponadto zidentyfikowano współistniejące populacje.
Aby zidentyfikować miejsca oddziaływania białek w kompleksie RvB1/B2, przeprowadziliśmy chemiczne sieciowanie oczyszczonego kompleksu za pomocą sieciującego czynnika BS3. W pierwszej kolejności przeprowadziliśmy miareczkowanie ilości BS3 podczas reakcji sieciowania, aby określić optymalne stężenie. BS3 jest swoisty dla grup aminowych i kowalencyjnie łączy łańcuchy boczne lizyny oraz N-końce białek. Po reakcji sieciowania przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE (Rycina 2A). Kompleks niesieciowany wykazywał obecność obu podjednostek, RvB1 i RvB2. Dodanie BS3 do mieszaniny reakcyjnej spowodowało kowalencyjne połączenie białek, co skutkowało pojawieniem się prążków białkowych o wyższej masie cząsteczkowej. Żel SDS wykazuje, że zwiększanie ilości BS3 prowadzi do powstania większej ilości form sieciowanych, podczas gdy ilość niesieciowanych podjednostek białkowych ulega zmniejszeniu. Następnie wycięliśmy prążki białkowe z żelu i postąpiliśmy zgodnie z powyższym protokołem, aby zidentyfikować miejsca oddziaływania białek. Przykład widma sieciowanego dipeptydu przedstawiono na Rycini 3C. Widmo wykazuje serie jonów y dla obu peptydów, co potwierdza to oddziaływanie białkowe. Łącznie otrzymaliśmy 14 oddziaływań białkowych, w tym cztery wiązania sieciujące między podjednostkami RvB1 i RvB2 oraz dwa wiązania sieciujące między dwiema kopiami RvB2 (Tabela 2). Wyniki sieciowania BS3 przedstawiono w postaci sieci oddziaływań (Rycina 3D), ukazującej oddziaływania wewnątrzmolekularne oraz oddziaływania między różnymi podjednostkami. Sieciowania wewnątrzmolekularne sugerują, że podjednostki RvB1 i RvB2 zwijają się w taki sposób, że domeny N- i C-końcowe znajdują się w bliskim sąsiedztwie. Należy zauważyć, że w tym przypadku oddziaływań wewnątrzmolekularnych nie można odróżnić od oddziaływań międzycząsteczkowych tej samej podjednostki. Zaobserwowano również międzycząsteczkowe wiązania sieciujące między dwiema podjednostkami. Z nich dwa międzycząsteczkowe wiązania sieciujące między RvB1 i RvB2 można było zwizualizować w strukturze, co potwierdza zasadność podejścia opartego na sieciowaniu. Pozostałe międzycząsteczkowe wiązania sieciujące znajdują się w elastycznych pętlach, które nie są zawarte w strukturze krystalicznej. Zidentyfikowaliśmy również dwa wiązania sieciujące w RvB2 zawierające te same sekwencje peptydowe. Wiązania te można jednoznacznie sklasyfikować jako międzycząsteczkowe, ponieważ muszą one pochodzić z dwóch kopii tego samego białka (Rycina 3D). Nasze eksperymenty z sieciowaniem ujawniły miejsca oddziaływań białek w obrębie kompleksu, ale także wewnątrz podjednostek białkowych, dostarczając informacji o ich układzie strukturalnym, co zostało potwierdzone przez istniejącą strukturę krystaliczną (Rycina 3B).
Drugim badanym przez nas kompleksem białkowym był CPS. Natywne widmo masowe (Rysunek 4A) wykazało obecność trzech kompleksów białkowych w zakresie między 6 000 a 12 000 m/z. Największy kompleks o masie 640 kDa odpowiada nienaruszonemu hetero-oktamerowi. Mniejsze kompleksy reprezentują dwa podkompleksy: dimer małej i dużej podjednostki CPS (160 kDa) oraz hetero-tetramer zawierający po dwie kopie każdej podjednostki (320 kDa). Podkompleksy te dostarczają pierwszych informacji na temat budowy białka; i.e., podjednostki duża i mała pozostają w bezpośrednim kontakcie (co wykazuje hetero-dimer), a tetramer może być produktem dwóch dimerów. Aby uzyskać więcej informacji o strukturze przestrzennej w nienaruszonym kompleksie CPS, przeprowadziliśmy tandemową spektrometrię mas (MS/MS) hetero-oktameru oraz hetero-tetrameru. W obu przypadkach podjednostka mała oddzieliła się od prekursora, co sugeruje, że podjednostka mała znajduje się na peryferiach kompleksu (Rysunek 4B). Rzeczywiście, w dostępnej strukturze krystalicznej podjednostka mała jest położona peryferyjnie (Rysunek 4C)44.
Przeprowadzono również sieciowanie chemiczne przy użyciu łącznika BS3. Zastosowanie zwiększających się ilości łącznika wzmocniło kowalencyjne wiązania podjednostek CPS. Po trawieniu białek i analizie peptydów zgodnie z powyższym opisem, uzyskano wiele interakcji białkowych w obrębie podjednostki dużej oraz jedno wiązanie sieciujące w podjednostce małej (Tabela 2). Dodatkowo, podobnie jak w przypadku kompleksu RvB1/B2, stwierdzono dwa międzycząsteczkowe wiązania sieciujące pomiędzy dwiema kopiami dużej podjednostki CPS. Wiązania te sytuują dwie duże podjednostki przylegającymi do siebie swoimi końcami C-terminalnymi. W poprzednim badaniu, łącząc strukturalną spektrometrię mas z modelowaniem obliczeniowym35, zidentyfikowaliśmy trzy dodatkowe interakcje w dużej podjednostce, które najprawdopodobniej pochodzą z powierzchni styku dwóch kopii dużej podjednostki, co zostało potwierdzone przez strukturę krystaliczną oraz uzyskany model (Rysunek 4C i Tabela 2). Interakcje te umożliwiają ułożenie rdzenia kompleksu CPS składającego się z czterech dużych podjednostek. Nie zaobserwowano jednak żadnych między-podjednostkowych wiązań sieciujących pomiędzy podjednostkami małymi a dużymi. Analiza dostępnej struktury krystalicznej (Rysunek 4C) wskazuje, że powierzchnia interakcji pomiędzy tetramerycznym rdzeniem kompleksu, składającym się z dużych podjednostek, a peryferyjnymi podjednostkami małymi jest bardzo mała, co może wyjaśniać brak interakcji między-podjednostkowych. Potwierdza to natywna spektrometria mas, która wykazała, że podjednostka mała łatwo dysocjuje z nienaruszonych kompleksów, najprawdopodobniej ze względu na małą powierzchnię wiązania. Niemniej jednak, interakcje białkowe w kompleksie CPS, określone na podstawie sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas, pozwalają na wnioskowanie o ich układzie strukturalnym (Rysunek 4D).
Podsumowując, połączenie natywnej spektrometrii mas i chemicznego sieciowania wraz z identyfikacją sieciowanych peptydów metodą spektrometrii mas pozwala na odtworzenie organizacji strukturalnej obu przykładowych kompleksów. Podczas gdy chemiczne sieciowanie ujawniło rozmieszczenie podjednostek białkowych, na przykład oddziaływania między RvB1 a RvB2 lub w obrębie tetramerycznego rdzenia CPS, natywna spektrometria mas dostarczyła informacji o stechiometrii białek nienaruszonych kompleksów oraz dominujących podkompleksów. W przypadku CPS, dla którego nie zaobserwowano oddziaływań międzycząsteczkowych między dwiema podjednostkami za pomocą chemicznego sieciowania, natywna spektrometria mas sugeruje, że każda duża podjednostka oddziałuje z jedną małą podjednostką (Rycina 4D). Tandemowa spektrometria mas wskazała na peryferyjne położenie małej podjednostki w kompleksie oraz niewielki obszar styku między obiema podjednostkami.
<img alt="Schemat spektrometrii mas dla nienaruszonych białek i sieciowania; proces ESI-MS, szczegółowa analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat natywnej spektrometrii mas i sieciowania. Obie techniki dostarczają komplementarnych wyników. Podczas gdy natywna spektrometria mas ujawnia stechiometrię i moduły interakcji, sieciowanie dostarcza informacji o miejscach oddziaływań białkowych w obrębie kompleksów. Należy zauważyć, że chemiczne sieciowanie ujawnia jedynie interakcje binarne. (A) Pierwszym krokiem w natywnej spektrometrii mas jest wymiana buforu na lotny bufor wodny przy użyciu jednostek filtrujących lub kolumn do filtracji żelowej. Następnie spektrometria mas nienaruszonych kompleksów białkowych ujawnia ich stechiometrię. W eksperymentach tandemowej spektrometrii mas dochodzi do dysocjacji podjednostek peryferyjnych. (B) W przypadku chemicznego sieciowania kompleks białkowy inkubuje się z odczynnikiem sieciującym. Usieciowane białka są następnie trawione do peptydów, które są dalej analizowane za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy białek w żelu; wpływ stężenia BS3 na białka RvB i podjednostki CPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: SDS-PAGE kompleksów sieciowanych RvB1/B2 (A) oraz CPS (B). (A) Na każdą ścieżkę żelu naniesiono 2,5 µM RvB1/B2. Zmieniano stężenie BS3. Nieusieciowany kompleks RvB1/B2 wykazuje dwie podjednostki białkowe o masie około 50 kDa. Dodanie BS3 spowodowało kowalencyjne powiązanie podjednostek białkowych, co zaowocowało pojawieniem się prążków białkowych o wyższej masie cząsteczkowej. Ilość form usieciowanych wzrasta wraz z wyższymi stężeniami BS3. Optymalne warunki sieciowania zostały zaznaczone (kolor czerwony). (B) Na każdą ścieżkę żelu naniesiono 10 µM CPS. Otrzymano dużą (90 kDa) i małą (40 kDa) podjednostkę CPS. Dodanie BS3 spowodowało kowalencyjne powiązanie podjednostek białkowych, co zaowocowało pojawieniem się prążków białkowych o wyższej masie cząsteczkowej. Optymalne warunki sieciowania zostały zaznaczone (kolor czerwony). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas i ilustracja struktury białka; kompleksy białkowe, dopasowanie sekwencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Natywna spektrometria mas i chemiczne sieciowanie kompleksu RvB1/B2. (A) Natywne widmo mas ujawnia dwa gatunki RvB1/B2; nienaruszony dodekامر (tj. (RvB1)6(RvB2)6) przy około 11 000 do 12 000 m/z oraz pierścień heksameryczny (RvB1)3(RvB2)3 przy około 8 000 m/z. Oba gatunki wykazują dwie populacje wynikające z obecności RvB2 z tagiem His oraz bez taga. Widmo zostało zmodyfikowane na podstawie źródła35. (B) Przedstawiono strukturę krystaliczną RvB1/B2 (PDB ID 4WVY). Naprzemienne podjednostki RvB1 i RvB2 tworzą dwa pierścienie heksameryczne. (C) Widmo fragmentacji sieciowanego dipeptydu. N-koniec RvB1 został powiązany sieciowaniem z K23 RvB1. Dla obu peptydów uzyskano serie jonów y (kolor czerwony i cyjan). (D) Oddziaływania wewnątrz- i międzybiałkowe uzyskane w kompleksie RvB1/B2. Sieciowania wewnątrzbiałkowe zaznaczono na czerwono, a międzybiałkowe na niebiesko. Wstawka pokazuje dwa międzycząsteczkowe sieciowania między podjednostkami RvB1 i RvB2, które można było zwizualizować w strukturze krystalicznej (kolor zielony, wstawka). Oddziaływania pochodzące z dwóch kopii RvB2 przedstawiono jako niebieskie linie przerywane. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Spektrometria mas kompleksów białkowych; wyniki dysocjacji, diagram z wartościami m/z, natywna MS/MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Natywna spektrometria mas i chemiczne sieciowanie CPS. (A) Natywne widmo mas CPS wykazuje trzy kompleksy: heterodimer (160 kDa), heterotetramer (320 kDa) oraz heterooktamer (640 kDa). Widmo zostało zmodyfikowane na podstawie źródła35. (B) Tandemowa spektrometria mas tetramerycznego i oktamerycznego kompleksu CPS ujawniła dysocjację małej podjednostki CPS. (C) Przedstawiono strukturę krystaliczną CPS (PDB ID 1BXR). Duże podjednostki tworzą tetrameryczny rdzeń, a małe podjednostki znajdują się na peryferiach kompleksu. Pokazano międzycząsteczkowe wiązania sieciujące między dwiema kopiami dużej podjednostki (kolor zielony). (D) Interakcje dużych i małych podjednostek CPS. Natywna spektrometria mas ujawniła podkompleksy i sugeruje peryferyjne położenie małej podjednostki. Chemiczne wiązania sieciujące wskazują na układ w tetramerycznym rdzeniu CPS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Wyniki wyszukiwania w bazie danych. Białka zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową oraz przeszukiwania bazy danych. Podano nazwy białek, numery dostępowe i opisy, a także masy białek. Wymieniono wyniki punktowe (score) białek, liczbę obserwowanych widm na białko oraz liczbę obserwowanych sekwencji peptydowych. Dla każdej podjednostki białkowej wymieniono pięć peptydów z najwyższymi wynikami Mascot. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela 2: Powiązania krzyżowe zaobserwowane w RvB1/B2 i CPS. Podano podjednostki kompleksów oraz powiązane krzyżowo reszty. Typ powiązania krzyżowego (wewnątrz- lub międzycząsteczkowe) określono na podstawie nakładających się sekwencji peptydów lub wcześniejszego badania35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Ogólnym celem połączenia sieciowania z natywną spektrometrią mas jest uzyskanie uzupełniających informacji strukturalnych na temat wielopodjednostkowych zespołów białkowych, które pomagają wyjaśnić ich trójwymiarowy układ. Sieciowanie chemiczne i natywna spektrometria mas pomagają odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej, takie jak skład, łączność i stechiometria. Główną zaletą łączenia kilku technik jest to, że uzyskuje się informacje uzupełniające, które nie są dostępne tylko za pomocą jednej techniki.Nasz przepływ pracy można zastosować do każdego innego kompleksu białkowego. Może być oczyszczony z soli lub tkanek lub może być odtworzony z oczyszczonych białek. Najpierw nałóż 7,5 mikrolitra czterokrotnego prostego buforu i trzy mikrolitry 10-krotnego środka redukującego na żądany kompleks białkowy.Wiruj próbkę przez jedną minutę przy 16 200-krotności grawitacji. Po odwirowaniu podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Przygotuj żel o gradinie od 4 do 12% do elektroforezy i umieść żel w komorze elektroforezy.Wcześniej przygotowany bufor bieżący rozcieńczyć 20 razy wodą i napełnić komorę elektroforezy. Następnie dodaj 0,5 mililitra antytlenu do komory wewnętrznej. Załadować odpowiedni marker białkowy do pierwszej jamy żelu, a próbki białka do pozostałych jam.Następnie oddziel białka na odpowiedni czas pod napięciem 200 woltów. Aby zabarwić pasma białkowe, przenieś żel do pudełka do barwienia żelu i przykryj żel stojącym roztworem Coomassie na bazie wody. Inkubować żel przez noc w temperaturze pokojowej na poziomym wytrząsarce do żelu.Następnego dnia odplamić żel, zastępując roztwór barwiący wodą. Powtórz poprzedni krok około trzy do pięciu razy, aż tło żelu stanie się czyste. Teraz odetnij pasma białkowe, które są uwidocznione przez niebieskie plamy Coomassie z żeli za pomocą skalpela.Ostrożnie pokrój pasma białkowe na małe kawałki o objętości około jeden na jeden mililitr. Następnie umyj pasma białkowe wodą i acetonitrylem. Zredukuj wiązania dwusiarczkowe za pomocą DTT, a następnie alkiluj reszty cysteiny jodoacetamidem.Następnie trawić białka trypsyną, jak opisano w protokole tekstowym. Aby wyekstrahować peptydy, należy inkubować kawałki żelu z wodorowęglanem amonu i acetonitrylem i zebrać supernatant zawierający peptydy. Następnie inkubować kawałki żelu z 5% kwasem mrówkowym i acetonitrylem i zebrać supernatant zawierający peptydy.Po zebraniu supernatantu zawierającego peptydy połączyć oba supernatanty i wysuszyć wyekstrahowane peptydy poprzez odparowanie rozpuszczalników w wirówce próżniowej. Po wyschnięciu peptydów wymieszaj je z 20 mikrolitrami 2% roztworu acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Rozpuść peptydy w kąpieli sonikacyjnej przez dwie do trzech minut.Następnie odwiruj próbkę w wirówce pod ciśnieniem 16 200 razy większym od grawitacji przez 30 minut. Po przeniesieniu próbki do fiolki automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć pięć mikrolitrów do systemu nano LC-MS/MS i załadować mieszaninę peptydów do kolumny wstępnej C18 z odwróconą fazą w celu odsalenia i skoncentrowania peptydów w trybie online. Usunąć bufor magazynowy z kolumny wirowej wykluczającej rozmiar, wirując pod ciśnieniem 1 000 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę.Po odrzuceniu przepływu, przemyć kolumnę trzykrotnie, dodając 500 mikrolitrów 200 milimolowego octanu amonu, a następnie odwirować. Po odwirowaniu załadować 20 mikrolitrów próbki białka na kolumnę i odwirować przy 1000-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez cztery minuty. Teraz umieść wcześniej przygotowaną kapilę pokrytą złotem w uchwycie kapilarnym.Otwórz końcówkę igły i wypełnij kapilatę jednym do czterech mikrolitrów próbki białka. Połącz uchwyt kapilarny ze źródłem nanoelektrorozpylania spektrometru masowego i umieść końcówkę kapilary w odległości od 0,5 do 1,5 centymetra od otworu stożka. Użyj od 80 do 150 litrów gazu nanoflow na godzinę, aby zainicjować natryskiwanie i dostosować przepływ gazu, aby utrzymać stabilny rozpylanie.Dostosuj parametry i stronę strojenia instrumentu Q-TOF. Następnie rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Zdobądź i połącz jak najwięcej skanów, aby uzyskać dobre widmo masowe. Rozpuść 1,43 miligrama BS3 i 100 mikrolitrów wody, aby przygotować 25-milimolowy roztwór podstawowy.Następnie dodaj BS3 do kompleksu białkowego. Użyj różnych ilości BS3, aby określić optymalne stężenie środka sieciującego. Mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę w termomikserze.Teraz wykonaj stronę SDS usieciowanych białek za pomocą żelu o gradiacji od czterech do 12%. Przetnij pasma żelu i strawij białko przez trawienie w żelu, jak opisano wcześniej. Po uzyskaniu peptydów z trawienia w żelu należy przeprowadzić spektrometrię mas sprzężoną z chromatografią cieczową, jak opisano wcześniej.Wszystkie podjednostki białkowe heterododekameru RvB1/B2 i heterooktamerycznych kompleksów CPS zidentyfikowano z dużą pewnością. Widmo masowe RvB1/RvB2 ujawnia dwa gatunki, które odpowiadają podwójnym pierścieniom heksamerycznym i dodekamerycznym. Struktura krystaliczna kompleksu RvB1/B2 pokazuje układ podwójnego pierścienia.Dodanie BS3 do kompleksu RvB1 / RvB2 powoduje kowalencyjne wiązanie białek, w wyniku czego powstają prążki białkowe o większej masie cząsteczkowej. A rosnące ilości BS3 dają większe ilości usieciowanych gatunków, podczas gdy nieusieciowane podjednostki białkowe są zmniejszone. Widmo usieciowanych dipeptydów pokazuje szereg jonów Y obu peptydów, potwierdzając tę interakcję białkową.Wyniki sieciowania BS3 są wizualizowane w sieci interakcji pokazującej interakcje wewnątrzcząsteczkowe, a także interakcje między różnymi podjednostkami. Natywne widmo masowe CPS pokazuje heterodimer, heterotetramer i heterooktamer. Tandemowa spektrometria mas tetramicznego i oktamerycznego CPS ujawnia dysocjację małej podjednostki CPS.Chemiczne sieciowanie CPS z sieciownikiem BS3 pokazuje kilka wewnątrzcząsteczkowych wiązań krzyżowych między dwiema kopiami dużej podjednostki CPS. Struktura krystaliczna ujawnia, że powierzchnia oddziaływania między rdzeniem tetramicznym a obwodowymi małymi podjednostkami jest bardzo mała, co może wyjaśniać brak oddziaływań międzypodjednostkowych. Po opanowaniu nasz przepływ pracy może zostać wykonany w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.Ponieważ składanie białek jest zbyt złożone, potrzebny jest dodatkowy czas na analizę danych. Po tej procedurze można następnie przeprowadzić modelowanie obliczeniowe w celu uzyskania trójwymiarowych modeli kompleksów białkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z sieciowaniem chemicznym i natywną spektrometrią mas, dopóki te dwie uzupełniające się techniki nie pomogą wyjaśnić struktur zespołów białek.

combining-chemical-cross-linking-mass-spectrometry-intact-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.

Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Poznaj metodę łączącą chemiczne sieciowanie z natywną spektrometrią mas do badania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych. Technika ta pozwala uzyskać uzupełniające informacje strukturalne.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Przeglądaj więcej filmów