Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla komórek zrębu szpiku kostnego lub BMSC. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kości i adipocytów dotyczące komórek progenitorowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że BMSC można wyizolować w stosunkowo szybki, powtarzalny i niedrogi sposób.

Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ etapy sekcji mogą być trudne do wyjaśnienia za pomocą samego tekstu. Przed rozpoczęciem procedury pobierania kości należy dodać 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego do jednej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki na każde trzy kości, które mają zostać pobrane. I odetnij koniec z jednej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów na probówkę do mikrowirówki, tak aby każda końcówka mogła zmieścić się w jednej probówce z zamkniętymi pokrywkami.

Następnie umieść pierwszą 78-tygodniową mysz poddaną eutanazji w pozycji leżącej na desce sekcyjnej i spryskaj zwierzę 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby stworzyć namiot ze skóry na brzuchu i użyj sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać około centymetrowe nacięcie skóry. Oderwij skórę, aby odsłonić dolną część brzucha i nogi.

Przeciąć wzdłuż grzbietu biodrowego każdego biodra, aby oddzielić głowy kości udowej od miednicy, i wykonaj nacięcie w linii środkowej miednicy, aby oddzielić kości biodrowe i przeciąć poniżej stawów skokowych, aby usunąć stopy. Następnie oddziel kość piszczelową od kości udowej, przecinając staw kolanowy. Następnie użyj niestrzępiących się chusteczek, aby ostrożnie usunąć mięsień z kości udowych, piszczelowych i biodrowych.

Po zebraniu wszystkich kości umieścić próbki w PBS na lodzie i przenieść próbki do sterylnego kaptura hodowlanego. Stosując sterylną technikę, wykonaj od jednego do dwóch milimetrowych nacięć zarówno na bliższym, jak i dystalnym końcu każdej kości, a następnie umieść trzy kości w każdej zmodyfikowanej końcówce mikropipety w probówkach do mikrowirówek. Zebrać szpik kostny z kości przez odwirowanie, sprawdzając, czy szpik został całkowicie granulowany na dnie każdej probówki do mikrowirówki na końcu wirowania.

Jeśli cały szpik został pobrany, kości będą wyglądały na białe. Wyjmij końcówki mikropipet i kości z probówek zbiorczych w celu prawidłowej utylizacji bezpieczeństwa biologicznego. Aby pokryć płytki komórki szpiku kostnego, najpierw użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby powoli ponownie zawiesić granulki i rozbić wszelkie grudki, a następnie zbierz próbki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego na 500 mikrolitrów próbki i przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie fragmenty kości. Po policzeniu wysiewaj komórki szpiku kostnego w ilości od 10 do 6 komórek na centymetr kwadratowy w świeżej pożywce hodowlanej przez 72 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Trzeciego dnia zastąp supernatant świeżą pożywką, zmieniając pożywkę co dwa dni, aż komórki osiągną zbieżność od 80% do 100%.

Aby umieścić na płytce podzieloną hodowlę populacji szpiku kostnego, należy umieścić pobrane komórki szpiku kostnego od jednej myszy w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej na 48 godzin w świeżej pożywce w inkubatorze do hodowli komórkowych. W drugim dniu hodowli należy usunąć nieprzylegający supernatant zawierający krwiotwórcze komórki macierzyste i ostrożnie umyć płytkę PBS, nie naruszając przylegających komórek szpiku kostnego. Zastąp PBS 0,25% trypsyną.

Po jednej do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza wygasić reakcję świeżą pożywką do hodowli komórkowych i policzyć komórki w powstałej zawiesinie komórek. Odwirować odpowiednią liczbę komórek do posiewu i ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości świeżej pożywki hodowlanej, aby uzyskać pożądaną gęstość posiewu. Następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych aż do zbiegu.

Aby indukować różnicowanie osteoblastów komórek macierzystych szpiku kostnego, należy co dwa dni zastępować pożywkę do hodowli komórkowej pożywką różnicującą, aż komórki zaczną wytwarzać białe guzki mineralizacji, które można zaobserwować makroskopowo. Aby indukować różnicowanie adipocytów komórek macierzystych szpiku kostnego, należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej zlewającej się hodowli komórek szpiku kostnego pożywką indukcyjną adipocytów. Po dwóch dniach hodowli zastąp supernatant świeżą pożywką do indukcji adipocytów, zmieniając ją na pożywkę zasadową adipocytów w czwartym dniu.

W siódmym dniu potwierdź, że komórki zgromadziły kropelki lipidów i że wykazują fenotyp podobny do dojrzałych adipocytów. Aby zróżnicować hematopoetyczne komórki macierzyste w osteoklasty, gdy całkowita hodowla komórek szpiku kostnego lub hodowla komórek nieprzylegających staje się przylegająca, należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej pożywką do różnicowania osteoklastów. Zmieniaj pożywkę co dwa dni i codziennie sprawdzaj różnicowanie osteoklastów pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu, aż osteoklasty połączą się i utworzą komórki wielojądrowe, zwykle około pięciu do siedmiu dni różnicowania.

Zlewające się kultury BMSC można różnicować w osteoblasty za pomocą pożywki osteogennej złożonej z kwasu askorbinowego i beta-glicerofosforanu. Po kilku dniach różnicowania osteoblasty zaczynają wyrażać fosfatazę alkaliczną. Dalsze różnicowanie spowoduje produkcję macierzy kostnej, a ostatecznie mineralizację tej macierzy.

Co ciekawe, tylko część komórek różnicuje się w osteoblasty in vitro, co ujawnia barwienie fioletem krystalicznym. Niezależnie od tego, czy stosuje się populacje mieszane, czy populacje komórek szpiku kostnego, tylko część komórek różnicuje się w adipocyty, które pojawiają się jako okrągłe komórki z wieloma wakuolami lipidowymi, które można zabarwić czerwonym barwnikiem O. Hodowle ludzkich komórek macierzystych uzupełnione czynnikiem stymulującym komórki myszy i RANKL szybko się łączą, tworząc komórki wielojądrowe, które barwią się pozytywnie na TRAP.

Te osteoklasty są zdolne do resorpcji macierzy mineralnej in vitro i mogą być wykorzystywane do oceny aktywności osteoklastycznej. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, w zależności od liczby myszy. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wcześniejszej sterylizacji narzędzi i przygotowaniu podłoża, aby móc pracować jak najszybciej i jak najbardziej aseptycznie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i hodować komórki zrębu szpiku kostnego.