Name: Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek zrębu szpiku kostnego od myszy. Technika umożliwia różnicowanie osteoblastów, adipocytów i osteoklastów w sposób szybki i powtarzalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Instytucie Badawczym Centrum Medycznego Maine.
1. Przygotowanie probówek zbiorczych
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną BMSC, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę α (MEM α) 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Umieść 100 μl pożywki hodowlanej BMSC w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 3 kości zwykle mieszczą się w jednej probówce, więc odpowiednio się przygotuj.</li>
	<li>Przyciąć końcówki pipet o pojemności 200 μl na tyle, aby zmieściły się w probówkach wirówkowych. Włóż końcówki do tubek i upewnij się, że pokrywki mogą się zamknąć przed umieszczeniem probówek na lodzie. 
	UWAGA: Alternatywnie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,75 ml z odciętymi końcami można włożyć do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
2. Zbiór kości z myszy
<ol>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy i spryskaj je 70% etanolem. 
	UWAGA: Upewnij się, że wykorzystywane są zwierzęta tej samej płci i najlepiej w tym samym wieku. Rutynowo wykorzystujemy zwierzęta w wieku od 7 do 8 tygodni. Zalecamy łączenie komórek z co najmniej 3 zwierząt w każdej grupie eksperymentalnej, aby uzyskać lepiej reprezentatywną i odtwarzalną populację komórek.</li>
	<li>Umieść uśpioną mysz na plecach na desce sekcyjnej. Użyj kleszczy, aby stworzyć namiot ze skóry na brzuchu. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Oderwij skórę w kierunku kończyn i stóp od rozcięcia, aby odsłonić dolną część brzucha i nogi.
	<ol>
		<li>Wytnij poniżej stawu skokowego, aby usunąć stopę. Przeciąć wzdłuż grzebienia biodrowego w biodrze, aby oddzielić głowę kości udowej od kości biodrowej. Gdy mysz jest jeszcze na grzbiecie, wykonaj nacięcie na środku kości biodrowej, aby oddzielić dwie kości biodrowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą niestrzępiących się chusteczek ostrożnie usuń mięsień z kości udowych, piszczelowych i biodrowych. 
	UWAGA: Wycięcie jak największej ilości ścięgien i mięśni z kości sprawia, że czyszczenie jest szybsze i łatwiejsze dzięki niestrzępiącym się chusteczkom (np. chusteczkom kimwipes). Zachowaj ostrożność podczas manipulowania kośćmi, ponieważ mają one tendencję do łatwego łamania się, a ich kruchość może być zwiększona w przypadku niektórych genotypów.</li>
	<li>Po wycięciu wszystkich próbek umieścić je w PBS na lodzie i przenieść do sterylnego kaptura hodowlanego na pozostałe etapy izolacji. 
	UWAGA: Praca w asepcie w jak największym stopniu zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia kultur.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcia (około 1 do 2 mm) zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu kości przed umieszczeniem ich w podzielonych na sekcje końcówkach w probówkach wirówkowych. 
	Uwaga: Upewnij się, że pokroiłeś wystarczającą ilość, aby szpik mógł zostać odwirowany; Należy jednak zachować ostrożność, aby nie ciąć zbyt mocno, ponieważ populacje komórek mają tendencję do różnicowania się w zależności od odległości w przestrzeni szpikowej.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że cały szpik został przepłukany i granulowany na dnie probówki o pojemności 1,5 ml, podczas gdy kości znajdują się wewnątrz wkładek (końcówka pipety o pojemności 200 μl lub probówka do mikrowirówki o pojemności 0,75 ml). Po pobraniu całego szpiku należy usunąć wkładki z kośćmi z probówek. 
	UWAGA: Jeśli cały szpik zostanie przepłukany, kości będą białe. Jeśli jednak szpik pozostanie w niektórych kościach, spróbuj ponownie obciąć końcówki i odwirować.</li>
</ol>
3. Zawieszenie komórek
<ol>
	<li>Za pomocą igły 25 G powoli pociągnij granulki komórek w górę i w dół, aby rozbić grudki i połącz wszystkie próbki w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej BMSC na 500 μl próbek.</li>
	<li>Umieść filtr 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuść zawiesinę komórek przez ten filtr w celu usunięcia ewentualnych fragmentów kości.</li>
</ol>
4. Posiew i hodowla mieszanych populacji komórek szpiku kostnego (całkowite BMC)
UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
<ol>
	<li>Obliczyć liczbę komórek i pokryć je w pożywce hodowlanej w proporcji 1,0 x 106 komórek/cm2. Odczekać, aż 72 godziny mieszanej kultury się przyłączą. 
	UWAGA: Zalecamy rozcieńczenie zawiesiny komórek 20x w pożywce hodowlanej i ponowne rozcieńczenie w błękicie trypanowym przed zliczeniem komórek za pomocą hemocytometru. W przypadku 7-tygodniowych samców myszy C57Bl6 / J rutynowo uzyskujemy liczbę komórek około 50 x 106 komórek, ale wiek, płeć i szczep mogą znacznie wpływać na liczbę komórek. 
	UWAGA: Mieszana populacja komórek powinna dobrze przylegać na dnie kultury.</li>
	<li>Po 72 godzinach wyjmij nośnik i zastąp go nowym nośnikiem. Kontynuuj zmianę nośnika co drugi dzień i sprawdzaj, czy nie ma zbiegów. Kiedy komórki osiągną 80-100% zbieżności, są gotowe do różnicowania. 
	UWAGA: Ponieważ ta kultura jest mieszana zarówno z BMSC, jak i HSC, może być bezpośrednio stosowana do osteoblastogenezy, adipogenezy, a także osteoklastogenezy.</li>
</ol>
5. Poszycie i kultura podzielonej populacji BMSC (adherentnych BMSC)
UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
<ol>
	<li>Umieść wszystkie komórki pobrane z kości udowych, piszczelowych i biodrowych jednej myszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (55cm2 obszaru hodowlanego). 
	UWAGA: Podczas łączenia 2-3 myszy C57BL/6J, zazwyczaj umieszczamy tę "całkowitą" populację szpiku kostnego w kolbieo średnicy 150 cm2.</li>
	<li>Po 48 godzinach mieszanej hodowli usunąć pożywki hodowlane (zawierające nieprzylegające HSC). Jeśli ma być przeprowadzone doświadczenie osteoklastogenezy, należy odłożyć tę populację komórek nieprzylegających na bok (patrz punkt 7), jeśli nie, odessać i wyrzucić te komórki.</li>
	<li>Ostrożnie umyć płytkę/kolbę PBS, aby nie naruszyć przyczepionych komórek.</li>
	<li>Usuń PBS i podnieś komórki, dodając 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C przez 1-3 minuty. Ugasić trypsynę, dodając pożywkę komórkową do zawiesiny komórkowej. W tym momencie BMSC, które są teraz podniesione, mogą zostać policzone (jak to wcześniej zrobiono w kroku 4.1) i posiane do przyszłych eksperymentów.</li>
	<li>Oblicz liczbę komórek potrzebnych do poszycia. Odwirować wymaganą objętość zawiesiny komórek przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Komórki są zwykle platerowane na podstawie eksperymentów z punktami końcowymi. Na przykład, jeśli białko / RNA ma zostać wyizolowane, zwykle płytkujemy o większej gęstości (~ 1,0-2,0 x 106 komórek / dołek na płytce 6-dołkowej).</li>
	<li>Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki hodowlanej potrzebnej do posiewu. Umieść komórki w pożywkach hodowlanych zgodnie z doświadczeniami i pozwól im się przyczepić na kilka dni. Gdy BMSC osiągną zbieg, przystąp do przeprowadzenia różnicowania.</li>
</ol>
6. Zróżnicowanie BMSC
<ol>
	<li>Osteoblasty
	<ol>
		<li>Wykonać pożywkę różnicującą osteoblasty, dodając 800 μl 1 M fosforanu β-glicerolu w PBS i 200 μl 0,5 M kwasu askorbinowego w PBS do 99 ml pożywki BMSC (patrz krok 1.1 w celu zapoznania się ze składem pożywki BMSC).
		<ol>
			<li>Gdy kultury BMSC (albo całkowite BMC z kroku 4.3, albo przylegające BMSC z kroku 5.6) zlewają się, różnicuj je w osteoblasty, zmieniając pożywki hodowlane na pożywki różnicujące osteoblasty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pożywki różnicujące należy wymieniać co drugi dzień. Komórki zaczynają wytwarzać białe guzki mineralizacji. Wizualizuj je gołym okiem na dnie studni; Proces ten może nastąpić w ciągu kilku dni do 3 tygodni.
		<ol>
			<li>W celu oceny osteoblastogenezy należy przeprowadzić barwienie fosfatazą alkaliczną i/lub barwienie metodą von Kossa na studzienkach, jak opisano w sekcji 8. 
			UWAGA: Ostrożnie zmieniaj pożywkę, przechylając płytki pod niewielkim kątem, aby uniknąć przerwania monowarstwy ogniwa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adipocyty
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę bazową adipocytów, mieszając ze sobą 90 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej, 1 ml penicyliny/streptomycyny, 100 μl 20 mM rozyglitazonu i 100 μl 2 mM insuliny. W razie potrzeby należy przechowywać tę pożywkę w temperaturze 4 °C przez tydzień podczas eksperymentu różnicowania.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do indukcji adipocytów, dodając 200 μl 62,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 25 μl 1 mM deksametazonu do 25 ml pożywki zasadowej adipocytów.</li>
		<li>Gdy posiewy BMSC (całkowite BMC z kroku 4.3 lub przylegające BMSC z kroku 5.6) zlewają się, zmień pożywkę na pożywkę do indukcji adipocytów. Zastanówmy się nad tym Dniem 0 zróżnicowania.</li>
		<li>Po 48 godzinach usunąć pożywkę i odświeżyć kulturę za pomocą pożywki do indukcji adipocytów.</li>
		<li>W dniu 4 należy przejść na pożywkę z zasadą adipocytów. 
		UWAGA: Kropelki lipidów mogą zacząć pojawiać się już w dniu 2 lub 4.</li>
		<li>W dniu 7 obserwuj, że komórki zgromadziły maksymalną ilość kropelek lipidów i wykazują fenotyp podobny do dojrzałych adipocytów. Nie należy hodować powyżej tego punktu, ponieważ może to spowodować śmierć/oderwanie komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Różnicowanie HSC na osteoklasty
<ol>
	<li>Wykonaj pożywkę różnicującą osteoklasty, dodając 50 μl 25 μg/ml aktywatora receptora liganda NFKB (RANKL) i 15 μl 25 μg/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (mCSF) do 25 ml pożywki hodowlanej BMSC.</li>
	<li>Po przyłączeniu wszystkich BMC (z kroku 4.3) lub komórek nieprzylegających (z kroku 5.2) do studzienki, pożywki hodowlane można przełączyć na pożywki różnicujące osteoklasty. Uzupełniaj pożywki różnicujące co drugi dzień.</li>
	<li>Obserwuj kultury osteoklastów każdego dnia pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu. Obserwuj, że osteoklasty łączą się i tworzą komórki wielojądrowe, zwykle około 5-7 dnia różnicowania.</li>
</ol>
8. Barwienie
<ol>
	<li>Osteoblasty 
	UWAGA: Do barwienia fosfatazą alkaliczną (AP) często używamy zestawu do barwienia AP (patrz Tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi.
	<ol>
		<li>Barwienie AP należy wykonać, postępując zgodnie z wytycznymi producenta zestawu.
		<ol>
			<li>Odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 12 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>W międzyczasie przygotuj roztwór AP za pomocą odczynników z zestawu do barwienia AP, dodając 500 μl azotynu sodu do 500 μl roztworu alkalicznego FRV i delikatnie mieszając; odstawić na 2 minuty. Dodać 22,5 ml dH2O i 500 μl Naphthol AS-BI Alkaliczny. Delikatnie wymieszaj. 
			Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
			<li>Po utrwaleniu komórek przepłucz PBS i dodaj roztwór AP do każdej studzienki (1 do 2 ml na studzienkę). Przykryj folią aluminiową i pozostaw plamę na 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zassać roztwór, przemyć wodą destylowaną i pozostawić płytkę do wyschnięcia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zdobądź obrazy barwionych kolonii za pomocą kamery, aby obserwować dodatnie komórki fosfatazy alkalicznej.</li>
		<li>Alternatywnie wykonaj barwienie Von Kossa zamiast fosfatazy alkalicznej. W tym celu należy dokładnie umyć studzienki wodą destylowaną, ponieważ wszelkie pozostałe PBS wytrącą się azotanem srebra.
		<ol>
			<li>Utrwal komórki za pomocą 4% PFA w PBS przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj tyle 5% roztworu azotanu srebra, aby przykryć studnię i wystawić na działanie silnego światła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń roztwór azotanu srebra i spłucz każdą studzienkę wodą destylowaną. Dodaj 5% roztwór tiosiarczanu sodu do komórek i odstaw na 3 minuty.</li>
		<li>Odessać tiosiarczan sodu i przemyć wodą destylowaną. Pozostaw płytkę do wyschnięcia i gołym okiem obserwuj osad mineralny zabarwiony na ciemnobrązowy/kolor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adipocyty
	<ol>
		<li>W przypadku barwienia czerwienią olejową O (ORO) utrwal komórki za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj roztwór podstawowy ORO, rozpuszczając 0,035 g w 10 ml izopropanolu. Jest to wystarczające dla płytki 6-dołkowej. Wymieszać i przepuścić roztwór za pomocą jednej bibuły filtracyjnej (wielkość porów 11 μm).</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy ORO, rozcieńczając 9 ml roztworu podstawowego ORO z 6 ml wody destylowanej. Pozostaw roztwór na kołysce, aż będzie gotowy do użycia.</li>
		<li>Przygotuj 60% izopropanolu w wodzie destylowanej (przygotuj tyle, aby przykryć każdą studzienkę).</li>
		<li>Po utrwaleniu komórek usuń utrwalacz i przemyj raz wodą destylowaną. Zastąp wodę 60% roztworem izopropanolu na 1 min. 
		UWAGA: Dodawaj płyn powoli, przechylając talerz; Adipocyty bardzo łatwo się przemieszczają.</li>
		<li>Usuń izopropanol i dodaj tyle roztworu roboczego OR, aby pokryć wszystkie komórki. Inkubować przez 15 minut na wolnoobrotowym bujaku w temperaturze pokojowej. Usunąć ORO i przemyć dwukrotnie wodą destylowaną. 
		UWAGA: W tym momencie pod mikroskopem można uwidocznić kropelki lipidów wybarwione ORO.</li>
		<li>Aby określić ilościowo ORO, należy odbarwić ORO, dodając 1 ml 100% izopropanolu do każdej studzienki i powoli kołysząc przez 10 minut.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj serię rozcieńczeń, aby utworzyć krzywą wzorcową na podstawie następujących 8 wzorców, używając roztworu roboczego ORO (2 100 μg/ml) i izopropanolu jako rozcieńczalnika: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 i 0 μg/ml.</li>
		<li>Załadować 200 μl wzorców i odbarwione próbki w trzech egzemplarzach na płytkę i odczytać absorbancję przy 490 nm.
		<ol>
			<li>Określić stężenie ORO dla każdej próbki na podstawie krzywej wzorcowej. 
			Uwaga: Zalecamy normalizację stężenia ORO do liczby komórek. Liczbę komórek można określić ilościowo za pomocą barwienia fioletem krystalicznym lub ilości DNA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osteoklasty 
	UWAGA: Gdy wszystko będzie gotowe, sugerujemy barwienie osteoklastów pod kątem kwasowej fosfatazy odpornej na winian (TRAP) za pomocą zestawu do barwienia TRAP (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>W przypadku barwienia TRAP utrwal komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego w PBS. W międzyczasie przygotuj roztwór TRAP, mieszając ze sobą 50 μl roztworu bazowego Fast Garnets, 50 μl azotynu sodu, 4,55 ml wody destylowanej, 50 μl naftolu AS-Bifosforanu, 200 μl roztworu octanu i 100 μl roztworu winianu.</li>
		<li>Odessać utrwalacz i dwukrotnie przepłukać komórki PBS przed dodaniem roztworu TRAP przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj wodą destylowaną przed policzeniem osteoklastów pod mikroskopem (powiększenie 10X). Komórki TRAP+ wydają się fioletowe z 3 lub więcej jądrami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li>
<li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li>
<li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li>
<li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60(2008).</li>
<li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li>
<li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

Autorzy ujawniają, że nie mają finansowego konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono dwie metody hodowli BMSC wraz z ich zaletami i ograniczeniami. Izolowanie komórek pochodzących ze szpiku kostnego jest procesem stosunkowo łatwym w użyciu. Jednak uzyskanie populacji komórek reprezentatywnych dla mezenchymalnych komórek macierzystych lub osteoklastycznych komórek progenitorowych może być trudne ze względu na zróżnicowane środowisko komórkowe jamy szpiku.
Hodowla całej zawartości szpiku kostnego zapewnia dokładne odwzorowanie mikrośrodowiska in vivo...

Pierwotne mysie BMSC są powszechnie używane jako model in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych od czasu ich odkrycia na początku lat 80-tych1. Rzeczywiście, w wielu badaniach hodowle komórek przylegających do plastiku wypłukanych z jamy szpiku kostnego kości długich zachowują zdolność do różnicowania się w osteoblasty, osteoklasty, chondrocyty lub adipocyty2,3,4,5. Jednak szpik kostny jest unikalną tkanką składającą się z wielu różnych populacji komórek, w tym między innymi BMSC, HSC, śródbłonka i komórek odpornościowych. W ten sposób techniki izolacji i hodowli mogą dać populacje komórek o różnej jednorodności. Stosowanie takich technik do badania potencjału różnicowania komórek może być trudne. Na przykład, porównując komórki myszy o różnych genotypach, rozpoczęcie od mieszanej populacji komórek ogranicza interpretację danych. I odwrotnie, uzyskanie jednorodnych populacji BMSC i HSC może być technicznie trudne i może nie być tak reprezentatywne dla modelu ex vivo.
W naszym laboratorium jesteśmy przede wszystkim zainteresowani wykorzystaniem BMSC ze względu na ich potencjał do różnicowania się na osteoblasty, osteoklasty i adipocyty. W niniejszej pracy przedstawiono techniki izolacji i hodowli BMSC i HSC stosowane do oceny osteoblastogenezy lub adipogenezy in vitro, a także hodowle HSC do różnicowania w osteoklasty. Jedna z metod wykorzystuje mieszaną populację komórek szpiku kostnego (BMC) zawierających BMSC i HSC bezpośrednio odpowiednie do adipogenezy, osteoblastogenezy i osteoklastogenezy (zwanych całkowitymi BMC). Metoda ta jest bliższym odwzorowaniem ex vivo niejednorodności występującej między komórkami mikrośrodowiska szpiku kostnego. Inna metoda polega na oddzieleniu komórek adherentnych od nieprzylegających w celu wyhodowania "czystszych" populacji BMSC i HSC (zwanych adherentnymi BMSC). Druga metoda pozwala na rozpoczęcie eksperymentów z hodowlą komórkową z dokładniejszą liczbą BMSC lub HSC i zmniejsza potencjał złożonych skutków pośrednich innych populacji komórek, które pozostają w hodowli. Obie metody zostały wcześniej opublikowane i wykorzystane do odpowiedzi na różne pytania badawcze6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&mu; Końcówki do pipet L&nbsp;</td><td>Probówki</td> wirówkowe Rainin <td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td><td></td>do preparowania</tr><tr><td>70 &mu; m filtry</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy alkalicznej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Whatman klasy 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kwasowej fosfatazy</td> <td>odpornej na winianSigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>elektron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alfa;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-fosforan glicerolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rozyglitazon</td><td>Kajman Chemiczny</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop inwerterowy Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Komórki zrębu szpiku kostnego (BMSC) stanowią populację komórek rutynowo używaną jako reprezentacja mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro. Znajdują się one w jamie szpiku kostnego wraz z krwiotwórczymi komórkami macierzystymi (HSC), które mogą dawać początek czerwonym krwinkom, immunologicznym komórkom progenitorowym i osteoklastom. W związku z tym ekstrakcje populacji komórek ze szpiku kostnego powodują bardzo niejednorodną mieszankę różnych populacji komórek, co może stanowić wyzwanie w projektowaniu eksperymentalnym i zakłócać interpretację danych. W laboratoriach opracowano kilka technik izolacji i hodowli w celu uzyskania mniej lub bardziej jednorodnych populacji BMSC i HSC in vitro. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody izolacji BMSC i HSC z kości długich myszy: jedną metodę, która daje mieszaną populację BMSC i HSC, a drugą metodę, która próbuje oddzielić dwie populacje komórek na podstawie adherencji. Obie metody dostarczają komórek odpowiednich do eksperymentów różnicowania osteogennego i adipogennego, a także do testów funkcjonalnych.

Przegląd hodowli komórkowych 
Dwie techniki hodowli umożliwiają ocenę różnicowania mieszanej populacji komórek szpiku kostnego (BMC), składającej się z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku (BMSC) i hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) (całkowite BMC, Rysunek 1A) lub populacji BMSC oddzielonej od HSC (adherentne BMSC, Rysunek 1B). 48 h po izolacji i wysianiu komórek ze szpiku (<strong class="xf...

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla komórek zrębu szpiku kostnego lub BMSC. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kości i adipocytów dotyczące komórek progenitorowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że BMSC można wyizolować w stosunkowo szybki, powtarzalny i niedrogi sposób.Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ etapy sekcji mogą być trudne do wyjaśnienia za pomocą samego tekstu. Przed rozpoczęciem procedury pobierania kości należy dodać 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego do jednej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki na każde trzy kości, które mają zostać pobrane. I odetnij koniec z jednej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów na probówkę do mikrowirówki, tak aby każda końcówka mogła zmieścić się w jednej probówce z zamkniętymi pokrywkami.Następnie umieść pierwszą 78-tygodniową mysz poddaną eutanazji w pozycji leżącej na desce sekcyjnej i spryskaj zwierzę 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby stworzyć namiot ze skóry na brzuchu i użyj sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać około centymetrowe nacięcie skóry. Oderwij skórę, aby odsłonić dolną część brzucha i nogi.Przeciąć wzdłuż grzbietu biodrowego każdego biodra, aby oddzielić głowy kości udowej od miednicy, i wykonaj nacięcie w linii środkowej miednicy, aby oddzielić kości biodrowe i przeciąć poniżej stawów skokowych, aby usunąć stopy. Następnie oddziel kość piszczelową od kości udowej, przecinając staw kolanowy. Następnie użyj niestrzępiących się chusteczek, aby ostrożnie usunąć mięsień z kości udowych, piszczelowych i biodrowych.Po zebraniu wszystkich kości umieścić próbki w PBS na lodzie i przenieść próbki do sterylnego kaptura hodowlanego. Stosując sterylną technikę, wykonaj od jednego do dwóch milimetrowych nacięć zarówno na bliższym, jak i dystalnym końcu każdej kości, a następnie umieść trzy kości w każdej zmodyfikowanej końcówce mikropipety w probówkach do mikrowirówek. Zebrać szpik kostny z kości przez odwirowanie, sprawdzając, czy szpik został całkowicie granulowany na dnie każdej probówki do mikrowirówki na końcu wirowania.Jeśli cały szpik został pobrany, kości będą wyglądały na białe. Wyjmij końcówki mikropipet i kości z probówek zbiorczych w celu prawidłowej utylizacji bezpieczeństwa biologicznego. Aby pokryć płytki komórki szpiku kostnego, najpierw użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby powoli ponownie zawiesić granulki i rozbić wszelkie grudki, a następnie zbierz próbki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.Dodaj 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego na 500 mikrolitrów próbki i przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie fragmenty kości. Po policzeniu wysiewaj komórki szpiku kostnego w ilości od 10 do 6 komórek na centymetr kwadratowy w świeżej pożywce hodowlanej przez 72 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Trzeciego dnia zastąp supernatant świeżą pożywką, zmieniając pożywkę co dwa dni, aż komórki osiągną zbieżność od 80% do 100%.Aby umieścić na płytce podzieloną hodowlę populacji szpiku kostnego, należy umieścić pobrane komórki szpiku kostnego od jednej myszy w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej na 48 godzin w świeżej pożywce w inkubatorze do hodowli komórkowych. W drugim dniu hodowli należy usunąć nieprzylegający supernatant zawierający krwiotwórcze komórki macierzyste i ostrożnie umyć płytkę PBS, nie naruszając przylegających komórek szpiku kostnego. Zastąp PBS 0,25% trypsyną.Po jednej do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza wygasić reakcję świeżą pożywką do hodowli komórkowych i policzyć komórki w powstałej zawiesinie komórek. Odwirować odpowiednią liczbę komórek do posiewu i ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości świeżej pożywki hodowlanej, aby uzyskać pożądaną gęstość posiewu. Następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych aż do zbiegu.Aby indukować różnicowanie osteoblastów komórek macierzystych szpiku kostnego, należy co dwa dni zastępować pożywkę do hodowli komórkowej pożywką różnicującą, aż komórki zaczną wytwarzać białe guzki mineralizacji, które można zaobserwować makroskopowo. Aby indukować różnicowanie adipocytów komórek macierzystych szpiku kostnego, należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej zlewającej się hodowli komórek szpiku kostnego pożywką indukcyjną adipocytów. Po dwóch dniach hodowli zastąp supernatant świeżą pożywką do indukcji adipocytów, zmieniając ją na pożywkę zasadową adipocytów w czwartym dniu.W siódmym dniu potwierdź, że komórki zgromadziły kropelki lipidów i że wykazują fenotyp podobny do dojrzałych adipocytów. Aby zróżnicować hematopoetyczne komórki macierzyste w osteoklasty, gdy całkowita hodowla komórek szpiku kostnego lub hodowla komórek nieprzylegających staje się przylegająca, należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej pożywką do różnicowania osteoklastów. Zmieniaj pożywkę co dwa dni i codziennie sprawdzaj różnicowanie osteoklastów pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu, aż osteoklasty połączą się i utworzą komórki wielojądrowe, zwykle około pięciu do siedmiu dni różnicowania.Zlewające się kultury BMSC można różnicować w osteoblasty za pomocą pożywki osteogennej złożonej z kwasu askorbinowego i beta-glicerofosforanu. Po kilku dniach różnicowania osteoblasty zaczynają wyrażać fosfatazę alkaliczną. Dalsze różnicowanie spowoduje produkcję macierzy kostnej, a ostatecznie mineralizację tej macierzy.Co ciekawe, tylko część komórek różnicuje się w osteoblasty in vitro, co ujawnia barwienie fioletem krystalicznym. Niezależnie od tego, czy stosuje się populacje mieszane, czy populacje komórek szpiku kostnego, tylko część komórek różnicuje się w adipocyty, które pojawiają się jako okrągłe komórki z wieloma wakuolami lipidowymi, które można zabarwić czerwonym barwnikiem O. Hodowle ludzkich komórek macierzystych uzupełnione czynnikiem stymulującym komórki myszy i RANKL szybko się łączą, tworząc komórki wielojądrowe, które barwią się pozytywnie na TRAP.Te osteoklasty są zdolne do resorpcji macierzy mineralnej in vitro i mogą być wykorzystywane do oceny aktywności osteoklastycznej. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, w zależności od liczby myszy. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wcześniejszej sterylizacji narzędzi i przygotowaniu podłoża, aby móc pracować jak najszybciej i jak najbardziej aseptycznie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i hodować komórki zrębu szpiku kostnego.

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

W tym filmie pokazujemy izolację i hodowlę komórek zrębu szpiku kostnego z długich kości myszy. Izolowane przylegające BMSC mogą być wykorzystane do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla komórek zrębu szpiku kostnego z kości piszczelowej myszy

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek zrębu szpiku kostnego od myszy. Technika umożliwia różnicowanie osteoblastów, adipocytów i osteoklastów w sposób szybki i powtarzalny.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Przeglądaj więcej filmów