Name: Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę syntezy funkcjonalizowanych nanocząstek złota pokrytych polimerem PEG o średnicy 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków w zastosowaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Inżynierii Chemicznej Uniwersytetu Północno-Wschodniego, fundusze start-up oraz grant na badania pilotażowe poziomu 1 od Biura Rektora Uniwersytetu Północno-Wschodniego, HL125499 NIH K01 oraz grant NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Autorzy chcieliby również podziękować Thomasowi J. Websterowi i jego laboratorium za pomoc, a także Centrum Nauki i Technologii Nanomedycyny oraz Wydziałowi Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Północno-Wschodniego.

1. Przygotowanie lub zaopatrzenie w roztwory podstawowe (do przechowywania w temperaturze pokojowej lub zamrożone do momentu użycia)
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 400 mg NaOH w 10 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej i dobrze mieszając materiały. 
	UWAGA: Woda ultraczysta jest definiowana jako woda bez zanieczyszczeń, takich jak cząstki stałe, bakterie, nukleazy, jony lub śladowe ilości substancji organicznych. Do uzyskania ultraczystej wody stosuje się system oczyszczania, w wyniku którego jej rezystywność wynosi do 18,2 mΩ·cm, co wskazuje na niskie zanieczyszczenie anionowe. Nie zaleca się używania dostępnej na rynku butelkowanej wody ultraczystej. Odtąd ta ultraczysta woda będzie nazywana wodą, chyba że określono inaczej.</li>
	<li>Przygotować 6 M roztwór podstawowy NaOH, rozpuszczając 2,4 g NaOH w 10 ml wody i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 250 mM roztwór podstawowy kwasu chloroaurowego (HAuCl4), rozpuszczając 1 g wysuszonego HAuCl4 w 10,16 ml wody. Rozcieńczyć 1 ml 250 mM HAuCl4 9 ml wody, aby uzyskać stężenie robocze 25 mM HAuCl4. Roztwór HAuCl4 należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 0,1 M bufor węglanowy o pH 8,8, rozpuszczając 84 mg wodorowęglanu sodu w 10 ml wody i dostosowując pH do 8,8 przez dodanie 6 M NaOH z kroku 1.2. Przechowywać bufor węglanowy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmieszać 20 ml soli tetrazolowej, 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-soli tetrazolowej (MTS) ze środkiem stabilizującym, etosiarczanem fenazyny (PES) (patrz tabela materiałów). Mieszaninę MTS/PES należy przechowywać w porcjach (maksymalnie przez 10 cykli zamrażania i rozmrażania) w temperaturze -20 °C w ciemności.</li>
</ol>
2. Synteza rdzeni nanocząstek złota
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczony roztwór THPC, dodając 12 μl 80% THPC w wodzie do 1 ml wody w probówce mikrowirówkowej o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zabezpiecz kolbę okrągłodenną o pojemności 100 ml na środku magnetycznej płytki mieszającej. Wlej 45 ml wody do kolby i mieszaj wodę z prędkością 300 obr./min za pomocą małego mieszadła magnetycznego w kształcie jajka. Dodać 0,5 ml 1 M NaOH i 1 ml rozcieńczonego roztworu THPC. Kontynuuj energiczne mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez 5 minut.</li>
	<li>Kontynuuj mieszanie mieszaniny i dodaj 2 ml 25 ml 25 mM roztworu HAuCl4. Kolor mieszaniny zmieni się z żółtego na ciemnobrązowy w ciągu kilku sekund, co wskazuje na tworzenie się AuNP z THPC z ładunkiem ujemnym. Mieszaj mieszaninę przez dodatkowe 15 minut, aby umożliwić całkowite uformowanie złotych rdzeni.</li>
</ol>
3. Dodanie korony polimerowej wokół nanocząstek złota
<ol>
	<li>W ciągu 15 minut opisanych w kroku 2.3 należy przygotować roztwory PEG, rozpuszczając każdy z następujących składników w 1 ml wody w szklanych fiolkach o pojemności 4 ml: 30 mg NH 2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH. 
	UWAGA: Otrzymane stężenia powinny wynosić 8,8 M NH 2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH i 3,75 M COOH-PEG-SH.</li>
	<li>Po zmniejszeniu prędkości mieszania roztworu w kolbie okrągłodennej do 100 obr./min, należy kroplami dodawać roztwory PEG do roztworu AuNP z zaślepką THPC. Kontynuuj delikatne mieszanie mieszaniny przez noc, w temperaturze pokojowej, aby zapewnić skuteczne usunięcie THPC i zastąpienie go PEG.</li>
	<li>Przez następne 72 godziny należy użyć membrany celulozowej o masie cząsteczkowej 12-14 kDa do dializowania mieszanej mieszaniny w 4-litrowym wiadrze z wodą mieszaną z prędkością 60 obr./min. Związać końce membran klipsami do dializy i przenieść roztwór za pomocą pipety. 
	UWAGA: Ten proces dializy z membraną odcinającą 12-14 kDa usuwa tylko nieprzereagowane PEG, THPC i inne reagenty chemiczne poprzez dyfuzję wzdłuż gradientu stężeń.</li>
	<li>Aby utrzymać wysoki gradient stężenia i sprzyjać ciągłej dyfuzji, należy wymieniać wodę co 2 godziny przez pierwsze 6 godzin i co 6-12 godzin przez pozostałe 66 godzin. 
	UWAGA: Celem tego harmonogramu wymiany wody jest dostosowanie się do szybkiej dyfuzji, która zachodzi na wczesnym etapie, ze względu na początkowo wysokie stężenie w próbce. Opisany powyżej proces dializy pozostawia roztwór nanocząstek częściowo oczyszczony, ponieważ nanocząstki, osady, agregaty i inne zanieczyszczenia o dużych rozmiarach nie mogą przejść przez pory membrany odcinającej 12-14 kDa.</li>
	<li>Przefiltruj częściowo oczyszczony roztwór nanocząstek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby usunąć pozostałe osady, agregaty i inne zanieczyszczenia o dużych rozmiarach.</li>
	<li>Umieścić probówkę stożkową w zamrażarce o temperaturze -80 °C i pozostawić oczyszczony roztwór PEGylowanego AuNP (PEG-AuNP) do zamrożenia przez około 5 godzin.</li>
	<li>Za pomocą liofilizatora liofilizować oczyszczony PEG-AuNP.</li>
	<li>Suchy, oczyszczony PEG-AuNP należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Sprzęganie fluoroforów za pomocą estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) z grupami NH2 na PEG-AuNP
<ol>
	<li>Umieść kolbę okrągłodenną o pojemności 50 ml na środku magnetycznej płytki mieszającej. Napełnij kolbę 18 ml wody i mieszaj wodę z prędkością 100 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego w kształcie jajka.</li>
	<li>Zważyć 2 mg liofilizowanego PEG-AuNP w stożkowej probówce o pojemności 4 ml, używając bardzo precyzyjnej wagi stołowej. Za pomocą pistoletu antystatycznego należy wyeliminować ładunki elektrostatyczne i przywieranie proszku PEG-AuNP do powierzchni tuby. Dodaj 2 ml wody do probówki. Wlać 2 ml roztworu PEG-AuNP do kolby okrągłodennej w celu dalszego rozpuszczenia w sumie 20 ml wody. Kontynuuj mieszanie mieszaniny z prędkością 100 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego w kształcie jajka.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu węglanowego o pH 8,8 o 0,1 M do 20 ml odtworzonego AuNP znajdującego się w kolbie okrągłodennej. Kontynuuj mieszanie.</li>
	<li>Dodać 5 μl 10 mg/ml fluorescencyjnego estru NHS w dimetylosulfotlenku. 
	UWAGA: W tym procesie można użyć dowolnego barwnika fluorescencyjnego. Mieszaj fluorescencyjny PEG przez noc. Przechowywać w temperaturze pokojowej i przykryć folią.</li>
	<li>Przez następne 72 godziny należy usuwać nadmiar fluoroforów zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.3. Krótko dializować wymieszaną mieszaninę za pomocą 4 l wiadra z wodą i membrany celulozowej o masie cząsteczkowej 12-14 kDa. Zmieniaj wodę co 2 h przez pierwsze 6 h i co 6-12 h przez pozostałe 66 h.</li>
	<li>Otrzymać 1 ml oczyszczonego roztworu fluorescencyjnego PEG-AuNP, który zostanie użyty do charakterystyki opisanej poniżej w sekcji 5. Pozostały roztwór należy zamrozić i poddać liofilizacji w celu otrzymania nanocząstek fluorescencyjnych w postaci sproszkowanej do przechowywania w temperaturze 4 °C, jak opisano w krokach 3.5–3.7.</li>
	<li>Użyj filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby wysterylizować i usunąć wszelkie potencjalne osady po rozpuszczeniu do zastosowań w hodowlach komórkowych.</li>
</ol>
5. Charakterystyka fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek złota
<ol>
	<li>Wykorzystanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do wizualizacji rdzenia nanocząstek złota i ilościowego określenia rozmiarów
	<ol>
		<li>Upuść 10 μl oczyszczonego roztworu fluorescencyjnego PEG-AuNP na siatkę TEM pokrytą węglem.</li>
		<li>Po 5 minutach za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej ostrożnie odsunąć nadmiar płynu z krawędzi kratki TEM, aż do pozostawienia filmu zawierającego fluorescencyjne PEG-AuNPs.</li>
		<li>Zobacz fluorescencyjne PEG-AuNP przy napięciu 80 kV i powiększeniu 50 000-150 000. Rób zdjęcia cyfrowe. 
		UWAGA: Widoczny będzie tylko złoty rdzeń, ponieważ PEG nie ma gęstości elektronów na TEM.</li>
		<li>Za pomocą oprogramowania pomiarowego ustaw skalę pomiarową w korelacji z podziałką liniową. Oblicz średnice około 20 złotych rdzeni, a następnie określ średnią średnicę złotego rdzenia. 
		UWAGA: System obrazowania TEM automatycznie umieszcza podziałkę liniową na zdjęciach cyfrowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar hydrodynamicznej wielkości nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
	<ol>
		<li>Przenieść 1 mg liofilizowanych AuNP pokrytych THPC do probówki mikrowirówkowej, stosując metodę opisaną w kroku 4.2. Przenieść 1 mg liofilizowanego PEG-AuNP w osobnej probówce. Dodaj 1 ml wody do każdej probówki i przenieś każdy roztwór AuNP do przezroczystego plastiku o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Umieść kuwetę w przyrządzie DLS i zmierz sferyczne średnice hydrodynamiczne za pomocą oprogramowania analizatora cząstek, które jest wbudowane w system DLS.</li>
		<li>Wykreślić zmierzone średnice hydrodynamiczne w formacie histogramu. 
		UWAGA: Histogram pogrupuje nanocząstki według wielkości. Największa grupa nanocząstek wyjaśni średnicę, która najlepiej opisuje wielkość AuNP zsyntetyzowanych w tym protokole.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie fluorescencji fluorometrycznej 
	UWAGA: Ta sama próbka i kuweta z kroku 5.2 mogą być używane do pomiaru sygnału fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Wyjmij kuwetę z DLS i włóż do spektrofluorometru. Ustaw długość fali wzbudzenia na 633 nm i odczytuj emitowane sygnały fluorescencyjne w zakresie długości fal 650-800 nm.</li>
		<li>Upewnij się, że szczyt wynosi około 665 nm, co koreluje ze szczytem emisji dla NHS. 
		UWAGA: Dostosuj długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z fluoroforem użytym w procesie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test MTS11 do oceny biokompatybilności
	<ol>
		<li>Na 96-dołkowej, przezroczystej, sterylnej płytce poddanej hodowli tkankowej, odpipetować 100 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM; uzupełnione 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) i 3,2 x 103 komórek do każdej studzienki. 
		UWAGA: W tym badaniu wykorzystano komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura. Łącznie wykorzystuje się 21 studzienek, aby umożliwić przeprowadzenie 3 powtórzeń dla każdego z 7 różnych stężeń nanocząstek (patrz krok 5.4.3 w celu uzyskania konkretnych stężeń będących przedmiotem zainteresowania).</li>
		<li>Pozwól komórkom rosnąć do zbiegu w inkubatorach o kontrolowanej wilgotności i 5% CO2 w temperaturze 37 °C11.</li>
		<li>Przygotuj pojedyncze probówki do mikrowirówek, z których każda zawiera 300 μl DMEM z nanocząstkami o różnych stężeniach. To badanie wymaga 7 różnych probówek DMEM o następujących stężeniach PEG-AuNP: 0 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/ml i 1,000 μg/ml.</li>
		<li>Odessać DMEM z probówki. Wypełnić studzienki trzykrotnie 100 μl pożywki DMEM zawierającej 0, 10, 50, 100, 250, 500 lub 1,000 μg/ml AuNP.</li>
		<li>Pozwól komórkom i nanocząstkom na wspólną inkubację przez określony czas, tutaj przez 16 godzin.</li>
		<li>Pod koniec okresu inkubacji rozmrozić mieszaninę MTS/PES z kroku 1.5.</li>
		<li>Po inkubacji odessać DMEM i zawieszone, luźno przyczepione nanocząstki z dołków. Dodać 100 μl świeżego DMEM wraz z 20 μL roztworu MTS/PES, aby uzyskać stosunek 1:5 MTS/PES do DMEM zgodnie z protokołem producenta. Inkubować komórki z MTS/PES w temperaturze 37 °C przez 2 godziny 
		UWAGA: Ten 2-godzinny czas inkubacji zależy od aktywności metabolicznej komórek śródbłonka i może być zwiększony do 4 godzin w przypadku innych typów komórek. W ciągu 2 godzin MTS jest metabolizowany przez komórki śródbłonka do kolorowego formazanu, który miesza się z DMEM. Biokompatybilność PEG-AuNP i prawdopodobieństwo żywotności komórek zostaną wykazane przy użyciu bardziej kolorowego formazanu. Toksyczność PEG-AuNP i szansa na to, że komórki umierają, będą pokazane za pomocą mniej intensywnego koloru.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę kolorymetryczną każdej studzienki, odczytując absorbancję przy 492 nm za pomocą kompatybilnego czytnika płytek.</li>
		<li>Dla każdego stężenia nanocząstek należy obliczyć średnią absorbancję na podstawie trzykrotnych wartości absorbancji. Podzielić średnią absorbancję przez wartość uzyskaną z uśrednienia absorbancji w studzienkach zawierających 0 μg/ml nanocząstek. 
		UWAGA: Te studzienki, które nie zawierają AuNP, służą jako kontrole do obliczania procentowej żywotności komórek w odpowiedzi na traktowanie nanocząstkami podawanymi w innych studzienkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna ocena wychwytu nanocząstek w przylegających komórkach śródbłonka z nienaruszonym lub dysfunkcyjnym glikokaliksem11
	<ol>
		<li>Wysiew 1,0 x 104 komórki/cm,2 komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura na sterylnych 12 mm szklanych szkiełkach nakrywkowych i komórki paszowe z DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Pozwól komórkom rosnąć do pełnej konfluencji w inkubatorach o kontrolowanej wilgotności i CO2 w temperaturze 37 °C przez około 3 dni.</li>
		<li>Dodaj zabiegi, aby zmodyfikować glikokaliks, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład 2-godzinne traktowanie hodowanych komórek śródbłonka enzymem heparynazy III o stężeniu 2,5 x 10-6 j.m. rozkłada glikokaliks, specyficznie rozszczepiając jego składnik siarczanu heparanu. 
		UWAGA: Zdrowy glikokaliks można modelować poprzez hodowlę komórek śródbłonka, jak opisano w kroku 5.5.1, bez dodawania enzymów degradacyjnych.</li>
		<li>Gdy glikokaliks śródbłonka pozostaje nienaruszony lub stanie się dysfunkcyjny, inkubuj komórki śródbłonka z fluorescencyjnymi AuNP w stężeniu 550 μg/ml przez 16 godzin lub inny pożądany czas.</li>
		<li>Delikatnie przemyć komórki 2 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej o temperaturze 37 °C w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS; zawierającej 100 mg/l wapnia i 100 mg/l magnezu). Zanurz komórki w 2 ml 2% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego w PBS i pozwól komórkom utrwalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń roztwór utrwalający aldehyd i myj komórki PBS o temperaturze pokojowej przez trzy 5-minutowe cykle.</li>
		<li>Przed zastosowaniem przeciwciała pierwotnego należy wystawić komórki śródbłonka na działanie 2% surowicy koziej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Komórki muszą być całkowicie pokryte roztworem blokującym.</li>
		<li>Inkubować komórki śródbłonka przez noc z 1% pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko siarczanowi anty-heparanu w 2% surowicy koziej w PBS w temperaturze 4 °C w celu oznaczenia składnika siarczanu heparanu glikokaliksu. Upewnij się, że utrwalone komórki są w pełnym kontakcie z roztworem przeciwciała.</li>
		<li>Następnego dnia wypłucz przeciwciało PBS o temperaturze pokojowej przez trzy 10-minutowe cykle.</li>
		<li>Inkubować komórki śródbłonka w rozcieńczeniu 1:1 000 odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności lub przykryte folią aluminiową.</li>
		<li>Przepłukać przeciwciało drugorzędowe PBS o temperaturze pokojowej przez trzy cykle po 10 minut.</li>
		<li>Zamocuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu zawierającego dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do barwienia jąder. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci.</li>
		<li>Zobrazuj fluorescencyjne, wybarwione immunologicznie próbki komórek śródbłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej, używając kanałów niebieskich, zielonych i dalekiej czerwieni do wizualizacji jąder, odpowiednio jąder, glikokaliksu siarczanu heparanu i nanocząstek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+magnetic+nanoparticles+for+targeted+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+polymer+nanoparticles+for+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).</li>
<li>Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+in+delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles in delivery applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (11), 1307-1315 (2008).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+generation+gold+nanoplatform+optimized+for+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy.</a> Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).</li>
<li>Tarbell, J. M., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+a+mechano-sensor+and+-transducer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer.</a> Sci. Signal. 1 (40), (2008).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).</li>
<li>Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+the+endothelial+glycocalyx+in+clinical+settings%3A+searching+for+the+sheddases%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases.</a> Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).</li>
<li>Muzykantov, V., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+delivery+of+drugs+in+the+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Transp.+Phenom%22%5BJournal%5D)">Targeting delivery of drugs in the vascular system.</a> Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).</li>
<li>Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+therapeutics+to+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of therapeutics to endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).</li>
<li>Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology+for+drug+delivery+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+conditions+influence+nanoparticle+uptake+for+passive+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting.</a> Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).</li>
<li>Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00441-014-1853-5">Nanomechanics of vascular endothelium.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technika ta jest skuteczną metodą syntezy konfigurowalnych, ultramałych AuNP pokrytych PEG. Ważną częścią tej procedury jest początkowe tworzenie się nanocząstek złota pokrytych THPC, co można potwierdzić zmianą koloru z żółtego na brązowy, która nastąpi po dodaniu HAuCl4 do zawartości kolby okrągłodennej (krok 2.3 protokołu). Brak zmiany koloru oznacza, że nie powstały żadne nanocząstki i że początkowe kroki należy sprawdzić i powtórzyć przed kontynuowaniem. W przypadku, gdy kolor zmieni się na inny niż brązowy, taki jak czerwony lub szary, powstałe cząstki prawdopodobnie nie będą znajdować się w okolicach docelowych 2,5 nm i należy również wykonać nową partię.
Po utworzeniu złotego rdzenia, wymiana THPC na PEG i procedury oczyszczania obejmują kilka kluczowych kroków do pomyślnego zakończenia protokołu. Mieszanie przez noc pozwala na zakończenie reakcji wymiany. Nieudane oczyszczanie może wystąpić, jeśli woda do dializy nie zostanie zmieniona z zalecaną częstotliwością. Agregacja i wytrącanie się cząstek może również wystąpić, jeśli cząstki są pozostawione w dializie na dłużej niż 72 godziny. Inne potencjalne problemy można zaobserwować podczas liofilizacji. Jeśli ultramały roztwór AuNP pokryty PEG nie został całkowicie zamrożony lub jeśli liofilizator nie został prawidłowo ustawiony, próbki mogą zostać utracone. Zapoznaj się z instrukcją obsługi liofilizatora, ponieważ niektóre urządzenia mogą wymagać różnych przygotowań próbki.
Łatwość syntezy i biokompatybilność powstałych cząstek stanowią zalety stosowania tych PEG-AuNP. Ponadto te nanocząstki mają tę zaletę, że mogą wchodzić w interakcje ze strukturami komórkowymi w nanoskali, czego dowodem jest zdolność do identyfikacji zdegradowanego glikokaliksu przez wychwyt tych nanocząstek. Zaleta ta może być wykorzystana do opracowania nowych terapii miażdżycy i środków zapobiegawczych. Poza tym, co tutaj prezentujemy, kolejną zaletą tego protokołu jest to, że pozwala on na szerokie dostosowanie cząstek, a także zwiększoną stabilność i możliwości przechowywania poprzez dołączenie PEG zawierającego tiol do nanocząstek złota4. Drugi koniec łańcucha PEG może zawierać dowolną grupę funkcyjną, a niezliczona ilość cząsteczek może być sprzężona z tymi grupami. W tym protokole przyłączone są wszystkie trzy popularne grupy funkcyjne (metylowa, karboksylowa i aminowa). Stosunek PEG jest wybierany tak, aby w pierwszej kolejności nadać priorytet wykrywaniu fluorescencyjnemu, a następnie możliwości włączenia wtórnego ugrupowania celującego przy użyciu grupy kwasów karboksylowych. Proporcje tych grup można dostosować w zależności od zastosowania, a także dostosować długości i kształty polimerów.
Aby zmierzyć wychwyt cząstek, skoniugowaliśmy sondę fluorescencyjną z jedną z grup funkcyjnych. Należy zauważyć, że każda koniugacja wykraczająca poza to, co opisaliśmy, spowoduje zmianę właściwości powierzchni nanocząstki. Każda iteracja nanocząstek w odniesieniu do dodatkowych składników i reakcji koniugacji powinna być testowana pod kątem pożądanych właściwości.
Metoda ta wytwarza ultramałe nanocząstki złota, których celem jest przezwyciężenie właściwości obronnych śródbłonkowej zewnątrzkomórkowej glikokaliksu, która utrudnia wychwyt nanocząstek o konwencjonalnych rozmiarach. Jednak mały rozmiar sprawia trudności zarówno w aspekcie obrazowania, jak i ładowania leku. Cząstki te są znacznie mniejsze niż typowy zakres wielkości nanocząstek, w wyniku czego powierzchnia dostępna dla przyłączeń terapeutycznych i ugrupowań docelowych jest znacznie zmniejszona. Może to prowadzić do trudności w odbieraniu pojedynczych sygnałów w zastosowaniach obrazowych, chociaż skupiska cząstek można nadal łatwo zidentyfikować, jak pokazano na obrazach konfokalnych. Zmniejszona powierzchnia do przyłączania docelowych ligandów i środków terapeutycznych może wymagać podania większej ilości cząstek, aby osiągnąć wymagania dotyczące dawki docelowej. Jednak mniejsze cząstki będą bardziej wydajne w dostarczaniu, jeśli weźmie się pod uwagę glikokaliks.
Te nowatorskie ultramałe cząstki są zdolne do dostarczania do trudno dostępnych obszarów w nanoskali w organizmie przy minimalnym zakłóceniu mikrośrodowiska. Dodanie PEG pozwala na zwiększenie biokompatybilności i oferuje grupy funkcyjne do dużego dostosowania cząstek do różnych zastosowań. Mniejszy rozmiar w porównaniu z typowymi nanocząstkami ma pewne wady, ale jeśli zostanie opracowana strategicznie, ultramała cząstka jest obiecującym podejściem do akomodacji trudnego do penetracji, skomplikowanego i delikatnego glikokaliksu w celowaniu naczyniowym i dostarczaniu leków.

Nanocząsteczki zostały zastosowane do dostarczania leków i obrazowania ze względu na ich zdolność do poruszania się po ciele w celu dotarcia do docelowych obszarów zainteresowania1,2. Cząstki mogą gromadzić się w guzach przez nieszczelne naczynia krwionośne lub lokalizować się w miejscu, w którym docelowy ligand jest nadmiernie eksprymowany i odsłonięty. Złoto, w szczególności, stało się powszechnie stosowanym materiałem nanocząsteczkowym ze względu na jego unikalne właściwości chemiczne i fizyczne, które wpływają na transport i uwalnianie środków terapeutycznych3. Złoto jest skutecznym materiałem nanocząsteczkowym, ponieważ jego powierzchnia może być modyfikowana w celu wiązania się z tiolami i ma wysoką biokompatybilność ze względu na niską toksyczność4. AuNP mogą być nośnikami dużych leków biomolekularnych i odniosły sukces w dostarczaniu peptydów, kwasów nukleinowych i białek, dzięki czemu AuNP są korzystne dla celu2,4.
Niestety, skuteczność dostarczania leków przez nanocząsteczki została ograniczona przez ujemnie naładowany glikokaliks, który jest zewnątrzkomórkową powłoką na błonie większości komórek ssaków i ma rozmiary porów do 7 nm5,6. Ta wielkość porów jest mniejsza niż w przypadku większości nanocząsteczkowych nośników leków, które mają typowe średnice w zakresie 50-200 nm. W warunkach chorobowych te pory glikokaliksu stają się większe w wyniku degradacji, zwiększając przepuszczalność do komórek śródbłonka. Jednak większość nanocząstek jest nadal zbyt duża, aby wykorzystać tę zmianę strukturalną w glikokaliksie. Jedną z implikacji tego niedopasowania wielkości jest to, że cząsteczki o konwencjonalnych rozmiarach nie oddziałują korzystnie z komórkami śródbłonka wyściełającymi naczynia krwionośne. Wpływa to na dostarczanie cząstek podawanych dożylnie do śródbłonka, a także można to powiedzieć o transporcie cząstek przez barierę krew-mózg7,8,9,10.
Jednym z podejść do walki z tym problemem jest wykorzystanie mniejszych cząsteczek do przejścia przez małe pory w glikokaliksie. Tutaj syntetyzujemy ultramałą nanocząsteczkę złota o długości fali 10,5 nm, która normalnie powinna być odstraszana przez nienaruszony, zdrowy glikokaliks. Gdy glikokaliks zacznie być zagrożony, nanocząsteczka powinna łatwo przenikać do komórek przez zwiększający się rozmiar porów. Protokół opisany w tym artykule szczegółowo opisuje syntezę ultramałego złotego rdzenia pokrytego PEG, który zwiększa biokompatybilność i zmniejsza klirens ogólnoustrojowy4. PEG może również zawierać kilka typów grup funkcyjnych, otwierając drogi do koniugacji docelowych ligandów, fluoroforów i środków terapeutycznych. Wcześniej opublikowane wyniki wskazują, że te ultramałe nanocząstki mają tendencję do korzystniejszego wychwytywania w regionach zakłóconej funkcji glikokaliksu śródbłonka, nawet bez aktywnego ukierunkowania4,11. Wskazuje to na wykonalność i znaczenie wykorzystania cząstek o odpowiedniej wielkości do zastosowań związanych z dostarczaniem. Poniższy protokół przedstawia syntezę, oczyszczanie i charakterystykę AuNP pokrytych PEG (PEG-AuNP), z dyskusją na temat dostosowania grup funkcyjnych i koniugacji do innych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) Trójwodny chlorek (HAuCl4,3H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (hydroksymetylo)chlorek fosfenium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861</td><td></td></tr><tr><td>Monofunkcyjny mPEG-tiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2,000 Da</td></tr><tr><td>hetero bi-funkcjonalne anime-PEG-tiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>MW: 3,400 Da</td></tr><tr><td>Karboksymetylo-PEG-tiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2,000 Da</td></tr><tr><td>Celulozowa membrana dializowa (12-14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat instrument antystatyczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647) ester sukcynimidylowy kwasu karboksylowego</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>Fluorofor</td></tr><tr><td>Fisherbrand Jakościowe koła z gładkiej bibuły filtracyjnej - klasa P5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła</td><td>Brookhaven Instruments Corporation Brookhaven</td><td>90 Plus Analizator wielkości cząstek</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr DLS Horiba</td><td>Scientific</td><td>Jobin Yvon Fluromax 4</td><td>Fluorometr</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek (MTS)</td> Czytnik płytek <td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax M4</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>10E4 epitop HS mysie przeciwciało monoklonalne IgM (przeciwciało pierwszorzędowe)</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało IgG (przeciwciało drugorzędowe)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37120</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Pożywka montażowa VECTASHIELD z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td> Z <td></td></tr><tr><td>mikroskopem konfokalnym</td> DAPI <td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Mikroskopia Zeiss LSM 700</td><td>Confocol</td></tr></tbody></table>

synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Nanocząsteczki złota (AuNPs) były szeroko stosowane w badaniach medycznych ze względu na ich rozmiar, biokompatybilność i modyfikowalną powierzchnię. Specyficzne celowanie i dostarczanie leków to tylko niektóre z zastosowań tych AuNPs, ale właściwości obronne śródbłonkowych macierzy zewnątrzkomórkowych utrudniają wychwyt cząstek. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy metodę syntezy ultramałych nanocząstek złota w celu poprawy dostarczania naczyniowego, z konfigurowalnymi grupami funkcyjnymi i długościami polimerów w celu dalszych dostosowań. Protokół daje AuNP o długości 2,5 nm, które są pokryte chlorkiem tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowym (THPC). Zastąpienie THPC heterofunkcyjnym glikolem polietylenowym (PEG) na powierzchni AuNP zwiększa promień hydrodynamiczny do 10,5 nm, zapewniając jednocześnie różne grupy funkcyjne na powierzchni. Ostatnia część protokołu obejmuje opcjonalne dodanie fluoroforu, aby umożliwić wizualizację AuNP pod wpływem fluorescencji w celu śledzenia wychwytu nanocząstek. Dializa i liofilizacja zostały wykorzystane do oczyszczenia i wyizolowania AuNPs. Te fluorescencyjne nanocząstki można wizualizować zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo dzięki biokompatybilnej powłoce PEG i sondom fluorescencyjnym. Dodatkowo, zakres rozmiarów tych nanocząstek sprawia, że są one idealnym kandydatem do badania glikokaliksu bez zakłócania normalnej funkcji naczyń krwionośnych, co może prowadzić do poprawy dostarczania i terapii.

Zsyntetyzowane AuNP, powlekane THPC lub PEG (Rycina 1A i Rysunek 1B(odpowiednio), obrazuje się za pomocą TEM, a rozmiary cząstek mierzy się przy użyciu TEM i DLS, aby zapewnić właściwy rozkład wielkości nanocząstek. Rycina 2 przedstawia obraz TEM próbki THPC-AuNP przy napięciu 80 kV i powiększeniu 150 000x. Średnice cząstek THPC-AuNP mieszczą się w zakresie 2–3 nm, w oparciu o pasek kalibracyjny na obrazach TEM. Rozmiar THPC-AuNP jest również widoczny na histogramie pomiaru wielkości metodą DLS przedstawionym w Rysunek 2, na którym pokazano, że nanocząsteczki AuNP powlekane THPC wykazują piki przy 2,5 nm. PEGylacja nie jest widoczna w TEM, ponieważ polimery nie są gęste elektronowo. Obrazowanie TEM próbek PEG-AuNP jedynie potwierdza obecność pojedynczych, rozproszonych cząsteczek, co jest spodziewane, gdyż korona polimeru PEG wokół nanocząsteczek zapobiega ich agregacji. Dla tych próbek PEG-AuNP histogram pomiaru rozmiaru DLS wykazuje przesunięcie piku do około 10,5 nm w DLS. Przyłączenie kolejnych ligandów lub leków do grup funkcyjnych również wpłynie na rozmiar nanocząsteczki i powinno zostać uwzględnione podczas pomiaru średnicy.
Dodanie fluoroforu (Rycina 1C) potwierdza się za pomocą fluorometru, mierząc sygnał fluorescencji z próbki nanocząsteczek, co przedstawiono na Rycynie 3. Przy wzbudzeniu falą o długości 633 nm zmierzono emisję z maksimum w zakresie od 660 do 672 nm, co jest zgodne z informacjami producenta o maksymalnej emisji przy 665 nm. Przyłączenie innych sond fluorescencyjnych należy sprawdzić w podobny sposób, aby upewnić się co do odpowiedzi fluorescencyjnej.
Biokompatybilność cząstek oraz powiązana z nią żywotność komórek są oceniane przy użyciu testu MTS w celu sprawdzenia względnego metabolizmu komórkowego po 16 h inkubacji z różnymi stężeniami nanocząstek. AuNPs pegylowane z koniugatem fluoroforu nie wykazują znaczącej toksyczności, co potwierdzają podobne poziomy żywotności komórek dla wszystkich stężeń do 1 mg/mL (Rysunek 4A). Biokompatybilność ta może ulec zmianie w zależności od zastosowanego leku terapeutycznego lub ligandu przyłączonego do pozostałych grup funkcyjnych w celu dalszej modyfikacji cząstek. Przyłączanie leków ma tendencję do zwiększania toksyczności, jednak w zależności od stężeń roboczych może to nie wpływać na żywotność w sposób znaczący.
Wchłanianie fluorescencyjnych, PEGylowanych AuNP (Rysunek 1C) przez komórki adherentne oceniano przy użyciu hodowlanych komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura z nienaruszonym lub dysfunkcyjnym glikokaliksem (Rysunek 4B). Warunki dysfunkcji glikokaliksu uzyskano poprzez dodanie do hodowli enzymu heparynazy III, co doprowadziło do degradacji komponentu siarczanu heparanu glikokaliksu i naruszenia macierzy12. Rysunek 4B przedstawia różne poziomy wchłaniania PEG-AuNP w postaci czerwonych kropek na przekroju reprezentatywnych komórek śródbłonka. Zdrowy glikokaliks hamuje wchłanianie tych nanocząsteczek złota, jednak po zastosowaniu enzymu obserwuje się znaczny wzrost tego procesu11. Wynik ten podkreśla potencjał tych ultrasmałych nanocząsteczek w dostarczaniu leków do komórek śródbłonka w sposób kontrolowany przez specyficzne oddziaływania zależne od stanu glikokaliksu.
<img alt="Schemat procesu funkcjonalizacji nanocząstek cząsteczkami organicznymi, ilustrujący modyfikację powierzchni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematy nanocząstek złota. (A) Nanosfera AuNP powleczona THPC przed zastąpieniem PEG. (B) PEGylana AuNP z 3 typami zakończeń PEG, w tym COOH, NH2 i CH3. Niebieskie fale reprezentują polimer. (C) Koniugowane nanocząstki do obrazowania fluorescencyjnego. Czerwone gwiazdki wskazują fluorofory skoniugowane z grupami funkcyjnymi NH2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład wielkości nanocząsteczek; obraz TEM i wykres histogramu; analiza AuNP vs PEG-AuNP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pomiary wielkości nanocząsteczek złota. Po lewej: TEM nanocząsteczek złota przed dodaniem PEG przy 80 kV i powiększeniu 150,000X, z naniesioną skalą. Po prawej: Histogram wielkości nanocząsteczek pomierzonych metodą DLS przed (AuNP) i po (PEG-AuNP) zastąpieniu THPC przez PEG. Wyniki DLS dla AuNP powlekanych THPC ilościowo potwierdzają obraz z TEM. Wyniki DLS dla AuNP powlekanych PEG rozwiązują problem braku możliwości wizualizacji PEG za pomocą TEM, ponieważ polimery nie są gęste elektronowo. Obraz TEM PEG-AuNP pokaże jedynie złote rdzenie nanocząsteczek i będzie wyglądał tak samo jak AuNP z otoczką THPC. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres emisji fluorescencji; sygnał w funkcji długości fali, analiza spektralna w badaniach optycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Dane fluorescencyjne fluorescencyjnych PEG-AuNP. the piki fluorescencji przy 667 nm odpowiada emisji fluoroforu sprzężonego z PEG-AuNP. A.U.: jednostki umowne.
<img alt="Wykres żywotności komórek w zależności od stężeń PEG-AuNP oraz obraz z fluorescencyjnego mikroskopu próbek tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Interakcje komórek z fluorescencyjnymi PEG-AuNP. (A) Wykres żywotności komórek (metabolizm MTS) dla komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura po 16 h koinkubacji z fluorescencyjnymi PEG-AuNP. (B) Konfokalne obrazy przekroju utrwalonych komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura, barwionych DAPI na jądra (niebieski) oraz przeciwciałem przeciwko siarczanowi heparanu, składnikowi glikokaliksu (zielony). Górny obraz przedstawia zdrowy glikokaliks, a dolny zdegradowaną warstwę glikokaliksu; w próbce ze zdegradowanym glikokaliksem widoczna jest znacznie silniejsza czerwona fluorescencja nanocząstek. Pasek skali wynosi 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Ogólnym celem tej procedury jest synteza funkcjonalizowanych, pokrytych polimerem nanosfer złota o średnicy 10 nanometrów, biokompatybilnych, o wydłużonym czasie krążenia i możliwych do zobrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kardiologii dotyczące przepuszczalności śródbłonka w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzy biokompatybilne ultramałe cząstki, które mają grupy funkcyjne dostępne do dalszego dostosowywania.Najpierw w mikroprobówce wirówkowej rozcieńczyć 12 mikrolitrów 80% THPC jednym mililitrem ultra czystej wody. Zacisnąć 100-mililitrową kolbę okrągłodenną na magnetycznej płytce mieszającej. Dodaj do kolby 45 mililitrów wody i mały mieszadło w kształcie jajka.Zacznij mieszać wodę z prędkością 300 obr./min. Dodać do kolby 0,5 mililitra jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu i jeden mililitr rozcieńczonego roztworu THPC. Kontynuuj energiczne mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez pięć minut.Następnie dodaj dwa mililitry 25-milimolowego roztworu kwasu chloroaurowego do mieszaniny reakcyjnej, mieszając. Upewnij się, że żółta mieszanina reakcyjna staje się ciemnobrązowa w ciągu kilku sekund, co wskazuje na tworzenie się pokrytych THPC, ujemnie naładowanych nanocząstek złota. Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 15 minut.Podczas mieszania mieszaniny przygotuj wodny roztwór heterobifunkcyjnej aminy PEG tiolu, karboksymetylo-tiolu PEG i monofunkcyjnego tiolu metoksy PEG. Gdy mieszanina reakcyjna nanocząstek złota będzie mieszać przez 15 minut, zmniejsz prędkość mieszania do 100 obr./min. Dodaj roztwory PEG kroplami do mieszanki, mieszając.Kontynuuj delikatne mieszanie mieszaniny przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zamknij jeden koniec membrany celulozowej MWCO o mocy 12-14 kilodaltonów za pomocą klipsa do dializy. Za pomocą pipety przenieś mieszaninę reakcyjną na membranę.Zamknij drugi koniec błony drugim klipsem do dializy. Dializuj mieszaninę nanocząstek w czterech litrach wody mieszanej z prędkością 60 obr./min przez 72 godziny. Zmieniaj wodę co dwie godziny przez pierwsze sześć godzin, a następnie co sześć do 12 godzin.Następnie przefiltruj częściowo oczyszczoną mieszaninę pegylowanych nanocząstek złota przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Zamrozić oczyszczony roztwór nanocząstek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na około pięć godzin. Liofilizuj oczyszczone nanocząstki za pomocą liofilizatora.Aby rozpocząć przygotowywanie fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek złota, zaciśnij 100-mililitrową kolbę z okrągłym dnem na magnetycznej płytce mieszającej. Dodaj 18 mililitrów ultra czystej wody i mały mieszadło w kształcie jajka do kolby i zacznij mieszać z prędkością 100 obr./min. W stożkowej tubie o pojemności czterech mililitrów połącz dwa miligramy liofilizowanych pegylowanych nanocząstek złota z dwoma mililitrami wody.Następnie przenieść roztwór nanocząstek do kolby okrągłodennej w celu dalszej rozpuszczenia. Dodaj jeden mililitr buforu węglanowego o pH 8,8, 0,1 molowym do odtworzonych nanocząstek, mieszając. Następnie dodać pięć mikrolitrów 10 miligramów na mililitr roztworu fluorescencyjnego estru anhydroksysukcynimidu w dimetylosulfotlenku.Owinąć kolbę folią, aby całkowicie wykluczyć światło. Kontynuuj mieszanie mieszaniny fluorescencyjnych nanocząstek przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie dializuje mieszaninę w czterech litrach wody przez 72 godziny, stosując procedurę opisaną w przygotowaniu pegylowanych nanocząstek złota.Przechowywać pojemnik przykryty folią przez cały czas trwania dializy. Odłóż na bok jeden mililitr oczyszczonych fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek w celu scharakteryzowania. Pozostałe nanocząstki fluorescencyjne należy zamrozić, liofilizować i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby uwidocznić rdzeń nanocząstki złota za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, najpierw umieść 10 mikrolitrów oczyszczonego roztworu nanocząstek fluorescencyjnych na siatce TEM pokrytej węglem. Pozostaw kroplę na pięć minut. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie usunąć nadmiar płynu z krawędzi siatki TEM, aż na siatce pozostanie tylko warstwa fluorescencyjnych nanocząstek.Wyobraź sobie nanocząstki o napięciu 80 kilowoltów, w powiększeniu od 50 000 do 150 000. Aby zmierzyć hydrodynamiczny rozmiar nanocząstek, umieść jeden miligram liofilizowanych nanocząstek złota pokrytych THPC w mikroprobówce wirówkowej. Dodaj jeden mililitr wody do każdej probówki i przenieś roztwory do jednomililitrowych przezroczystych plastikowych kuwet.Oceń każde rozwiązanie za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i zmierz sferyczne średnice hydrodynamiczne cząstek. Następnie przenieś kuwetę zawierającą fluorescencyjne pegylowane nanocząstki złota do spektrofluorometru. Ustaw długość fali egzotki na 633 nanometry i odczytaj sygnały emisyjne od 650 do 800 nanometrów.Następnie, aby ocenić biokompatybilność przy stężeniach 7 nanocząstek, najpierw pipetuj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura w DMEM do każdego z 21 dołków 96-dołkowej płytki poddanej działaniu sterylnej hodowli tkankowej z przezroczystym dnem. Inkubuj komórki aż do osiągnięcia konfluencji, a następnie uzyskaj siedem roztworów fluorescencyjnych nanocząstek w DMEM o stężeniach od zera do 1000 mikrogramów na mililitr. Odessać DMEM ze studzienek.Umieścić 100 mikrolitrów każdego z siedmiu roztworów nanocząstek w każdym z oddzielnych studzienek w trzech egzemplarzach. Pozwól komórkom i nanocząstkom na wspólną inkubację przez 16 godzin. Następnie odessać DMEM i zawieszone lub luźno przyczepione nanocząstki ze studzienek.Dodać 100 mikrolitrów świeżego DMEM zawierającego 20 mikrolitrów roztworu MTS / PES do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie oceń żywotność komórek za pomocą analizy chlorometrycznej przy 492 nanometrach za pomocą czytnika płytek.Następnie wysiewaj komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura na sterylnej szklanej pokrywie o pojemności 12 mililitrów, która ślizga się przy 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. Nakarm komórki DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną streptomycyną. Inkubuj komórki, aż do osiągnięcia pełnej zbieżności.W razie potrzeby zmodyfikuj glikokaliksa śródbłonka, a następnie inkubuj komórki z 550 mikrogramami na mililitr fluorescencyjnych nanocząstek złota przez 16 godzin. Przygotuj komórki do mikroskopii immunofluorescencyjnej. Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI.Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Zobrazuj komórki śródbłonka barwione immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizuj jądra, glikokaliks siarczanu heparyny i nanocząstki z odpowiednio niebieskimi, zielonymi i dalekimi czerwonymi kanałami.TEM nanocząstek złota pokrytych THPC wykazał średnicę cząstek od dwóch do trzech nanometrów. TEM pegylowanych nanocząstek mógł jedynie potwierdzić obecność cząstek zdyspergowanych, ponieważ PEG nie jest widoczny na obrazach TEM. DLS nanocząstek pokrytych i pegylowanych THPC wykazało przesunięcie szczytowej średnicy cząstek z 2,5 nanometra do 10,5 nanometra.Emisja fluorescencyjna miała maksimum od 660 do 672 nanometrów po wzbudzeniu światłem o długości 633 nanometrów, co było zgodne z oczekiwaną maksymalną emisją na poziomie 665 nanometrów dla zastosowanej sondy fluorescencyjnej. Komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura wykazywały podobny poziom żywotności po 16 godzinach wspólnej inkubacji z fluorescencyjnymi pegolicznymi nanocząstkami złota w stężeniach do jednego miligrama na mililitr, co wskazuje na brak znaczącej toksyczności nanocząstek. Zaobserwowano minimalny wychwyt nanocząstek w komórkach śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura ze zdrowymi glikokaliksami.Znacznie większy wychwyt nastąpił w komórkach ze zdegradowanymi glikokaliksami, o czym świadczy wzrost sygnałów czerwonej fluorescencji z nanocząstek. Po tej procedurze można przeprowadzić dalsze modyfikacje, takie jak koniugacja z otwartymi grupami funkcyjnymi, w celu modyfikacji cząstek w celu specyficznego ukierunkowania na składnik śródbłonka lub dostarczenia leku.

synthesis-functionalized-10-nm-polymer-coated-gold-particles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Nanorurki złota o kontrolowanych wymiarach mogą być syntetyzowane przez elektrochemiczne osadzanie w porowatych membranach z anodowego tlenku glinu (AAO) przy użyciu hydrofobowego rdzenia polimerowego. Złote nanorurki i matryce nanorurek są obiecujące pod kątem zastosowań w biodetekcji plazmonicznej, spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo, ogrzewaniu fototermicznym, transporcie jonowym i molekularnym, mikrofluidyce, katalizie i wykrywaniu elektrochemicznym.

Ukierunkowana synteza matrycowa plazmonicznych nanorurek złota z przestrajalną absorbancją IR

Pokazujemy przygotowanie i zajmujemy się wykonalnością nośników komórkowych zawierających złote nanopręty do fotoakustycznego obrazowania raka.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Przeprowadzana jest synteza jednolitych nanocząstek złota pokrytych półprzewodnikowymi powłokami CdS lub ZnS. Powłoka półprzewodnikowa jest przeprowadzana przez pierwsze osadzenie powłoki siarczku srebra i wymianę kationów srebra na kationy lub kadmu.

Synteza, charakterystyka i funkcjonalizacja hybrydowych nanocząstek rdzenia/powłoki Au/CdS i Au/ZnS

Opisujemy prostą metodę wytwarzania wysoce stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota poprzez redukcję kwasu chloroaurowego (HAuCl4) tiocyjanianem sodu (NaSCN). Oligoklastry mają wąski rozkład wielkości i mogą być produkowane w szerokim zakresie rozmiarów i powłok powierzchniowych.

Prosta metoda kontrolowanej wielkości syntezy stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota w warunkach otoczenia

Ten protokół opisuje prostą metodę przygotowania zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło z dostępnymi na rynku materiałami. Pokazuje również, jak zmierzyć proces kawitacji mikropęcherzyków zsyntetyzowanych liposomów po leczeniu laserem impulsowym.

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

Amfifilowe nanocząstki złota mogą być używane w wielu zastosowaniach biologicznych. Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota pokrytych binarną mieszaniną ligandów oraz szczegółową charakterystykę tych cząstek.

Synteza i charakterystyka amfifilowych nanocząstek złota

Opisana jest niezawodna i łatwo odtwarzalna metoda przygotowania funkcjonalnych, emitujących światło podczerwone fotoluminescencyjnych nanoklastrów złota i ich bezpośredniego wykrywania wewnątrz komórek HeLa za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Synteza nanoklastrów złota emitujących promieniowanie bliskiej podczerwieni do zastosowań biologicznych

W tym protokole, nanocząstki złota modyfikowane doksorubicyną AS1411-g-PEI-g-PEG są syntetyzowane w trzyetapowych reakcjach amidowych. Następnie doksorubicyna jest ładowana i dostarczana do docelowych komórek rakowych w celu terapii przeciwnowotworowej.

Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota o średnicy ~12 nm (nanocząstek Au) w rozpuszczalniku organicznym. Nanocząstki złota są pokryte ligandami oleiloaminy, aby zapobiec aglomeracji. Nanocząstki złota są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen.

Synteza nanocząstek złota

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Poznaj metodę syntezy funkcjonalizowanych nanocząstek złota pokrytych polimerem PEG o średnicy 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków w zastosowaniach kardiologicznych.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Przeglądaj więcej filmów