Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Ogólnym celem tej procedury jest synteza funkcjonalizowanych, pokrytych polimerem nanosfer złota o średnicy 10 nanometrów, biokompatybilnych, o wydłużonym czasie krążenia i możliwych do zobrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kardiologii dotyczące przepuszczalności śródbłonka w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzy biokompatybilne ultramałe cząstki, które mają grupy funkcyjne dostępne do dalszego dostosowywania.

Najpierw w mikroprobówce wirówkowej rozcieńczyć 12 mikrolitrów 80% THPC jednym mililitrem ultra czystej wody. Zacisnąć 100-mililitrową kolbę okrągłodenną na magnetycznej płytce mieszającej. Dodaj do kolby 45 mililitrów wody i mały mieszadło w kształcie jajka.

Zacznij mieszać wodę z prędkością 300 obr./min. Dodać do kolby 0,5 mililitra jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu i jeden mililitr rozcieńczonego roztworu THPC. Kontynuuj energiczne mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez pięć minut.

Następnie dodaj dwa mililitry 25-milimolowego roztworu kwasu chloroaurowego do mieszaniny reakcyjnej, mieszając. Upewnij się, że żółta mieszanina reakcyjna staje się ciemnobrązowa w ciągu kilku sekund, co wskazuje na tworzenie się pokrytych THPC, ujemnie naładowanych nanocząstek złota. Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 15 minut.

Podczas mieszania mieszaniny przygotuj wodny roztwór heterobifunkcyjnej aminy PEG tiolu, karboksymetylo-tiolu PEG i monofunkcyjnego tiolu metoksy PEG. Gdy mieszanina reakcyjna nanocząstek złota będzie mieszać przez 15 minut, zmniejsz prędkość mieszania do 100 obr./min. Dodaj roztwory PEG kroplami do mieszanki, mieszając.

Kontynuuj delikatne mieszanie mieszaniny przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zamknij jeden koniec membrany celulozowej MWCO o mocy 12-14 kilodaltonów za pomocą klipsa do dializy. Za pomocą pipety przenieś mieszaninę reakcyjną na membranę.

Zamknij drugi koniec błony drugim klipsem do dializy. Dializuj mieszaninę nanocząstek w czterech litrach wody mieszanej z prędkością 60 obr./min przez 72 godziny. Zmieniaj wodę co dwie godziny przez pierwsze sześć godzin, a następnie co sześć do 12 godzin.

Następnie przefiltruj częściowo oczyszczoną mieszaninę pegylowanych nanocząstek złota przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Zamrozić oczyszczony roztwór nanocząstek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na około pięć godzin. Liofilizuj oczyszczone nanocząstki za pomocą liofilizatora.

Aby rozpocząć przygotowywanie fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek złota, zaciśnij 100-mililitrową kolbę z okrągłym dnem na magnetycznej płytce mieszającej. Dodaj 18 mililitrów ultra czystej wody i mały mieszadło w kształcie jajka do kolby i zacznij mieszać z prędkością 100 obr./min. W stożkowej tubie o pojemności czterech mililitrów połącz dwa miligramy liofilizowanych pegylowanych nanocząstek złota z dwoma mililitrami wody.

Następnie przenieść roztwór nanocząstek do kolby okrągłodennej w celu dalszej rozpuszczenia. Dodaj jeden mililitr buforu węglanowego o pH 8,8, 0,1 molowym do odtworzonych nanocząstek, mieszając. Następnie dodać pięć mikrolitrów 10 miligramów na mililitr roztworu fluorescencyjnego estru anhydroksysukcynimidu w dimetylosulfotlenku.

Owinąć kolbę folią, aby całkowicie wykluczyć światło. Kontynuuj mieszanie mieszaniny fluorescencyjnych nanocząstek przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie dializuje mieszaninę w czterech litrach wody przez 72 godziny, stosując procedurę opisaną w przygotowaniu pegylowanych nanocząstek złota.

Przechowywać pojemnik przykryty folią przez cały czas trwania dializy. Odłóż na bok jeden mililitr oczyszczonych fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek w celu scharakteryzowania. Pozostałe nanocząstki fluorescencyjne należy zamrozić, liofilizować i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby uwidocznić rdzeń nanocząstki złota za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, najpierw umieść 10 mikrolitrów oczyszczonego roztworu nanocząstek fluorescencyjnych na siatce TEM pokrytej węglem. Pozostaw kroplę na pięć minut. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie usunąć nadmiar płynu z krawędzi siatki TEM, aż na siatce pozostanie tylko warstwa fluorescencyjnych nanocząstek.

Wyobraź sobie nanocząstki o napięciu 80 kilowoltów, w powiększeniu od 50 000 do 150 000. Aby zmierzyć hydrodynamiczny rozmiar nanocząstek, umieść jeden miligram liofilizowanych nanocząstek złota pokrytych THPC w mikroprobówce wirówkowej. Dodaj jeden mililitr wody do każdej probówki i przenieś roztwory do jednomililitrowych przezroczystych plastikowych kuwet.

Oceń każde rozwiązanie za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i zmierz sferyczne średnice hydrodynamiczne cząstek. Następnie przenieś kuwetę zawierającą fluorescencyjne pegylowane nanocząstki złota do spektrofluorometru. Ustaw długość fali egzotki na 633 nanometry i odczytaj sygnały emisyjne od 650 do 800 nanometrów.

Następnie, aby ocenić biokompatybilność przy stężeniach 7 nanocząstek, najpierw pipetuj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura w DMEM do każdego z 21 dołków 96-dołkowej płytki poddanej działaniu sterylnej hodowli tkankowej z przezroczystym dnem. Inkubuj komórki aż do osiągnięcia konfluencji, a następnie uzyskaj siedem roztworów fluorescencyjnych nanocząstek w DMEM o stężeniach od zera do 1000 mikrogramów na mililitr. Odessać DMEM ze studzienek.

Umieścić 100 mikrolitrów każdego z siedmiu roztworów nanocząstek w każdym z oddzielnych studzienek w trzech egzemplarzach. Pozwól komórkom i nanocząstkom na wspólną inkubację przez 16 godzin. Następnie odessać DMEM i zawieszone lub luźno przyczepione nanocząstki ze studzienek.

Dodać 100 mikrolitrów świeżego DMEM zawierającego 20 mikrolitrów roztworu MTS / PES do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie oceń żywotność komórek za pomocą analizy chlorometrycznej przy 492 nanometrach za pomocą czytnika płytek.

Następnie wysiewaj komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura na sterylnej szklanej pokrywie o pojemności 12 mililitrów, która ślizga się przy 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. Nakarm komórki DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną streptomycyną. Inkubuj komórki, aż do osiągnięcia pełnej zbieżności.

W razie potrzeby zmodyfikuj glikokaliksa śródbłonka, a następnie inkubuj komórki z 550 mikrogramami na mililitr fluorescencyjnych nanocząstek złota przez 16 godzin. Przygotuj komórki do mikroskopii immunofluorescencyjnej. Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Zobrazuj komórki śródbłonka barwione immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizuj jądra, glikokaliks siarczanu heparyny i nanocząstki z odpowiednio niebieskimi, zielonymi i dalekimi czerwonymi kanałami.

TEM nanocząstek złota pokrytych THPC wykazał średnicę cząstek od dwóch do trzech nanometrów. TEM pegylowanych nanocząstek mógł jedynie potwierdzić obecność cząstek zdyspergowanych, ponieważ PEG nie jest widoczny na obrazach TEM. DLS nanocząstek pokrytych i pegylowanych THPC wykazało przesunięcie szczytowej średnicy cząstek z 2,5 nanometra do 10,5 nanometra.

Emisja fluorescencyjna miała maksimum od 660 do 672 nanometrów po wzbudzeniu światłem o długości 633 nanometrów, co było zgodne z oczekiwaną maksymalną emisją na poziomie 665 nanometrów dla zastosowanej sondy fluorescencyjnej. Komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura wykazywały podobny poziom żywotności po 16 godzinach wspólnej inkubacji z fluorescencyjnymi pegolicznymi nanocząstkami złota w stężeniach do jednego miligrama na mililitr, co wskazuje na brak znaczącej toksyczności nanocząstek. Zaobserwowano minimalny wychwyt nanocząstek w komórkach śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura ze zdrowymi glikokaliksami.

Znacznie większy wychwyt nastąpił w komórkach ze zdegradowanymi glikokaliksami, o czym świadczy wzrost sygnałów czerwonej fluorescencji z nanocząstek. Po tej procedurze można przeprowadzić dalsze modyfikacje, takie jak koniugacja z otwartymi grupami funkcyjnymi, w celu modyfikacji cząstek w celu specyficznego ukierunkowania na składnik śródbłonka lub dostarczenia leku.