Name: Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Naucz się ilościowego testu igłowego do miareczkowania AAV i oceny roli białek AAP w składaniu kapsydów. Ta prosta metoda pozwala badać biologię adenowirusów związanych z adenowirusem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Xiao Xiao z Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill za dostarczenie nam plazmidu pEMBL-CMV-GFP. Dziękujemy Christopherowi Chengowi i Samuelowi J. Huangowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty Publicznej Służby Zdrowia (NIH R01 NS088399 i T32 EY232113).

<ol><li>Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+assembly+factor+promotes+AAV2+capsid+formation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).</li>
<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
<li>NEB, <a target="_blank" href="http://www.neb-online.de/neuerkatalog/">2017-2018 Catalog & Technical Reference</a>. , New England Biolabs. 302-368 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Addgene. Bacterial Transformation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/">https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/</a> (2017).</li>
<li>Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/">https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/</a> (2017).</li>
<li>Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf</a> (2017).</li>
<li>Burton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+factor+VIII+heavy+and+light+chain+adeno-associated+viral+vectors+produces+biologically+active+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).</li>
<li>Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+for+short+hairpin+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression.</a> Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).</li>
<li>Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+preparation+of+adeno-associated+viral+vectors+by+using+high+hydrostatic+pressure+to+selectively+inactivate+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus.</a> Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Comparison+and+Validation+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Methods+for+the+Quantitation+of+Adeno-Associated+Viral+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).</li>
<li>Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleic+acid+sequence+homologies+and+relative+concentrations+by+a+dot+hybridization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).</li>
<li>Reue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+quantitation+techniques%3A+considerations+for+experimental+design+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application.</a> J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).</li>
<li>Clementi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+and+RT-PCR+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR and RT-PCR in virology.</a> PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).</li>
<li>Mezzina, M., Merten, O. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21590399">Adeno-associated viruses.</a> Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).</li>
<li>Chen, W. J., Liao, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bovine+pancreatic+deoxyribonuclease+I%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I.</a> Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie opisano przydatność ilościowych testów punktowych do badania AAV AAP i ich roli w składaniu kapsydu. Wiedza uzyskana z tych badań może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wrodzonych różnic w procesie składania kapsydu AAV oraz funkcjonalnej roli AAP między różnymi serotypami. W związku z tym test punktowy z komplementacją krzyżową AAV VP3-AAP ujawnił, że Snake AAV VP3 wykazywał ścisłą zależność od koekspresji pokrewnego AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydu h...

Wirus związany z adenowirusem (AAV) to mały, bezotoczkowy, jednoniciowy wirus DNA o genomie około 4,7 kilozasad (kb). Genom AAV zawiera otwarte ramki odczytu (ORF) dla genów rep i cap. W 2010 roku Sonntag i wsp. odkryli wcześniej niezidentyfikowane niestrukturalne białko kodowane przez ORF z przesunięciem ramki +1 w genie kapu AAV2 i stwierdzili, że odgrywa kluczową rolę w składaniu białek monomeru AAV2 kapsydu VP w wirusowy kapsyd class1. To nowe białko zostało nazwane białkiem aktywującym montaż (AAP) ze względu na rolę, jaką odgrywa w promowaniu składania kapsydu1.
ORFy dla AAP zostały zidentyfikowane bioinformatycznie w genomach wszystkich parwowirusów z rodzaju Dependoparvovirus, ale nie w genomach wirusów różnych rodzajów z rodziny parwowirusów1,2. Badania funkcjonalne tego nowego białka początkowo koncentrowały się na AAP z prototypu AAV2 (AAP2), który ustalił istotną rolę AAP2 w kierowaniu niezmontowanych białek VP do jąderka w celu ich akumulacji i tworzenia w pełni złożone kapsydy1,3,4. Niezdolność kapsydów AAV2 do złożenia się przy braku wyrażenia AAP została niezależnie potwierdzona przez wiele grup, w tym naszą1,2,3,4,5. Późniejsze badania nad serotypami AAV 1, 8 i 9 potwierdziły krytyczną rolę AAP w składaniu kapsydu, ponieważ białka monomeru VP3 AAV1, 8 i 9 nie były w stanie utworzyć w pełni złożonego kapsydu przy braku koekspresji AAP2.
Niedawno, dzięki podejściu, które obejmuje użycie ilościowych testów punktowych, zbadaliśmy zdolność monomerów AAV1 do 12 VP3 do łączenia się w kapsydy przy braku ekspresji AAP oraz zdolność AAP1 do 12 do promowania składania monomerów VP3 z heterologicznych serotypów. Badanie to wykazało, że monomery AAV4, 5 i 11 VP3 mogą składać się bez AAP. Ponadto stwierdzono, że osiem z dwunastu badanych przez nas serotypów AAP (tj. wszystkie oprócz AAP4, 5, 11 i 12) wykazywało szeroką zdolność do wspierania składania kapsydów heterologicznych serotypów AAV, podczas gdy AAP4, 5, 11 i 12 wykazywały znacznie ograniczoną zdolność w tym zakresie6. Te cztery serotypy są filogenetycznie odległe od pozostałych serotypów AAP2,3. Co więcej, badanie ujawniło znaczną heterogeniczność w subkomórkowych lokalizacjach różnych AAPs6. Co więcej, badanie sugeruje, że ścisły związek AAP ze złożonymi kapsydami i jąderkiem, cechą charakterystyczną składania kapsydu AAV2, niekoniecznie może być rozszerzony na inne serotypy, w tym AAV5, 8 i 9, które wykazują wykluczenie jąderkowe złożonych kapsydów6. W związku z tym informacje uzyskane z badania konkretnego serotypu AAP nie mają szerokiego zastosowania do całej biologii AAP. Tak zagadkowa natura biologii AAP podkreśla potrzebę zbadania roli i funkcji każdego AAP zarówno z kanonicznych, jak i niekanonicznych serotypów AAV.
Biologiczna rola AAP w tworzeniu kapsydu może być oceniona poprzez określenie w pełni upakowanych mian cząsteczek wirusa AAV wytwarzanych w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293, najczęściej używanej linii komórkowej do produkcji wektora AAV, z ekspresją białka AAP lub bez niej. Standardowymi metodami ilościowego oznaczania AAV są ilościowe testy oparte na PCR (qPCR)7,8 oraz ilościowe testy oparte na plamach punktowych9. Inne metody oznaczania ilościowego cząstek wirusa AAV, takie jak test immunoenzymatyczny 10,11 lub pomiar gęstości optycznej12 nie są idealne dla próbek pochodzących z wielu różnych serotypów AAV lub próbek zanieczyszczonych zanieczyszczeniami (surowe lizaty lub pożywki hodowlane), które często są próbkami wykorzystywanymi do badań AAV. Obecnie qPCR jest najczęściej stosowany do oznaczania ilościowego AAV; należy jednak wziąć pod uwagę potencjalne zastrzeżenia dotyczące testu opartego na qPCR, ponieważ test może skutkować błędami systemowymi i znacznymi zmianami miana13,14. Na testy oparte na PCR ma wpływ szereg potencjalnie mylących czynników, takich jak obecność kowalencyjnie zamkniętych końcowych spinek do włosów w matrycach PCR, które hamują amplifikację13. Nawet doświadczona osoba może nieświadomie wprowadzić potencjalne czynniki zakłócające do testu opartego na qPCR13. Natomiast ilościowe testy punktowe są klasyczną techniką biologii molekularnej, która nie obejmuje amplifikacji genomu i wykorzystuje znacznie prostszą zasadę przy minimalnym ryzyku błędów w porównaniu z testami opartymi na qPCR. Metoda jest mniej wymagająca technicznie; W związku z tym wyniki testów są w miarę powtarzalne nawet dla niedoświadczonych osób.
W tym raporcie opisujemy szczegóły metodologiczne ilościowego testu punktowego, którego rutynowo używamy do ilościowego oznaczania wektorów AAV, i podajemy przykład, jak zastosować test do badania promującej składanie roli AAP w popularnych serotypach (AAV5 i AAV9) oraz wcześniej niescharakteryzowanego AAP z Snake AAV14. W naturze białka AAV VP i białka AAP ulegają ekspresji w cis z pojedynczego genu (tj. Cis komplementacji VP-AAP), podczas gdy w opisanym tutaj teście białka VP i AAP są dostarczane w trans z dwóch oddzielnych plazmidów (tj. Transkomplementacja VP-AAP). Ponieważ każde białko VP lub AAP z różnych serotypów może ulegać ekspresji z każdego niezależnego plazmidu, możliwe staje się testowanie heterologicznych kombinacji VP-AAP pod kątem składania kapsydu (tj. komplementacji krzyżowej VP-AAP). Krótko mówiąc, AAV VP3 z różnych serotypów ulega ekspresji w komórkach HEK 293 przez transfekcję plazmidowego DNA w celu upakowania genomu wektora AAV w obecności lub braku pokrewnego serotypu AAP lub w obecności heterologicznego serotypu AAP. Po wyprodukowaniu pożywki hodowlane i lizaty komórkowe są poddawane testowi punktowemu w celu ilościowego określenia genomu wirusa w otoczce kapsydu. Pierwszym krokiem testu dot blot jest potraktowanie próbek nukleazą w celu usunięcia zanieczyszczających plazmidowych DNA i nieopakowanych genomów AAV w próbkach. Niezastosowanie się do tego spowodowałoby nasilenie sygnałów tła, w szczególności w przypadku oznaczania próbek nieoczyszczonych. Następnie stosuje się leczenie proteazą w celu rozbicia kapsydów wirusa i uwolnienia odpornych na nukleazy genomów wirusowych do roztworów próbek. Następnie genomy wirusów są denaturowane, osuszane na błonie i hybrydyzowane z sondą DNA specyficzną dla genomu wirusa w celu oceny ilościowej. W przedstawionym tutaj przykładowym teście pokazujemy, że Snake AAV VP3 wymaga Snake AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydów AAV9, w przeciwieństwie do wielu AAP pochodzących z serotypów zależnych od AAP, które mogą również promować składanie heterologicznych kapsydów serotypowych. Na koniec zgłaszamy ważne zastrzeżenie dotyczące testów ilościowych AAV opartych na qPCR lub dot blot, że wybór nukleazy znacząco wpływa na wyniki testu.

<table><tbody><tr><td>Benzonaza</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>określana jako endonukleaza Serratia marcescen w tekście głównym.</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>określana w tekście głównym jako enzym A DNazy I.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>określany w tekście głównym jako DNase I Enzym B.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>Określany jako DNase I Enzym C w tekście głównym.</td></tr><tr><td>1,5 ml Dołączone rurki do mikrowirówek z o-ringiem</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 m octan sodu</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Komórki AAV-293</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>linia komórkowa HEK-293 zoptymalizowana pod kątem pakowania wirionów AAV.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M roztwór EDTA</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Bio-Dot</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Służy do ilościowych plam punktowych na oczyszczonym wirusie. Używamy tylko połowy objętości wszystkich odczynników w każdym kroku zalecanym dla Schematu Protokołu 2 w instrukcji dostarczonej przez producenta.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-wysoki poziom glukozy (4,5 g / L)</td> <td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>określana jako polisacharoza 400.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Śledzie Plemniki DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do hybrydyzacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator MicroPulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini szybkie obracające się kolumny DNA</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta ekspozycyjna do fosforowania</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>ekrany fosforowania</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>zestawy plazmidowe Maxi</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa polimeraza DNA Pfx</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>MiliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Zestaw do losowego etykietowania starterów</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 nukleotydy z 4. nukleotydu w AAP ORF, RE1 jest miejscem enzymu restrykcyjnego do klonowania): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 to miejsce enzymu restrykcyjnego do klonowania): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeNiestandardowy</td><td>podkład</td><td></td></tr> <tr><td>SigmaStarter VP3 Forward (N25 pierwsze 25 nukleotydów VP3 ORF, RE1 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer Primer</td><td></td></tr><tr><td>VP3 Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Niestandardowy starter</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K Roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>plemniki łososia DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>miliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polimeraza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka poddana działaniu hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Nasączony fenolem</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr> UV <tr><td>Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Stosowany jest optymalny tryb sieciowania, zapewniający dawkę energii UV 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>Membrana Zeta-Probe</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy test igłowy do miareczkowania aav i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Chociaż wirus związany z adenowirusem (AAV) jest powszechnie akceptowany jako atrakcyjny wektor dla terapii genowej, służy również jako wirus modelowy do zrozumienia biologii wirusa. W tym ostatnim aspekcie niedawne odkrycie niestrukturalnego białka AAV, określanego mianem białka aktywującego składanie (AAP), rzuciło nowe światło na procesy związane z składaniem białek VP kapsydu wirusa w kapsyd. Chociaż wiele serotypów AAV wymaga AAP do montażu, niedawno informowaliśmy, że AAV4, 5 i 11 są wyjątkami od tej reguły. Ponadto wykazaliśmy, że AAP i złożone kapsydy różnych serotypów lokalizują się w różnych przedziałach subkomórkowych. Ta nieoczekiwana heterogeniczność właściwości biologicznych i funkcjonalnych ról AAP wśród różnych serotypów AAV podkreśla znaczenie badań nad AAP pochodzącymi z różnych serotypów. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje prosty test punktowy do oznaczania ilościowego AAV i jego zastosowanie do oceny zależności od AAP i swoistości serotypu w składaniu kapsydu. Aby zademonstrować użyteczność tego testu dot blot, postanowiliśmy scharakteryzować składanie kapsydu i zależność od AAP Snake AAV, wcześniej niescharakteryzowanego AAV, a także AAV5 i AAV9, które wcześniej wykazano, że są odpowiednio serotypami niezależnymi od AAP i zależnymi od AAP. Test wykazał, że montaż kapsydu Snake AAV wymaga Snake AAP i nie może być promowany przez AAP z AAV5 i AAV9. Test wykazał również, że w przeciwieństwie do wielu powszechnych serotypów AAP, które promują heterologiczne składanie kapsydu przez komplementację krzyżową, Snake AAP nie sprzyja składaniu kapsydów AAV9. Ponadto pokazujemy, że wybór nukleazy znacząco wpływa na odczyt testu dot blot, a zatem wybór optymalnego enzymu ma kluczowe znaczenie dla skutecznej oceny miana AAV.

Reprezentatywny wynik ilościowych analiz dot blot służących do oznaczania stężenia oczyszczonych zapasów wektora AAV wytworzonych na dużą skalę przedstawiono na Rysunku 1. Za pomocą tej metody dot blot określono miano zapasu dwuniciowego wektora AAV2G9-CMV-GFP. Wektor oczyszczono za pomocą dwóch rund ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu (CsCl), a następnie poddano dializie zgodnie z wcześniejszym opisem20. Generalnie, w pr...

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Metoda ta może określić zarówno oczyszczone, jak i nieoczyszczone miana AV vac i ocenić zdolność AAV AAP do promowania składania pokrewnych i heterologicznych kapsis serotypów AV. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, niedroga metoda, która pozwala uniknąć wad innych metod miareczkowania AAV. Chociaż metoda ta jest powszechnie stosowana do ilościowego oznaczania wektorów AAV, może być również stosowana do rozwiązywania różnych podstawowych pytań dotyczących biologii AAV, jak pokazano w tym protokole.W dniu zero, po wyhodowaniu komórek HEK 293 do 90% konfluencji, przygotuj odczynnik do transfekcji, mieszając plazmidy w 96 mikrolitrach PBS bez wapnia lub magnezu w sterylnych 1,5 mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Jak wskazano w tej tabeli, całkowita ilość DNA wynosi dwa mikrogramy na studzienkę. Dodaj cztery mikrolitry roztworu PEI do mieszanki plazmidowego DNA PBS.Ostateczna objętość wynosi około 100 mikrolitrów lub 5% objętości pożywki hodowlanej. Krótko zawirować probówki i inkubować mieszaninę DNA PEI w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji krótko zakręć probówkami w mikrowirówce, aby zebrać płyn na dno.I dodawać mieszaninę DNA PEI kroplami

a-quantitative-dot-blot-assay-for-aav-titration-its-use-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy test kolorymetryczny in vitro do wykrywania obecności przeciwciał neutralizujących przeciwko wektorom rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 6 (rAAV6) w próbkach surowicy owczej. Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym ludzki gen fosfatazy alkalicznej łożyska a jego substratem w celu wytworzenia nierozpuszczalnego fioletowego produktu.

Test przeciwciał neutralizujących AAV na bazie komórek: technika kolorymetryczna do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko specyficznym wirusom związanym z adenowirusami w surowicy

W tym filmie opisujemy test dot blot w celu ilościowego określenia genomu wirusa. Intensywność sygnału jest bezpośrednio związana z ilością wirusowego DNA w próbce.

Test Dot Blot w celu ilościowego określenia genomu wirusa

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny jest nowym testem służącym do oceny umiejętności chodzenia oraz pomiaru precyzji stawiania kończyn przednich i tylnych, kroku oraz koordynacji między конечноściami.

Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny: system punktacji i jego praktyczne zastosowanie.

Naucz się ilościowego testu igłowego do miareczkowania AAV i oceny roli białek AAP w składaniu kapsydów. Ta prosta metoda pozwala badać biologię adenowirusów związanych z adenowirusem.

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów