Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

Metoda ta może określić zarówno oczyszczone, jak i nieoczyszczone miana AV vac i ocenić zdolność AAV AAP do promowania składania pokrewnych i heterologicznych kapsis serotypów AV. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, niedroga metoda, która pozwala uniknąć wad innych metod miareczkowania AAV. Chociaż metoda ta jest powszechnie stosowana do ilościowego oznaczania wektorów AAV, może być również stosowana do rozwiązywania różnych podstawowych pytań dotyczących biologii AAV, jak pokazano w tym protokole.

W dniu zero, po wyhodowaniu komórek HEK 293 do 90% konfluencji, przygotuj odczynnik do transfekcji, mieszając plazmidy w 96 mikrolitrach PBS bez wapnia lub magnezu w sterylnych 1,5 mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Jak wskazano w tej tabeli, całkowita ilość DNA wynosi dwa mikrogramy na studzienkę. Dodaj cztery mikrolitry roztworu PEI do mieszanki plazmidowego DNA PBS.

Ostateczna objętość wynosi około 100 mikrolitrów lub 5% objętości pożywki hodowlanej. Krótko zawirować probówki i inkubować mieszaninę DNA PEI w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji krótko zakręć probówkami w mikrowirówce, aby zebrać płyn na dno.

I dodawać mieszaninę DNA PEI kroplami do pożywki hodowlanej w każdym dołku płytki hodowlanej HEK 293. Następnie delikatnie wymieszaj płytki i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Transfekcja komórki HEK 293 jest krytycznym elementem tego protokołu do produkcji wirusa o wysokim mianie.

Należy używać zdrowych komórek o niskiej liczbie pasaży i należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić monowarstwy komórek. W pierwszym i drugim dniu, pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym, obserwuj komórki transfekowane plazmidem PCMVGFP, aby ocenić skuteczność transfekcji. Piątego dnia pipetuj komórki i pożywkę zawierającą wirusa w górę iw dół lub użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać wszystkie komórki.

Następnie przenieś zawiesinę do 15-mililitrowych stożkowych rurek polipropylenowych. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby odzyskać cząsteczki wirusa, szybko rozmrozić zamrożone probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie energicznie wiruj rurki przez jedną minutę, aby zmaksymalizować odzyskiwanie AAV z komórek. Osadzaj resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 3, 700 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieść 200 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do znakowanych probówek mikrowirówek z nakrętkami do testu punktowego.

Aby poddać próbki działaniu endonukleazy Serratia marcescens, należy przygotować odczynniki mieszaniny A i B. Dodaj 10 mikrolitrów każdego odczynnika do każdej probówki z próbką. Wirować próbki przez pięć sekund i krótko je obracać, aby zebrać płyn na dno probówek.

Następnie inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po krótkim odwirowaniu próbek przeprowadzić obróbkę proteinazą K, przygotowując odczynnik mieszany C i dodając 180 mikrolitrów do każdej probówki. Następnie, po wirowaniu i ponownym krótkim obracaniu rurek, inkubuj je w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę.

Gdy próbki powrócą do temperatury pokojowej, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu fenolowego i wiruj probówki przez jedną minutę. Następnie należy obracać próbki w mikrowirówce w temperaturze 16, 100 razy G i temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Przenieś 320 mikrolitrów warstwy wodnej lub 80% objętości płynu wodnego do nowej standardowej probówki do mikrowirówki.

Ten etap przenoszenia jest niezwykle ważny, ponieważ ta sama objętość musi zostać pobrana z próbki, aby zachować dokładność oznaczania ilościowego AAV. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć fazy organicznej podczas usuwania warstwy wodnej. Przygotować odczynnik do mieszaniny D i dodać 833 mikrolitry do każdej probówki z próbką.

Po wirowaniu probówek inkubuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut. Po odwirowaniu odlewać supernatant i raz osuszać probówki na czystym ręczniku papierowym. Odpipetuj około 500 mikrolitrów 70% etanolu do każdej probówki i wiruj probówki przez pięć sekund.

Po ponownym odwirowaniu próbek należy odlać supernatant i osuszyć probówki na czystym ręczniku papierowym. Następnie wysusz granulki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przed ponownym zawieszeniem ich w buforze TE. Aby przeprowadzić test kropkowy, przygotuj wzorce plazmidowego DNA, rozcieńczając DNA plazmidu wektorowego genomu AAV do 10 nanogramów na mikrolitr w wodzie lub buforze Tris-HCL.

Przenieść 25 mikrolitrów podwielokrotności rozcieńczonego plazmidowego DNA do świeżej probówki i poddać ją linearyzacji za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego w objętości reakcyjnej 50 mikrolitrów przez jedną godzinę. Dodać 450 mikrolitrów wody lub TE do probówki zawierającej wzorzec strawionego plazmidu DNA i dokładnie wymieszać. Następnie przenieś 70 mikrolitrów tej mieszaniny do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej z 1 330 mikrolitrami wody lub TE, aby uzyskać rozcieńczony wzorzec plazmidu.

Aby ustawić aparat do igłowania punktowego, za pomocą nożyczek przyciąć membranę do bibuły do rozmiaru odpowiedniego dla liczby próbek i wzorców. Namocz membranę w wodzie przez 10 minut przed umieszczeniem jej na aparacie do igłówek. Następnie przykryj nieużywane studnie.

Dodaj wodę do studni, do których zostaną załadowane próbki. Zastosuj podciśnienie, przeciągnij wodę przez studnie, sprawdź, czy nie ma błędów, a następnie dokręć. W razie potrzeby przetestuj ponownie.

Nałożyć 400 mikrolitrów każdego rozcieńczonego wzorca plazmidowego DNA do każdej studzienki i uruchomić cztery pasy standardowych rozcieńczeń. Użyj dwóch oddzielnych podwielokrotności standardowego skrótu i załaduj każdą z nich w dwóch egzemplarzach. Następnie nałóż 200 mikrolitrów na studzienkę każdej próbki DNA wirusa.

Zastosuj delikatną próżnię, aby przeciągnąć roztwory DNA przez studzienki. Następnie, gdy wszystkie studzienki zostaną opróżnione, uwolnij próżnię, regulując zawór trójdrogowy. Dodaj 400 mikrolitrów jednego roztworu alkalicznego X do każdej studzienki.

Następnie odczekaj pięć minut przed ponownym zastosowaniem próżni w celu opróżnienia studzienek. Ponownie zastosuj próżnię i zdemontuj aparat do igłowej plamy. Następnie zdejmij membranę i spłucz ją dwoma X SSC.

Umieść membranę na czystym ręczniku papierowym stroną związaną z DNA skierowaną do góry, aby usunąć nadmiar buforu. Użyj odpowiedniego środka sieciującego UV, aby usieciować UV plamiste DNA z błoną. Membrana jest teraz gotowa do hybrydyzacji.

Umieść błonę w butelce do hybrydyzacji stroną związaną z DNA do góry. Przepłukać membranę pięcioma do 10 mililitrami wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i wyrzucić bufor. Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i umieść butelkę w obrotowym piekarniku do hybrydyzacji ustawionym na 65 stopni Celsjusza.

Obracaj butelkę przez co najmniej pięć minut. Szybko dodaj zdenaturowane DNA plemników i radioaktywną sondę do buforu hybrydyzacyjnego w butelce i potrząsaj nim przez 10 sekund, aby wymieszać. Włóż butelkę z powrotem do piekarnika o temperaturze 65 stopni Celsjusza i inkubuj ją obracając w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny.

Po zakończeniu hybrydyzacji zatrzymaj rotację. Wyjmij butelkę do hybrydyzacji, a następnie wlej roztwór sondy radioaktywnej do 50-mililitrowej stożkowej rurki z szczelną zatyczką. Aby umyć membranę, dodaj 20 do 30 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu myjącego do butelki hybrydyzacyjnej i obracaj ją przez pięć minut.

Powtórz to pranie jeszcze dwa razy. Po trzecim praniu wyjmij membranę z butelki do hybrydyzacji i ręcznikami papierowymi usuń nadmiar buforu z membrany. Następnie umieść membranę w przezroczystym plastikowym uchwycie na papier.

Za pomocą licznika Geigera sprawdź sygnały radioaktywne na membranie. Po wystawieniu wymazanego ekranu obrazowania luminoforowego na membranę, zeskanuj ekran za pomocą systemu skanowania obrazu luminoforowego i uzyskaj dane o intensywności sygnału każdej kropki. Przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym.

Ten ilościowy znacznik punktowy do miareczkowania wektorowego AAV 2G9 zawiera dwa zestawy wzorców i trzy różne ilości preparatu wektorowego AAV, w tym 0,3, 0,1 i 0,03 mikrolitra w dwóch egzemplarzach. Ilości, które mają być oznaczone na blot, są określane empirycznie lub na podstawie wstępnego testu. Za pomocą interpolacji ustalono, że podwielokrotności 0,3, 0,1 i 0,03 mikrolitra wektora AAV 2G9 miały średnio miano 5,16, co odpowiada 0,27 nanogramom mikrolitrów.

Wszystkie możliwe pokrewne i heterologiczne kombinacje serotypów białek VP3 cas-pid i AAP z AAV5, AAV9 i AAV węża oceniano pod kątem składania kapsydu za pomocą ilościowego testu punktowego. Wyniki tego wykresu pokazują, że AAV5 VP3 składa się niezależnie od tego, czy AAP został dostarczony w trans. Ponadto AAP5 i AAP9 mogą promować montaż kapsydu AAV9 VP3, chociaż AAP5 działa mniej skutecznie niż AAP9.

Ani AAP5, ani AAP9 nie wykazują aktywności promującej montaż na wężu AAV VP3, a wąż AAP promuje tylko montaż węża AAV VP3. Analizę dot blot zastosowano do oceny aktywności nukleazy trzech dostępnych na rynku nukleaz w niezoptymalizowanych warunkach zawierających zanieczyszczenia pochodzące z komórek i pożywki hodowlanej. Stwierdzono, że enzym A nie jest tak aktywny jak pozostałe dwa enzymy, co pokazuje, że wybór nukleazy może znacząco wpłynąć na odczyt testu dot blot.

Technika ta jest prosta w określaniu ilościowym wektora AAV i odgrywa zasadniczą rolę w ocenie roli AAP w promowaniu składania kapsydów AAV pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli działa prawidłowo po uzyskaniu próbek testowych w eksperymentach z hodowlą komórkową. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym pipetowaniu odpowiedniej objętości cieczy, aby zapewnić dokładność ilościową.

Po jego opracowaniu, zastosowanie ilościowego testu punktowego do badania AAP utorowało drogę naukowcom zajmującym się biologią AAV do dalszego zrozumienia mechanizmu składania kapsydu AAV. Nie zapominaj, że praca z komórkami ludzkimi, czynnikami wirusowymi, chloroformem fenolowym i materiałami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna. Aby ograniczyć ekspozycję, konieczne jest stosowanie fartuchów laboratoryjnych, rękawic i okularów.

Z materiałami tymi należy obchodzić się wyłącznie w zatwierdzonych obszarach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki igłówek do oceny ilościowej AAV, skonfigurować aparat do usuwania plam, określić miano AAV i zastosować procedurę do badania biologii AAV. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne testy, takie jak testy transdukcji wektora AAV w komórkach hodowlanych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalne miano wektoryzowanych w porównaniu z fizycznym mianem cząstek określonym za pomocą testu kropkowego.