Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Ogólnym celem tych procedur jest zbadanie długoterminowych skutków ekspozycji na niskie dawki BPA we wczesnej embriogenezie. Zarodki C.elegans są wystawione na działanie BPA przez ograniczony okres czasu i testowane po osiągnięciu dorosłości pod kątem płodności i zachowań związanych z uczeniem się. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące długoterminowych skutków rozwojowych narażenia na substancje toksyczne, takie jak bisfenole i inne związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona testowanie długoterminowego i subtelnego wpływu substancji toksycznych na rozwój poprzez ilościowe testy behawioralne na łatwym w użyciu modelu laboratoryjnym bezkręgowców. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zrozumienia rozwojowych i neuronalnych podstaw szkodliwych skutków zdrowotnych narażenia na toksyny nawet w niskich dawkach. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł przeprowadzenia tych eksperymentów, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że wiele złożonych lub wieloczynnikowych zaburzeń wydaje się mieć taki lub inny komponent rozwojowy.

Co może wywierać wpływ częściowo poprzez anomalną ekspresję krytycznych genów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy habituacji dotyku we wnętrzu mogą być trudne do nauczenia się wyłącznie za pomocą instrukcji tekstowych. Dzień przed synchronizacją przenieś robaki N2 na 100-milimetrowe płytki zawierające pożywki NGM, rozsmarowane E.coli OP50.

Poprzez rozdrabnianie płyty o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego. Pozwól robakom rosnąć przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po trzech dniach, gdy płytki zostaną wypełnione dobrze odżywionymi, dojrzałymi osobnikami dorosłymi zawierającymi widoczne zarodki, rozpocznij synchronizację, najpierw myjąc każdą płytkę pięciomilimetrowym buforem M9 i przenosząc płyn do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Wirować przy 3 000 razy większej grawitacji przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Po certrifugacji użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie usunąć supernatant z każdej luźnej osadki dorosłych robaków. Następnie dodaj 5 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu podchlorynu do każdej granulki robaków i delikatnie wymieszaj.

Wirować przy 3 000 razy większej grawitacji w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Bardzo ważne jest uzyskanie zsynchronizowanych populacji. Przygotowanie świeżego roztworu podchlorynu pomaga w uniknięciu zanieczyszczenia i niezsynchronizowanych zwierząt.

Następnie użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby usunąć supernatant i umyć siedem mililitrów buforu M9. Powtórz ten krok dwukrotnie. Po ostatnim umyciu dodaj do jaj około 100 mikrolitrów buforu M9.

Następnie przenieś około 50 mikrolitrów jaj do dwóch mililitrowych probówek do mikrofuge zawierających BPA rozcieńczone w buforze S. Dostosuj ilość buforu S, aby zapewnić prawidłowe końcowe stężenie BPA na probówkę, jak pokazano w tabeli. Umieść rurki na wytrząsarce kołyszącej lub obrotowej, poruszającej się z prędkością 25 przechyłów na minutę lub 25 obr./min przez cztery godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Po czterech godzinach umieść probówki w uchwytach na probówki i pozwól robakom się uspokoić. Odrzucić supernatant i przenieść robaki na płytki NGM wysiane OP50 E. coli. Pozwól robakom rosnąć przez 60 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zanieczyszczeń. Zanieczyszczone płytki NGM są zwykle odbarwione i towarzyszą im poszczególne kolonie. Sprawdź robaki pod mikroskopem pod kątem przeludnienia.

Najpierw użyj wysterylizowanego ogniowo platynowego kilofa o grubości 30 mm, aby przenieść około dziesięciu zsynchronizowanych młodych dorosłych robaków na nowe, niezasiewane płytki NGM. Pozostaw robaki w spokoju przez pięć minut, aby dać im czas na aklimatyzację do nowej płytki. Następnie wysterylizuj włoski brwi przymocowane do końca drewnianego szpikulca lub wykałaczki, zanurzając je w 70% etanolu.

Przetrzyj czystą, niestrzępiącą się chusteczką i odczekaj minutę, aż etanol odparuje. Delikatnie dotknij robaka na głowie za pomocą włosków brwiowych. Powtórz dotknięcia, pozostawiając dziesięć sekund między dotknięciami, aby robak mógł się zregenerować.

Kontynuuj dotykanie, odczekaj dziesięć sekundowych interwałów między bodźcami, aż robak przestanie się cofać. Zapisz liczbę dotknięć wymaganych do wystąpienia tego przyzwyczajenia. Pozostawienie dziesięciosekundowej przerwy między dotykami jest ważne, ponieważ pozwala to zwierzęciu na regenerację i pomaga w uzyskaniu spójnych testów zachowań habituacyjnych.

Dorosłe zwierzęta, które były embrionalnie narażone na działanie jednego mikromolowego lub wyższego stężenia BPA, złożyły znacznie mniej jaj w porównaniu z kontrolą reprezentowaną przez linię poziomą. Dorosłe zwierzęta pochodzące z zarodków, które były narażone na stężenie BPA tak niskie, jak 0,1 mikromola, wykazują deficyty nieasocjacyjne oparte na zwiększonej liczbie przednich dotknięć wymaganych do ich przyzwyczajenia. Przygotowując zarodki do ekspozycji na BPA, ważne jest, aby wybrać płytkę z dobrze odżywionymi dorosłymi C.elegans z dojrzałymi jajami widocznymi pod mikroskopem preparacyjnym, aby mieć wystarczającą wielkość próbki.

Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się toksykologią środowiskową do oceny wpływu toksyn i innych związków zaburzających gospodarkę hormonalną na zachowanie i projektowania eksperymentów mechanistycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wystawić zarodki C.elegans we wczesnym stadium na działanie BPA i jak testować zachowania habituacyjne u powstałych dorosłych osób pochodzących z zarodków narażonych na BPA.