Name: Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny długoterminowych skutków niskich dawek BPA u C. elegans poprzez testy płodności i behawioralne. Technika ta pozwala badać wpływ toksyn na rozwój i zachowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie ze strony NSF (EPSCoR EPS-0814251) i NIH (1P20GM103653-01A1) dla MKT i HSD, instytucjonalne wsparcie studentów Uniwersytetu Stanowego Delaware dla MDM (Title III HBGI) i KRS (NIH-INBRE) jest z wdzięcznością potwierdzone. Podziękowania dla Centrum Genetycznego C. elegans (wspieranego przez NIH Office of Research Infrastructure Programs P40 OD010110) dla szczepu C. elegans typu dzikiego N2.

Poniższe protokoły zostały ustandaryzowane do testowania wpływu ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy i mogą być modyfikowane do użycia z BPS, BPF lub innymi EDC i toksycznymi substancjami na zarodkach C. elegans.
1. Ustawienia materiału
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki do wzrostu nicieni (NGM)18 pożywki, rozpuszczając 1,5 g NaCl, 1,25 g peptonu i 8,5 g agaru w wodzie do 500 ml. Po sterylizacji w autoklawie (121 °C, 15 PSI, 20 min) dodać 0,5 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 0,5 ml 1 MMgSO4, 0,5 ml 1 M CaCl2 i 12,5 ml 1 M buforu fosforanu potasu, pH 7,4 (108,3 g KH2PO4, 35,6 g K2HPO4, woda do 1 l).</li>
	<li>Przygotuj roztwór podchlorynu, mieszając 25 ml 1 N KOH, 4 ml wybielacza i 71 ml wody. Spraw, aby to rozwiązanie było świeże.</li>
	<li>Przygotować bufor M9, mieszając 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 5 ml 1 MMgSO4 i wodę z 1 l.</li>
	<li>Przygotuj bufor S Buffer18 mieszając 129 ml 0,02 M K2HPO4, 871 ml KH2PO4 i 5,85 g NaCl.</li>
	<li>Sterylizuj M9 i S przez autoklawowanie.</li>
	<li>Hoduj przez noc kulturę Escherichia coli (szczep OP 50) w 20 ml bulionu Luria (LB).</li>
	<li>Rozpuść BPA w 10% etanolu, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM. Wykonać kolejne rozcieńczenia 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM i 10 μM w buforze S. 
	UWAGA: Rozcieńczenie w wodnym buforze S znacznie zmniejsza stężenie etanolu; na przykład przy najwyższym stężeniu BPA opisanym w tym protokole (10 μM) stężenie etanolu wynosi 0,1% v/v.</li>
</ol>
2. C. elegans Hodowla i synchronizacja
<ol>
	<li>Wlej pożywkę NGM do płytek o średnicy 100 mm (około 25 ml/płytkę) i pozwól jej zastygnąć. Po zestaleniu wysiewaj płytki, rozprowadzając 150 μl E. coli OP50 z płynnej kultury wyhodowanej przez noc. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia przenieś robaki N2 na nowe płytki, krojąc przybliżoną płytę o powierzchni 1 cm kwadratowej. Pozostawić robaki do wzrostu przez 3 dni w temperaturze 20 °C, aż na płytce pojawią się dobrze odżywione, dojrzałe osobniki dorosłe zawierające widoczne zarodki.</li>
	<li>Aby przeprowadzić synchronizację, umyj każdą płytkę, pipetując do 5 ml buforu M9 w poprzek płytki. Przenieść płyn do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Synchronizacja jest wykonywana w celu zabicia dorosłych robaków i zebrania zarodków, które są w stosunkowo tym samym stadium.</li>
	<li>Wirować przy 3 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej w celu uzyskania luźnej osadki dorosłych robaków.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml ostrożnie usunąć supernatant tak, aby pozostawić osad w stanie nienaruszonym. Dodaj 5 ml roztworu podchlorynu i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Wirować przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przemyć 7 ml buforu M9. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
</ol>
3. Narażanie robaków na działanie BPA
<ol>
	<li>Po ostatnim myciu z kroku 2.7 powyżej, zawiesić około 100 μl jaj za pomocą bufora M9. Przenieś około 50 μl jaj do probówek do mikrofuge o pojemności 2 ml, zawierających już BPA o odpowiednim stężeniu, rozcieńczonego w buforze S. Dostosuj ilość buforu S, aby zapewnić prawidłowe końcowe stężenie BPA (0,0 μM, 0,1 μM, 0,5 μM, 1,0 μM, 5,0 μM i 10 μM) na probówkę. Tabela 1 ilustruje jeden ze sposobów dokonywania tych rozcieńczeń.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dla końcowego stężenia BPA</td>
			<td>Zapas BPA (100 μM)</td>
			<td>Bufor S</td>
			<td>Zsynchronizowane robaki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1 μM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>949 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 μM</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>945 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 μM</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>940 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μM</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>850 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zapasowe BPA, bufor S i zsynchronizowane robaki użyte do osiągnięcia pożądanych stężeń użytych w naszym badaniu.
<ol start="2">
	<li>Umieść probówki na wytrząsarce i delikatnie potrząsaj przez 4 godziny w temperaturze 20°C, przy 25 obr./min w przypadku wytrząsarki obrotowej lub 25 przechyleń/min w przypadku wytrząsarki kołyszącej.</li>
	<li>Po 4 godzinach umieść probówki w uchwytach na probówki i pozwól robakom się uspokoić.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant i przenieś robaki na płytki z nasionami (płytki NGM z OP50 E. coli). Przygotować płynną kulturę OP50 E. coli, jak podano w ppkt 1.5 i wysiać płytki, jak podano w ppkt 2.1.</li>
	<li>Pozwól robakom rosnąć przez 60 godzin w temperaturze 20 °C. Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zanieczyszczeń. Zanieczyszczone płytki NGM są zwykle odbarwione i towarzyszą im poszczególne kolonie. Sprawdź robaki pod mikroskopem pod kątem przeludnienia. Brak trawnika OP50 E. coli i skoncentrowane robaki w małych miejscach oznaczają przeludnienie.</li>
</ol>
4. Test habituacji przedniego dotyku
<ol>
	<li>Przenieś około 10 zsynchronizowanych młodych dorosłych robaków na nowe, niewysiewane płytki NGM za pomocą sterylizowanego ogniowo plastikowego drucianego szpikulca o wadze 30 G. Pozostaw robaki w spokoju przez 5 minut, aby miały czas na aklimatyzację do nowej płytki.</li>
	<li>Aby uzyskać reakcję przyzwyczajenia, użyj włoska brwiowego przymocowanego do końca drewnianego szpikulca lub wykałaczki i sterylizuj, zanurzając w 70% etanolu. Wytrzyj czystą, niestrzępiącą się chusteczką i odczekaj 1 minutę, aż etanol odparuje. Delikatnie dotknij robaka na głowie (przed opuszką gardłową) za pomocą włosków brwiowych. Powtórz dotknięcia, pozostawiając 10 sekund między dotknięciami, aby robak mógł się zregenerować.</li>
	<li>Kontynuuj dotykanie (pozostawiając 10-sekundowe przerwy między bodźcami), aż robak przestanie się cofać. W tym momencie robak przyzwyczaił się do bodźca. Zapisz liczbę dotknięć wymaganych do przyzwyczajenia się robaka.</li>
	<li>Przeanalizuj różnicę między średnimi wskaźnikami habituacji osób z grupy kontrolnej leczonej i nieleczonej, używając jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya.</li>
</ol>
5. Test płodności robaków
<ol>
	<li>Przenieś pojedyncze robaki L3 na świeży i wysiedlony talerz za pomocą platynowego kilofa. Upewnij się, że na każdej płytce znajduje się tylko jeden robak. 
	UWAGA: Po stadium larwalnym L3 robaki rozwijają się w stadium larwalne L4 i dorosłość. Wczesne zbieranie ich jest wygodne, ponieważ są wystarczająco duże, aby można było przenieść pojedyncze zwierzęta, przy jednoczesnym zapewnieniu, że nie złożyły już żadnych jaj, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte podczas liczenia.</li>
	<li>Policz liczbę jaj składanych co 12–24 godziny. Po zliczeniu przenieś robaka rodzicielskiego na nową płytkę. Powtarzaj, aż robak przestanie składać jaja, zwykle po 5 dniach inkubacji w temperaturze 20 °C. 
	UWAGA: Średnio robak typu dzikiego może złożyć do 300 jaj; Dlatego codzienne przenoszenie rodzica na nowy talerz zapobiega przepełnieniu.</li>
	<li>Przeanalizuj różnicę między średnią liczbą jaj złożonych przez kontrole poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu substancji, używając jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya.</li>
</ol>

<ol><li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+Summary+to+EDC-2%3A+The+Endocrine+Society%27s+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li>
<li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+exposure+to+EDCs%3A+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li>
<li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+of+the+National+Toxicology+Program%27s+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li>
<li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+mixing+cocktails%3A+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li>
<li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals%3A+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li>
<li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Stomatol.+%28Roma%29%22%5BJournal%5D)">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li>
<li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li>
<li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+and+the+great+divide%3A+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice%3A+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li>
<li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li>
<li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10(2009).</li>
<li>Lee, D., Jacobs, D. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Endocr.+Metab.+Disord%22%5BJournal%5D)">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li>
<li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li>
<li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li>
<li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain.+Funct%22%5BJournal%5D)">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27(2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223(2016).</li>
<li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+revisited%3A+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li>
<li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+I+%22C+elegans%3A+A+Practical+Approach%22">C elegans: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1999).</li>
<li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56300/assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , In Press (2017).</li>
<li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook+The+C.+elegans+Research+Community%22">WormBook The C. elegans Research Community</a>. , (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Fazy szybkiego wzrostu i rozwoju, takie jak embriogeneza, są szczególnie podatne na szkodliwe działanie różnych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego, w tym BPA. Udostępniamy szczegółowe protokoły badania skutków narażenia na BPA lub inne substancje toksyczne w modelu bezkręgowców C. elegans , który umożliwia wygodne miareczkowanie zakresu stężeń w celu oceny jego wpływu na żywotność zarodka (ryc. 2). Dalsze eksperymenty behawioralne na ocalałych dorosłych, które rozwijają się z zarodków, które były narażone na niskie dawki BPA, pozwalają na określenie długoterminowego wpływu na funkcję neuronów (ryc. 3). Główną ideą tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów wystawiania embrionów na działanie różnych substancji toksycznych we wczesnym okresie embriogenezy w modelu C. elegans; pierwsze 4-godzinne okno 11,5-godzinnego okresu rozwoju embrionalnego (w temperaturze 20 °C) odpowiada okresowi proliferacji, po którym następuje organogeneza. W tym celu przeprowadziliśmy walidację punktów końcowych za pomocą testów płodności i uczenia się bez asocjacji. Podczas gdy mechanistyczne podstawy działania BPA i innych bisfenoli są świętym Graalem, do którego zmierzają badania w tej dziedzinie, nie próbowaliśmy zaoferować mechanistycznego wyjaśnienia działania BPA w tym artykule skoncentrowanym na metodologii. Chcielibyśmy jednak zwrócić uwagę, że model C. elegans oferuje idealny system do dalszej analizy mechanizmu działania. Na przykład w ramach przyszłych prac nad rozszyfrowaniem mechanizmów działania BPA mutanty C. elegans mogą zostać wygenerowane i przebadane pod kątem odporności na działanie BPA, a tym samym utorować drogę do rozszyfrowania szlaku. Ponadto nasz artykuł towarzyszący zajmuje się wpływem BPA na poziomie synchronizacji sieci neuronowych u kręgowców, zapewniając kolejną drogę do zrozumienia podstaw do badania potencjalnych mechanizmów działania toksycznego19.
W metodologii opisanej w tym artykule, niektóre z krytycznych kroków, które należy wykonać bardzo ostrożnie, obejmują: Wybór płytki z dobrze odżywionymi dorosłymi osobnikami C. elegans z dojrzałymi jajami widocznymi pod mikroskopem preparacyjnym ma kluczowe znaczenie, a niewykonanie tego kroku spowoduje niewystarczającą wielkość próbki zarodków do eksperymentu z ekspozycją na EDC. Ważne jest również, aby upewnić się, że roztwór podchlorynu jest świeży, aby uniknąć uzyskania niezsynchronizowanej populacji, która będzie zakłócać zdolność do przeprowadzenia ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy. Bardzo ważnym krokiem jest również mycie granulek M9 (po ekspozycji na podchloryn). Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, wysokie stężenie wybielacza może spowodować śmierć zarodków. Dodatkowo po 4 godzinach należy przenieść zarodki na płytki wysiewane metodą NGM. Jeśli zarodki zostaną pozostawione w roztworze BPA przez dłuższy czas, prawdopodobnie rozwiną się w długowieczne larwy dauer. Będzie to znacząco kolidować zarówno z testem płodności, jak i testami behawioralnymi. Jeśli którykolwiek z tych kroków zostanie pominięty, zaleca się rozpoczęcie procedury od samego początku. Jeśli z jakiegokolwiek powodu płytka NGM z robakami jest zanieczyszczona lub nie ma wystarczającej ilości pożywienia, spowoduje to dodatkowy stres u robaków, zniekształcając w ten sposób zebrane dane. Takie płytki należy wyrzucić i nie używać ich w doświadczeniu.
Wcześniej w niezwykłym badaniu z powodzeniem wykorzystano model C. elegans, aby wykazać, że nieprawidłowości chromosomowe spowodowane przez BPA wynikają z rozpadu maszynerii naprawy DNA w linii zarodkowej14. Warto jednak zauważyć, że w powyższym projekcie badania wykorzystano ciągłą ekspozycję C. elegans na BPA na wysokie dawki BPA przez cały okres jego życia. Nasza metodologia została zaprojektowana do badania ekspozycji na niskie dawki BPA podczas wczesnej embriogenezy, aby ocenić jej wpływ na żywotność zarodka i subtelniejsze długoterminowe skutki dla osób, które przeżyły. O ile nam wiadomo, nie opracowano żadnej metodologii pozwalającej na narażenie zarodków we wczesnym stadium rozwoju na bardzo niskie dawki BPA ograniczone do określonego okresu czasu; Tym samym sprawia, że prezentowana tu metoda jest nowatorska.
Ponadto przedstawione tutaj protokoły można łatwo dostosować do badania wpływu innych EDC podczas fazy proliferacji embriogenezy. Jednakże, aby badać późne stadia embrionalne, protokół będzie wymagał kluczowych modyfikacji krytycznego okna czasowego rozwoju, na którym się skupiamy. Co więcej, nasz protokół nie będzie odpowiedni dla eksperymentów wymagających dłuższego czasu ekspozycji na toksyny, ponieważ otwiera możliwość alternatywnej ścieżki rozwoju skutkującej długotrwałym zatrzymaniem dauera w drugim cyklu linienia, który jest odporny na trudne warunki20. Konieczne będą dalsze modyfikacje i udoskonalenia w celu wydłużenia czasu ekspozycji poprzez suplementację źródłem żywności, które nie ma potencjału do metabolizowania substancji toksycznej lub EDC , np. autoklawizowanej E. coli. Podsumowując, nasza metodologia może być wykorzystana do oceny wpływu różnych substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną na płodność i funkcję neuronów w systemie modelowym bezkręgowców C. elegans.

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe, szczególnie te, które mają tendencję do zakłócania rozwoju, było w ostatnich latach przedmiotem dokładnej naukowej analizy. Ponad tysiąc substancji chemicznych w codziennym użyciu jest klasyfikowanych jako związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC)1. Zauważono, że okresy szybkiego wzrostu i rozwoju, które obejmują etapy embrionalne, niemowlęce i dziecięce, są szczególnie podatne na szkodliwe skutki nawet niskich dawek EDC. Wykazano, że ich działanie powoduje zaburzenia rozrodcze i neurorozwojowe2. Zgodnie z wytycznymi Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska i Narodowego Programu Toksykologicznego USA, niska dawka może być zdefiniowana jako dowolna dawka poniżej poziomu, która została zgłoszona jako powodująca obserwowalną zmianę biologiczną lub uszkodzenie3. Oprócz skutków niskich dawek poszczególnych EDC, mieszaniny różnych EDC występujące w niskich stężeniach w środowisku mogą potencjalnie powodować istotne skutki skumulowane4.
Bisfenol A (BPA lub 4,4'-(propan-2,2-diyl)) jest środkiem polimeryzującym znajdującym się w powszechnie używanych przedmiotach, takich jak butelki na wodę, paragony sklepowe, uszczelniacze dentystyczne oraz wyściółki puszek po napojach i żywności5. Ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do 17-β estradiolu (E2) i powinowactwo do receptorów estrogenowych ERα i ERβ, BPA został sklasyfikowany jako substancja chemiczna zaburzająca gospodarkę hormonalną (EDC)5,6. Wykazano, że powinowactwo BPA do receptorów estrogenowych, choć słabsze, wpływa na układ rozrodczy obu płci i zakłóca funkcje neuronalne w dawkach uważanych za bezpieczne7,8. Zaobserwowano, że zmiany w metylacji DNA poprzez epigenetycznie regulowane mechanizmy powodują długotrwałe defekty neuronalne u myszy narażonych na BPA9. W szczególności BPA jest również uważany za możliwego winowajcę zwiększonych wskaźników nadpobudliwości, niedoboru uwagi i zwiększonej wrażliwości na leki z powodu wzrostu obserwowanego w receptorach dopaminy D1 w limbicznym przodomózgowiu myszy po przewlekłej ekspozycji9,10. Znaczące dowody na szkodliwy wpływ EDC na zdrowie ludzi opierają się na badaniach korelacyjnych skupiających się głównie na przewlekłym narażeniu populacji na toksyczne czynniki środowiskowe nawet przy niskich dawkach5; Jednak ograniczenia we wnioskach z badań na ludziach i w manipulowaniu eksperymentalnymi kontrolami zostały zaakceptowane podczas odpowiadania na krytykę bezpodstawnego hype11,12.
Ze względu na zachowanie genów Caenorhabditis elegans w odniesieniu do ssaków, w tym genów receptorów hormonów steroidowych, naukowcy wykorzystali ten genetycznie wykonalny model laboratoryjny do rozwikłania funkcjonalnych i mechanistycznych efektów EDCs13. Eksperymenty z C. elegans wykazały, że te związki, takie jak BPA i BPS, mogą powodować apoptozę, śmiertelność embrionalną, zakłócenie mechanizmów naprawy pęknięć dwuniciowego DNA i funkcje neuronalne14,15,16.
Nasze laboratorium wcześniej wykazało, że nawet niskie dawki ograniczone do wczesnej embriogenezy prowadzą do obniżenia płodności z deficytami behawioralnymi u ocalałych dorosłych15. Przyzwyczajenie do powtarzającego się bodźca jest formą uczenia się bez asocjacji w systemach modelowych, w tym C. elegans, a nasza metodologia wykorzystuje tę formę uczenia się bez asocjacji jako wynik behawioralny do oceny długoterminowych skutków ekspozycji embrionalnej na substancje toksyczne17 W szczególności zapewniamy szczegółowe protokoły badania ekspozycji BPA na C. elegans, w tym jego natychmiastowy wpływ na śmiertelność zarodków i długoterminowy wpływ na zachowanie dorosłych, z ogólnym schematem przedstawionym w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki testów płodności i uczenia się bez asocjacji, aby podkreślić skuteczność naszej metodologii.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher</td><td>S25761B</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11470</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P286-1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>7758-11--4</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>BPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>103039-100g</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr>Repozytorium <td>CGC</td><td></td><td>E.coli OP50</td><td>w U of Minnesota</td></tr><tr><td>Robaki N2 (dziki typ C. elegans)</td> Repozytorium <td>CGC</td><td></td><td>w U z Minnesoty</td></tr><tr><td>Platynowy wykalek</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-AWP</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Fisher</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>AmScope</td><td>SM-2TYY</td><td></td></tr></tbody></table>

długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisfenole, takie jak bisfenol A (BPA) i bisfenol S (BPS) są powszechnie stosowanymi środkami polimeryzującymi w produkcji tworzyw sztucznych i licznych produktów codziennego użytku. Ze względu na ich strukturę chemiczną i właściwości biologiczne podobne do estradiolu zostały sklasyfikowane jako związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC). Długotrwałe narażenie na EDC, nawet w niskich dawkach, wiąże się z różnymi wadami zdrowotnymi, w tym rakiem, zaburzeniami zachowania i niepłodnością, przy czym większa podatność jest wskazywana we wczesnych okresach rozwojowych. Badania komórkowe i molekularne z genetycznie podatnym modelem nicieni Caenorhabditis elegans wykazały, że narażenie na BPA powoduje apoptozę, śmiertelność zarodka i zakłócenie mechanizmów naprawy DNA. Wcześniej informowaliśmy, że narażenie zarodków C. elegans na niskie dawki różnych bisfenoli zmniejsza płodność. Ponadto wykazaliśmy, że skutki ekspozycji na bardzo wczesnych etapach rozwoju utrzymują się do dorosłości, co stwierdzono poprzez ilościowe określenie zachowań habituacyjnych, formy uczenia się bez asocjacji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące ekspozycji zarodków na niskodawkowe EDC, a także związane z tym testy płodności i habituacji przedniego dotyku, wraz z reprezentatywnymi wynikami.

Wcześniejsze badania z wykorzystaniem C. elegans wykazały, że ciągła ekspozycja na wysokie stężenia BPA (≥1 mM) przez cały okres rozwoju zarodkowego i w wieku dorosłym zmniejsza płodność14. Kolejne badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że zarodki eksponowane na BPA przez ograniczony czas 4 h we wczesnych etapach rozwoju wykazywały spadek liczby żywotnych jaj zniesionych w wieku dorosłym15 (Rycina 2). Dwiema kluczowymi cechami metodologii było to, że (i) zastosowane stężenia BPA były znacznie niższe (zakres od 0,1 µM do 10 µM) oraz (ii) ekspozycja była ograniczona do wczesnego okresu embrionalnego. Poza zmniejszoną płodnością nawet przy niższych dawkach, nasze testy habituacji ujawniły, że nicienie eksponowane na BPA w stadium zarodkowym wymagały większej liczby bodźców do habituacji w porównaniu z nicieniami eksponowanymi wyłącznie na nośnik15 (Rycina 3). Efekty te są godne uwagi, ponieważ opierają się na ekspozycji na niskie dawki BPA, zgodnie z założeniem, że subtelniejsze efekty w obrębie funkcji neuronalnych, które mogą nie być widoczne morfologicznie, są prawdopodobnie możliwe do wykrycia poprzez zmiany behawioralne. Krótko mówiąc, przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki podkreślają fakt, że szkodliwe efekty ekspozycji zarodka na BPA wpływają na jego rozwój, w tym na funkcje neuronalne, które można ocenić za pomocą testów behawioralnych u dorosłych osobników C. elegans. Przedstawione tutaj protokoły mogą być wykorzystane do badania skutków niskich dawek, jak i efektów długoterminowych innych potencjalnych toksykantów, w tym związków zaburzających gospodarkę hormonalną.
<img alt="Schemat cyklu życiowego C. elegans; ekspozycja embrionów na stężenia; testy habituacji i płodności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie planu eksperymentalnego. Doświadczone nicienie zostały zebrane i poddane działaniu roztworu podchlorynu w celu uzyskania zsynchronizowanych embrionów. Następnie embriony eksponowano na różne stężenia BPA przez 4 h. Poddane ekspozycji embriony przeniesiono na zaszczepione płytki NGM, gdzie pozostawiono je do wzrostu przez 60 h w temperaturze 20 °C. Aby zbadać skuteczność ekspozycji we wczesnych stadiach rozwoju, nicienie w stadium L4 przeniesiono na pojedyncze płytki w celu oceny płodności, a młode dorosłe osobniki poddano testom habituacji na dotyk przedni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres stężenia BPA w funkcji liczby zniesionych jaj; wykres liniowy z słupkami błędów pokazujący wpływ na płodność." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Płodność jest obniżona przez BPA. Ekspozycja na BPA w stężeniu 1 µM i wyższym znacząco zmniejszyła liczbę zniesionych jaj w porównaniu z grupą kontrolną (reprezentowaną przez linię poziomą; n = 10, *p &lt;0.05). Słupki błędów oznaczają SEM. Analizę przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA i testu post hoc Tukeya. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Mersha et al., 201515. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający stężenie BPA w funkcji liczby dotknięć; wynik eksperymentalny wskazuje na wzrost." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Długoterminowe skutki prenatalnej ekspozycji na BPA odzwierciedlają się w zachowaniu osobników dorosłych. Zarodki eksponowane na stężenia BPA tak niskie jak 0.1 µM wykazują wpływ na nieasocjacyjną habituację na dotyk przedni u osobników dorosłych (n = 60, *p &lt;0.05). Słupki błędów oznaczają SEM; ANOVA, test post hoc Tukeya. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Mersha et al., 201515. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Ogólnym celem tych procedur jest zbadanie długoterminowych skutków ekspozycji na niskie dawki BPA we wczesnej embriogenezie. Zarodki C.elegans są wystawione na działanie BPA przez ograniczony okres czasu i testowane po osiągnięciu dorosłości pod kątem płodności i zachowań związanych z uczeniem się. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące długoterminowych skutków rozwojowych narażenia na substancje toksyczne, takie jak bisfenole i inne związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona testowanie długoterminowego i subtelnego wpływu substancji toksycznych na rozwój poprzez ilościowe testy behawioralne na łatwym w użyciu modelu laboratoryjnym bezkręgowców. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zrozumienia rozwojowych i neuronalnych podstaw szkodliwych skutków zdrowotnych narażenia na toksyny nawet w niskich dawkach. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł przeprowadzenia tych eksperymentów, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że wiele złożonych lub wieloczynnikowych zaburzeń wydaje się mieć taki lub inny komponent rozwojowy.Co może wywierać wpływ częściowo poprzez anomalną ekspresję krytycznych genów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy habituacji dotyku we wnętrzu mogą być trudne do nauczenia się wyłącznie za pomocą instrukcji tekstowych. Dzień przed synchronizacją przenieś robaki N2 na 100-milimetrowe płytki zawierające pożywki NGM, rozsmarowane E.coli OP50.Poprzez rozdrabnianie płyty o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego. Pozwól robakom rosnąć przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po trzech dniach, gdy płytki zostaną wypełnione dobrze odżywionymi, dojrzałymi osobnikami dorosłymi zawierającymi widoczne zarodki, rozpocznij synchronizację, najpierw myjąc każdą płytkę pięciomilimetrowym buforem M9 i przenosząc płyn do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Wirować przy 3 000 razy większej grawitacji przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Po certrifugacji użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie usunąć supernatant z każdej luźnej osadki dorosłych robaków. Następnie dodaj 5 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu podchlorynu do każdej granulki robaków i delikatnie wymieszaj.Wirować przy 3 000 razy większej grawitacji w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Bardzo ważne jest uzyskanie zsynchronizowanych populacji. Przygotowanie świeżego roztworu podchlorynu pomaga w uniknięciu zanieczyszczenia i niezsynchronizowanych zwierząt.Następnie użyj dziesięciomililitrowej pipety, aby usunąć supernatant i umyć siedem mililitrów buforu M9. Powtórz ten krok dwukrotnie. Po ostatnim umyciu dodaj do jaj około 100 mikrolitrów buforu M9.Następnie przenieś około 50 mikrolitrów jaj do dwóch mililitrowych probówek do mikrofuge zawierających BPA rozcieńczone w buforze S. Dostosuj ilość buforu S, aby zapewnić prawidłowe końcowe stężenie BPA na probówkę, jak pokazano w tabeli. Umieść rurki na wytrząsarce kołyszącej lub obrotowej, poruszającej się z prędkością 25 przechyłów na minutę lub 25 obr./min przez cztery godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po czterech godzinach umieść probówki w uchwytach na probówki i pozwól robakom się uspokoić. Odrzucić supernatant i przenieść robaki na płytki NGM wysiane OP50 E. coli. Pozwól robakom rosnąć przez 60 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zanieczyszczeń. Zanieczyszczone płytki NGM są zwykle odbarwione i towarzyszą im poszczególne kolonie. Sprawdź robaki pod mikroskopem pod kątem przeludnienia.Najpierw użyj wysterylizowanego ogniowo platynowego kilofa o grubości 30 mm, aby przenieść około dziesięciu zsynchronizowanych młodych dorosłych robaków na nowe, niezasiewane płytki NGM. Pozostaw robaki w spokoju przez pięć minut, aby dać im czas na aklimatyzację do nowej płytki. Następnie wysterylizuj włoski brwi przymocowane do końca drewnianego szpikulca lub wykałaczki, zanurzając je w 70% etanolu.Przetrzyj czystą, niestrzępiącą się chusteczką i odczekaj minutę, aż etanol odparuje. Delikatnie dotknij robaka na głowie za pomocą włosków brwiowych. Powtórz dotknięcia, pozostawiając dziesięć sekund między dotknięciami, aby robak mógł się zregenerować.Kontynuuj dotykanie, odczekaj dziesięć sekundowych interwałów między bodźcami, aż robak przestanie się cofać. Zapisz liczbę dotknięć wymaganych do wystąpienia tego przyzwyczajenia. Pozostawienie dziesięciosekundowej przerwy między dotykami jest ważne, ponieważ pozwala to zwierzęciu na regenerację i pomaga w uzyskaniu spójnych testów zachowań habituacyjnych.Dorosłe zwierzęta, które były embrionalnie narażone na działanie jednego mikromolowego lub wyższego stężenia BPA, złożyły znacznie mniej jaj w porównaniu z kontrolą reprezentowaną przez linię poziomą. Dorosłe zwierzęta pochodzące z zarodków, które były narażone na stężenie BPA tak niskie, jak 0,1 mikromola, wykazują deficyty nieasocjacyjne oparte na zwiększonej liczbie przednich dotknięć wymaganych do ich przyzwyczajenia. Przygotowując zarodki do ekspozycji na BPA, ważne jest, aby wybrać płytkę z dobrze odżywionymi dorosłymi C.elegans z dojrzałymi jajami widocznymi pod mikroskopem preparacyjnym, aby mieć wystarczającą wielkość próbki.Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się toksykologią środowiskową do oceny wpływu toksyn i innych związków zaburzających gospodarkę hormonalną na zachowanie i projektowania eksperymentów mechanistycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wystawić zarodki C.elegans we wczesnym stadium na działanie BPA i jak testować zachowania habituacyjne u powstałych dorosłych osób pochodzących z zarodków narażonych na BPA.

long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest opisanie procedur wystawiania szczurów na umiarkowane poziomy alkoholu podczas prenatalnej ewolucji mózgu oraz ilościowe określenie wynikających z tego zmian w zachowaniach społecznych w wieku dorosłym.

Umiarkowana prenatalna ekspozycja na alkohol i kwantyfikacja zachowań społecznych u dorosłych szczurów

Narażenie na toksyny środowiskowe może mieć dotkliwy wpływ na rozwijające się zarodki. Wiadomo, że substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną, takie jak bisfenole, niekorzystnie wpływają na układ nerwowy. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący model sieci neuronalnej kręgowców (zarodków piskląt) in vitro w celu zbadania funkcjonalnego wpływu ekspozycji na toksyny na wczesne zarodki.

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Poznaj metodę oceny długoterminowych skutków niskich dawek BPA u C. elegans poprzez testy płodności i behawioralne. Technika ta pozwala badać wpływ toksyn na rozwój i zachowanie.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Przeglądaj więcej filmów