Name: Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania wapnia w dendrytach neuronów w wycinkach mózgu myszy. Technika łączy rejestrację patch-clamp z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, umożliwiając szczegółową analizę sygnałów wapniowych podczas integracji synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC Discovery Grant) oraz Fundację Savoy. OC było wspierane przez stypendium doktoranckie z NSERC.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt Komitetu Ochrony Zwierząt Uniwersytetu Laval oraz Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowania wstępne (Opcjonalnie: przygotować z 1-dniowym wyprzedzeniem)
<ol>
	<li>Przygotuj trzy rodzaje roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (roztwór standardowy, sacharozowy oraz regeneracyjny, po 1 L każdego; patrz Tabela 1). Dostosuj osmolalność roztworów do poziomu 300 ± 10 mOsm25 i schłodź ACSF-sacharozę do temperatury bliskiej zamarzania (0-4 °C). 
	UWAGA: Zastosowanie roztworu do wycinania o niskiej zawartości sodu (ACSF-sacharoza) pomaga zachować żywotność neuronów w powierzchownych warstwach ostrych skrawków26.</li>
	<li>Przygotuj 0,75 mL roztworu do patch-clampu zawierającego czerwony fluorofor (np. Alexa-594) oraz zielony syntetyczny wskaźnik wapnia (np. Oregon Green BAPTA-1; patrz Tabela 1). Dodaj biocytynę (patrz Tabela 1) do roztworu do patch-clampu, jeśli wymagana jest morfologiczna identyfikacja rejestrowanych komórek post hoc.</li>
	<li>Dostosuj osmolalność roztworu do 280 ± 5 mOsm oraz pH do 7,35 ± 0,5. Przechowuj roztwór przez cały czas w lodówce lub w lodzie. 
	UWAGA: Wybór wskaźnika wapnia powinien opierać się na jego zakresie dynamicznym oraz charakterze badanych zdarzeń Ca2+.</li>
	<li>Używając wyciągacza mikropipet, przygotuj pipety do patch-clampu z kapilar borokrzemianowych (patrz Tabela materiałów) z końcówką o średnicy ≈ 2 µm (oporność pipety 3-5 MΩ) oraz pipety stymulujące z borokrzemianowych kapilar typu theta (patrz Tabela materiałów) z końcówką o średnicy 2-5 µm. 
	UWAGA: Ustawienia wyciągacza pozwalające uzyskać pipety o określonej średnicy i kształcie będą zależeć od typu włókna wyciągacza oraz wyników testu rampy dla danego rodzaju szkła.</li>
</ol>
2. Przygotowanie skrawków hipokampa
<ol>
	<li>Zanurz mysz (P13-20; szczep i płeć myszy są określone przez badane pytanie eksperymentalne) w narkozie, podając 1 mL izofluranu naniesionego na ręcznik papierowy w komorze do narkozy inhalacyjnej. Gdy zwierzę zostanie głęboko znieczulone, co objawia się brakiem ruchu i spowolnionym oddechem, należy wyjąć je z komory i przeprowadzić dekapitację za pomocą gilotyny.</li>
	<li>Odsłoń czaszkę, rozcinając skórę małymi nożyczkami od tyłu czaszki w kierunku nosa. Użyj małych kleszczykostopów do kości, aby wykonać otwór na poziomie bregma. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj cięcie od strony ogonowej do rostralnej wzdłuż szwu strzałkowego. Kleszczykostopami chwyć tylną część każdej klapy czaszki i unieś ją do góry i na zewnątrz, aby usunąć pokrywę czaszki z każdej półkuli.</li>
	<li>Po pełnym odsłonięciu mózgu podetnij nerwy wzrokowe małą szpatułką. Wyjmij mózg z czaszki i umieść go w szalce Petri zawierającej stale napowietrzany, zimny ACSF-Sucrose (stężenie sacharozy znajduje się w Tabeli 1).
	<ol>
		<li>Jeśli wymagana jest tkanka od starszych myszy, przed wyjęciem mózgu przeprowadź perfuzję wewnątrzsercową za pomocą strzykawki (25G) wypełnionej 20 mL lodowatego ACSF-Sucrose, aby uzyskać wysokiej jakości skrawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj skrawki hipokampa z wyjętego mózgu zwierzęcia.
	<ol>
		<li>Pozostaw mózg do schłodzenia przez około 2 min. Połóż kawałek papieru filtrowanego na szalce Petri z lodem, a następnie przenieś mózg na papier filtracyjny. Rozdziel obie półkule.</li>
		<li>Przyklej rozdzielone półkule (orientacja jest określona przez cel eksperymentalny, aby uzyskać skrawki koronalne, poprzeczne lub poziome) do stołu wibratomu i zanurz je w kuwecie wibratomu wypełnionej lodowatym, napowietrzanym ACSF-Sucrose. Wykonaj skrawki o grubości 300 µm w temperaturze około 1 °C, korzystając z chłodziarki wibratomu lub umieszczając lód wokół kuwety wibratomu.</li>
		<li>Za pomocą płaskiego pędzla zbierz skrawki zawierające hipokamp (do 6 skrawków na półkulę) do kąpieli zawierającej napowietrzany ACSF-Recovery podgrzany do 37 °C.</li>
		<li>Pozostaw skrawki w kąpieli ACSF-Recovery na co najmniej 45 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rejestracje patch-clamp w konfiguracji whole-cell
<ol>
	<li>Umieść skrawek hipokampa w komorze znajdującej się pod obiektywem (powiększenie: 40x, apertura numeryczna: 0,8) dwufotonowego mikroskopu skaningowego. Stale perfunduj komorę natlenionym ACSF-Normal podgrzanym do 30-32 °C z przepływem 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Użyj kontrastu interferencyjnego w podczerwieni (IR-DIC) lub mikroskopii Dodt-SGC, aby zlokalizować interesującą komórkę na podstawie jej wielkości, kształtu i położenia. 
	UWAGA: W zależności od docelowej populacji neuronów można zastosować transgeniczny model mysi, aby łatwiej zlokalizować interesujące komórki. W takim przypadku krok ten można zastąpić użyciem fluorescencyjnego źródła światła.</li>
	<li>Napełnij pipetę stymulującą roztworem ACSF-Normal zawierającym czerwony fluorofor (np. Alexa-594).</li>
	<li>Ustaw pipetę stymulującą (podłączoną do jednostki stymulacji elektrycznej) nad skrawkiem tak, aby jej końcówka znajdowała się w tym samym obszarze co interesująca komórka.</li>
	<li>Po napełnieniu pipety patch roztworem do patchowania i przymocowaniu jej do głowicy (head stage), ustaw ją nad skrawkiem tak, aby końcówka znajdowała się bezpośrednio nad interesującą komórką.</li>
	<li>Zamocuj strzykawkę w trójdrożnym kurku i połącz ją z pipetą patch za pomocą plastikowej rurki. Za pomocą strzykawki wprowadź stałe nadciśnienie do pipety patch (≈ 0,1 mL). Pozostaw kurek w pozycji „zamkniętej”.</li>
	<li>Aktywuj moduł oprogramowania sterującego wzmacniaczem i przełącz na tryb clampowania napięcia (voltage-clamp), klikając przycisk „VC”. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych (np. clampex) w celu rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych i kliknij ikonę „Membrane Test”, aby program stale wysyłał prostokątny impuls napięcia (5 mV, 10 ms), co jest niezbędne do monitorowania zmian oporności pipety.</li>
	<li>Obniżaj pipetę patch, aż znajdzie się ona bezpośrednio nad docelową komórką. Po zetknięciu z błoną komórkową zdejmij ciśnienie, przekręcając kurek do pozycji „otwartej”. 
	UWAGA: Kontakt z błoną komórkową rozpoznaje się po niewielkim wzroście oporności pipety (≈ 0,2 MΩ) oraz powstaniu niewielkiego w wgłębienia w komórce wywołanego nadciśnieniem.</li>
	<li>Zastosuj lekkie podciśnienie w pipecie patch za pomocą pustej strzykawki zamocowanej w kurku, aż oporność pipety podawana przez oprogramowanie osiągnie 1 GΩ. W oknie „Membrane Test” oprogramowania do akwizycji danych ustaw clampowanie komórki na poziomie -60 mV.</li>
	<li>Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż do otwarcia komórki i uzyskania konfiguracji whole-cell. Rozpoznanie tego stanu komórki opiera się na nagłej zmianie oporności pipety (z 1 GΩ do 70-500 MΩ w zależności od typu interneuronu) oraz pojawieniu się dużych przejściowych prądów pojemnościowych w oknie „Membrane Test”.</li>
</ol>
4. Dwufotonowe obrazowanie Ca2+
<ol>
	<li>W przypadku zainteresowania pobudzeniowymi odpowiedziami postsynaptycznymi, należy dodać do kąpieli ACSF bloker receptora GABAA gabazynę (10 µM) oraz bloker receptora GABAB CGP55845 (2 µM).</li>
	<li>W module oprogramowania sterującego wzmacniaczem należy ustawić konfigurację patch na clamp prądowy, klikając przycisk „CC”, a następnie zarejestrować wzorzec wyładowań komórki w odpowiedzi na somatyczne wstrzyknięcia prądu depolarzyzującego (0,8-1,0 nA, 1 s). Należy odczekać co najmniej 30 min, aby komórka wypełniła się wskaźnikami obecnymi w roztworze do patchowania. 
	UWAGA: Wzorzec wyładowań i właściwości aktywne komórki mogą posłużyć do identyfikacji jej podtypu; np. komórek o szybkim tempie wyładowań (fast-spiking). Ważne jest, aby stężenie wskaźnika ustabilizowało się poprzez dyfuzję przed rozpoczęciem rejestracji CaTs (rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).</li>
	<li>CaTs wywołane potencjałami czynnościowymi (AP)
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów należy rozpocząć pozyskiwanie obrazów. Wyznaczyć interesujący dendryt, korzystając z sygnału fluorescencji czerwonej. Aby zapewnić widoczną odpowiedź, należy najpierw wybrać dendryt proksymalny (≤ 50 µm), ponieważ wydajność wstecznej propagacji AP może znacząco spadać wraz z odległością w interneuronach GABAergicznych22.</li>
		<li>Używając „narzędzia prostokątnego” w oprogramowaniu do akwizycji obrazów, należy powiększyć docelowy obszar i przełączyć się na tryb „xt” (linescan). Pozycjonować skan w poprzek interesującej gałęzi dendrytycznej. Za pomocą kontrolerów intensywności lasera w oprogramowaniu akwizycyjnym ustawić laser dwufotonowy na minimalnym poziomie mocy, przy którym bazowa fluorescencja zielona jest ledwie widoczna, aby uniknąć fototoksyczności.</li>
		<li>W oknie „Protocol” oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych oraz w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy utworzyć próbę rejestracji o pożądanej czasie trwania, zawierającą somatyczne wstrzyknięcie prądu o żądanej amplitudzie.
		<ol>
			<li>Używając oprogramowania do akwizycji obrazów, należy kliknąć przycisk „Start record” i rejestrować fluorescencję w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórzyć akwizycję obrazu 3-10 razy. Odczekać co najmniej 30 s między pojedynczymi skanami, aby uniknąć fotouszkodzeń. W przypadku pozyskiwania linescanów w wielu punktach wzdłuż dendrytu, należy wykonywać je w losowej kolejności, aby uniknąć efektów kolejności.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CaTs wywołane synaptycznie
	<ol>
		<li>Wyznaczyć interesujący dendryt, korzystając z sygnału fluorescencji czerwonej.</li>
		<li>Ustawić pipetę stymulującą na powierzchni skrawka powyżej interesującego dendrytu. Powoli opuścić pipetę stymulującą na miejsce, minimalizując ruchy, aby nie zakłócić konfiguracji whole-cell. Upozycjonować pipetę w odległości 10-15 µm od dendrytu.</li>
		<li>Aby zwizualizować lokalizację synaptycznych mikrodomen w dendrytach bezkolczystych, w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy przełączyć się na tryb „xt'” (linescan) i ustawić linię wzdłuż interesującej gałęzi dendrytycznej.</li>
		<li>W oknie „Protocol” (oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych) oraz w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy utworzyć próbę rejestracji, która uruchamia jednostkę stymulującą po rozpoczęciu próby.</li>
		<li>Używając oprogramowania do akwizycji, należy kliknąć przycisk „Start record”, aby skanować wzdłuż dendrytu w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórzyć akwizycję 3-5 razy, odczekując 30 s między skanami, aby zapobiec fotouszkodzeniom. 
		UWAGA: Długość skanu można dostosować w zależności od kinetyki wywołanego zdarzenia, ale powinna być ona zminimalizowana, aby zapobiec fotouszkodzeniom (rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.5.5 w różnych warunkach (np. różna intensywność/długość stymulacji, wprowadzenie blokera farmakologicznego, itp.) w zależności od konkretnego stawianego pytania badawczego.</li>
		<li>Przerwać akwizycję, gdy komórka wykazuje oznaki pogarszającego się stanu: depolaryzacja poniżej -45 mV, wzrost bazowego poziomu Ca2+, pogorszenie morfologiczne dendrytów (np. pęcherzykowanie, fragmentacja; rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).</li>
		<li>Aby uzyskać wstępne informacje o morfologii komórki i zachować zapis lokalizacji pipety stymulującej, należy wykonać stos Z (Z-stack) komórki w kanale czerwonym. Używając oprogramowania do akwizycji w trybie „xyz'”, należy ustawić górną i dolną granicę stosu tak, aby zobrazować całą komórkę wraz ze wszystkimi wypustkami. Ustawić wielkość kroku („step size”) na 1 µm i rozpocząć akwizycję stosu przyciskiem „Start record”.</li>
		<li>Po zakończeniu akwizycji stosu Z należy użyć opcji „Maximum projection” w oprogramowaniu, aby nałożyć na siebie wszystkie płaszczyzny ogniskowe stosu i zweryfikować jakość akwizycji. Następnie należy powoli wycofać pipetę patchującą ze skrawka.</li>
		<li>Aby utrwalić skrawek do post hoc identyfikacji morfologicznej, należy szybko usunąć skrawek z kąpieli za pomocą płaskiego pędzla malarskiego i umieścić go między dwoma papierami filtrującymi w szalce Petri wypełnionej ACSF. Zastąpić ACSF 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) i pozostawić szalkę w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C lub w lodówce przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Immunohistochemia do morfologicznej identyfikacji zarejestrowanych komórek post hoc
UWAGA: Po jednej nocnej fiksacji w PFA, skrawek można przechowywać w buforze fosforanowym (PB) z azotkiem sodu (0,5%) przez okres do 1 miesiąca.
<ol>
	<li>Umieścić skrawek w roztworze soli buforowanej Trisem (TBS) z Triton X-100 (0,3%) i przeprowadzić 4 przemycia (po 5-10 min każde).</li>
	<li>Umieścić skrawek w TBS-Triton 0,3% z 10% normalnym surowicą kozią (NGS) na 1 h.</li>
	<li>Umieścić skrawek w TBS-Triton 0,3% z 1% NGS i fluorochromem sprzężonym ze streptawidyną (np. streptawidyną sprzężoną z Alexa Fluor 546, 1:200) i inkubować przez noc.</li>
	<li>Przemyć 4 razy (po 5-10 min) w TBS.</li>
	<li>Zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych i obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby uzyskać pełną rekonstrukcję komórki, należy zebrać stos Z-stack (wielkość kroku: 1 µm) przy użyciu obiektywu 20x. Do obrazowania znacznika sprzężonego z Alexa-546 należy użyć lasera 543 nm i zestawu filtrów detekcyjnych 515-560 nm.</li>
</ol>
6. Analiza CaTs
<ol>
	<li>Wyodrębnij wartości fluorescencji z obszarów zainteresowania (ROI) na obrazach linescan z kanałów czerwonego i zielonego, a następnie oblicz średnią wartości z wielu powtórzeń dla każdego warunku w celu redukcji szumów. 
	UWAGA: Gdy akwizycja linescan jest przeprowadzana wzdłuż dendrytu, możliwe jest wyodrębnienie danych z wielu obszarów ROI, które mogą odpowiadać dendrytycznym mikodomenom (2-5 µm), co pozwala na badanie kompartymentacji sygnału Ca2+.</li>
	<li>Dla każdego ROI wyraź zmiany amplitudy Ca2+ jako: 
	<img alt="Równanie termodynamiczne ΔG/R = (G-G₀)/R dla analizy procesu chemicznego." src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	UWAGA: W tym przypadku G to wartość fluorescencji z kanału zielonego; G0 to bazowa wartość fluorescencji z kanału zielonego w okresie przedstymulacyjnym; R to wartość fluorescencji z kanału czerwonego18. Ponieważ wzbudzenie dwufotonowe jest silnie zlokalizowane i nie generuje znaczącego tła, odejmowanie fluorescencji tła nie jest wymagane.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li>
<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
<li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2%2B+signaling+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li>
<li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thespread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+release+of+Ca2%2B+from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li>
<li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca%282%2B%29+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites%3A+contribution+of+Ca2%2B-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li>
<li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones%3A+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li>
<li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5(2004).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777761">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225093837_Functional_compartmentalisation_and_regulation_of_postsynaptic_Ca2_transients_in_inhibitory_interneurons">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li>
<li>Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+%28IS3%29+cells+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li>
<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
<li>Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons%3A+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259(2012).</li>
<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda pokazuje, w jaki sposób połączenie obrazowania dwufotonowego Ca2 + i elektrofizjologii patch-clamp może być wykorzystane do badania dendrytycznej sygnalizacji Ca2 + w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu. Metoda ta pozwala na monitorowanie zarówno lokalnych podwyższeń Ca2+ wywołanych stymulacją elektryczną lub wsteczną propagacją AP w segmentach dendrytycznych, jak i odpowiedzi somatycznej komórki. To sprawia, że jest to doskonałe narzędzie do badan...

Wkład neuronu w aktywność sieci jest w dużej mierze zdeterminowany przez dynamiczną naturę sygnałów synaptycznych, które otrzymuje. Tradycyjnie, dominująca metoda charakteryzowania aktywności synaptycznej w neuronach opierała się na somatycznych zapisach patch-clamp całych komórek prądów postsynaptycznych wywołanych przez elektryczną stymulację aksonów przejścia. Jednak w tym przypadku tylko aktywność synaps położonych proksymalnie jest podawana zgodnie z prawdą1. Ponadto, aby ocenić mechanizmy specyficzne dla synaps, wykorzystano nagrania z par neuronów i dendrytów w określonej lokalizacji, aby ukierunkować odpowiednio na synapsy będące przedmiotem zainteresowania i mechanizmy integracji dendrytycznej. Duży przełom w dziedzinie fizjologii synaps został osiągnięty dzięki mariażowi technik optycznych i elektrofizjologicznych. Laserowa mikroskopia skaningowa z wzbudzeniem dwufotonowym (2PLSM) w połączeniu z obrazowaniem Ca2 + i narzędziami optogenetycznymi może ujawnić ogromne szczegóły dynamicznej organizacji aktywności synaptycznej w określonych połączeniach neuronalnych w wycinkach mózgu in vitro i in vivo.
Kilka kluczowych zalet sprawiło, że 2PLSM wyróżnia się na tle konwencjonalnej, jednofotonowej mikroskopii wzbudzenia2: (1) ze względu na nieliniową naturę wzbudzenia dwufotonowego, fluorescencja jest generowana tylko w objętości ogniskowej, a wszystkie emitowane fotony reprezentują użyteczne sygnały (nie ma potrzeby stosowania otworków); (2) dłuższe fale, stosowane w 2PLSM, skuteczniej przenikają do tkanki rozpraszającej; Ponadto rozproszone fotony są zbyt rozcieńczone, aby wytworzyć wzbudzenie dwufotonowe i fluorescencję tła; (3) Fotouszkodzenia i fototoksyczność są również ograniczone do płaszczyzny ogniskowej. Dlatego, pomimo wysokich kosztów systemów 2-fotonowych w porównaniu z konwencjonalnymi mikroskopami konfokalnymi, 2PLSM pozostaje metodą z wyboru do wysokorozdzielczych badań struktury i funkcji neuronów w grubej żywej tkance.
Pierwszym zastosowaniem 2PLSM w tkance rozpraszającej było zobrazowanie struktury i funkcji kolców dendrytycznych3. 2PLSM w połączeniu z obrazowaniem Ca2+ ujawniło, że kolce funkcjonują jako izolowane przedziały biochemiczne. Ponieważ w wielu typach neuronów istnieje zgodność jeden do jednego między kolcami a poszczególnymi synapsami4, dwufotonowe obrazowanie Ca2+ wkrótce stało się użytecznym narzędziem raportującym aktywność poszczególnych synaps w nienaruszonej tkance5,6,7,8. Co więcej, obrazowanie Ca2+ oparte na 2PLSM zostało z powodzeniem wykorzystane do monitorowania aktywności pojedynczych kanałów wapniowych i nieliniowych interakcji między przewodnictwem wewnętrznym i synaptycznym, a także do oceny zależnej od stanu i aktywności regulacji sygnalizacji Ca2+ w dendrytach neuronalnych5,6,7,8,9,10,11.
Wapń jest wszechobecnym wewnątrzkomórkowym drugim przekaźnikiem, a jego subkomórkowa organizacja czasoprzestrzenna determinuje kierunek reakcji fizjologicznych, od zmian w sile synaps do regulacji kanałów jonowych, wzrostu dendrytów i kręgosłupa, a także śmierci i przeżycia komórek. Endrytyczne podwyższenie Ca2+ następuje poprzez aktywację wielu szlaków. Potencjały czynnościowe (AP), rozchodzące się wstecznie do dendrytów, otwierają bramkowane napięciem kanały wapniowe12 i wytwarzają względnie globalne stany przejściowe Ca2+ (CaT) w dendrytach i kolcach13. Transmisja synaptyczna jest związana z aktywacją postsynaptycznych receptorów przepuszczalnych Ca2+ (NMDA, Ca2+-przepuszczalny AMPA i kainian), wyzwalając synaptyczne CaTs6,14,15. Wreszcie, supraliniowe zdarzenia Ca2+ mogą być generowane w dendrytach pod pewnymi warunkami11,12,13,16.
Obrazowanie dwufotonowe Ca2+ w połączeniu z zapisami elektrofizjologicznymi typu patch-clamp wykorzystuje syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+, które są zazwyczaj dostarczane przez elektrodę krosową podczas zapisów całych komórek. Standardowa metoda ilościowego oznaczania dynamiki Ca2+ opiera się na metodzie podwójnego wskaźnika17,18. Wykorzystuje ona dwa fluorofory z dobrze oddzielonymi widmami emisyjnymi (np. połączenie czerwonego barwnika niewrażliwego naCa2+ z zielonymi wskaźnikamiCa2+, takimi jak Oregon Green BAPTA-1 lub Fluo-4) i ma kilka zalet w porównaniu z metodą jednowskaźnikową. Po pierwsze, barwnik niewrażliwy na Ca2 + jest używany do zlokalizowania małych struktur zainteresowania (gałęzie dendrytyczne i kolce), w których zostanie przeprowadzone obrazowanie Ca2 +. Po drugie, stosunek między zmianą fluorescencji zielonej i czerwonej (ΔG/R) jest obliczany jako miara [Ca2+], która jest w dużej mierze niewrażliwa na zmiany podstawowej fluorescencji spowodowane wahaniami [Ca2+]017,18. Ponadto zmiany fluorescencji można skalibrować pod względem bezwzględnych stężeń Ca2+ 19.
Ogólnym problemem podczas przeprowadzania eksperymentów z obrazowaniem dwufotonowym Ca2+ w ostrych wycinkach jest zdrowie komórek i stabilność akwizycji obrazu ze względu na zazwyczaj używaną dużą moc lasera. Ponadto w eksperymentach obrazowania Ca2 + istnieje obawa o zaburzenia i znaczne przeszacowanie subkomórkowej dynamiki Ca2 + ze względu na fakt, że wskaźniki Ca2 + działają jak wysoce mobilne egzogenne Ca2 +. Tak więc wybór wskaźnika Ca2+ i jego stężenie zależy od typu neuronu, przewidywanej amplitudy CaT oraz od pytania eksperymentalnego.
Dostosowaliśmy metodę obrazowania dwufotonowego Ca2+ do badania fluktuacji Ca2+ w dendrytach interneuronów GABAergicznych9,10,11,20,21,22. Podczas gdy większość wczesnych badań obrazowania Ca2 + przeprowadzono w głównych neuronach, interneurony hamujące wykazują dużą różnorodność funkcjonalnych mechanizmów Ca2 +, które różnią się od tych w komórkach piramidowych20,23,24. Te specyficzne dla neuronów mechanizmy (np. przepuszczalne receptory AMPA Ca2+) mogą odgrywać określone role w regulacji aktywności komórek. Podczas gdy dendrytyczna sygnalizacja Ca2 + w interneuronach jest kuszącym celem do dalszych badań, obrazowanie dwufotonowe Ca2 + w dendrytach tych komórek stanowi dodatkowe wyzwania, od cieńszej średnicy dendrytów i braku kolców po szczególnie wysoką endogenną zdolność wiązania Ca2 +. Ponieważ nasze zainteresowania badawcze koncentrują się na badaniu interneuronów hipokampa, poniższy protokół, choć ma zastosowanie do różnych populacji neuronów, został dostosowany do radzenia sobie z tymi wyzwaniami.
Ten protokół został wykonany za pomocą komercyjnego konfokalnego mikroskopu dwufotonowego, który był wyposażony w dwa zewnętrzne, niedeskanowane detektory (NDD), modulator elektrooptyczny (EOM) i kontrast gradientu skanowania Dodt (SGC) i zainstalowany na stole optycznym. Mikroskop był sprzężony z wielofotonowym laserem Ti:Sapphire z blokadą trybu 800 nm (> 3 W, 140 impulsów fs, częstotliwość powtarzania 80 Hz). System obrazowania został wyposażony w standardowe stanowisko do elektrofizjologii, w tym komorę perfuzyjną z kontrolą temperatury, platformę translacyjną z dwoma mikromanipulatorami, sterowany komputerowo wzmacniacz mikroelektrod, digitizer, jednostkę stymulacyjną i oprogramowanie do akwizycji danych.

<table><tbody><tr><td>Szczep zwierzęcy: Mysz CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 chlorowodorek</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Proszek paraformaldehydowy, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Glukonian potasu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Trizma&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Fosforan sodu jednozasadowy monohydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazyd</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazyna)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Adenozynotrifosforan (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanozyna (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Sól dwu(trisowa) fosfokreatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Alexa-546 sprzężona ze streptawidyną ThermoFisher</td><td></td><td>Scientific S11225</td><td></td></tr><tr><td> Łatka Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Kapilary ze szkła borokrzemianowego Theta</td><td>Instrument Sutter</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Konfokalny mikroskop wielofotonowy TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Szafirowy laser wielofotonowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spójne oprogramowanie do akwizycji obrazowania LAS AF Kontroler</td> temperatury <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Digitizer</td><td>Urządzenia</td><td></td><td></td> molekularne</tr><tr><td> Konfokalne Tłumacz</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Izolator bodźców prądu stałego</td><td>Świat Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wibraplane Stół optyczny Systemy</td><td></td><td></td> <td>kinetyczne</td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Obrazowanie wapnia (Ca2+) jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w dendrytach neuronalnych. Wahania Ca2+ mogą występować poprzez różne mechanizmy błonowe i wewnątrzkomórkowe i odgrywać kluczową rolę w indukcji plastyczności synaptycznej i regulacji pobudliwości dendrytycznej. W związku z tym możliwość rejestrowania różnych typów sygnałów Ca2+ w gałęziach dendrytycznych jest cenna dla grup badających, w jaki sposób dendryty integrują informacje. Pojawienie się mikroskopii dwufotonowej znacznie ułatwiło takie badania, rozwiązując problemy związane z obrazowaniem w żywych tkankach, takie jak rozpraszanie światła i fotouszkodzenia. Ponadto, dzięki połączeniu konwencjonalnych technik elektrofizjologicznych z dwufotonowym obrazowaniemCa2+, możliwe jest badanie lokalnych fluktuacji Ca2+ w dendrytach neuronalnych równolegle z zapisami aktywności synaptycznej w somie. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać tę metodę do badania dynamiki lokalnych stanów przejściowych Ca2+ (CaT) w dendrytach interneuronów hamujących GABA-ergicznych. Metoda może być również zastosowana do badania dendrytycznej sygnalizacji Ca2 + w różnych typach neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Stosując przedstawiony tutaj protokół, zarejestrowaliśmy sygnały CaTs wywołane wstrzyknięciem prądu do somy oraz stymulacją elektryczną dendrytów interneuronów warstwy oriens/alveus w obszarze CA1 hipokampa. Po wykonaniu patch-clampu neuronu, zidentyfikowanego na podstawie jego kształtu i położenia, wykonaliśmy skany liniowe wzdłuż proksymalnego dendrytu w wielu punktach w określonych odległościach od somy (Rysunek 1A). Zaobserwowaliśmy spadek amplitudy CaTs ...

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wzrostu stężenia wapnia w dendrytach neuronalnych w odpowiedzi na różne paradygmaty stymulacji przy użyciu zapisów patch-clamp z całych komórek w somie neuronalnej równolegle z dwufotonowym obrazowaniem wapnia w dendrytach. Metoda ta może być stosowana do monitorowania sygnalizacji wapniowej w małych przedziałach dendrytycznych, co pozwala na dokładną obserwację procesów zachodzących w gałęziach dendrytycznych podczas integracji wejść synaptycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obserwację wzorców sygnalizacji wapniowej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej i swoistości.Umieść mózg myszy na szalce Petriego zawierającej stale natlenioną, zimną sacharozę ACSF. Aby przygotować plastry hipokampa z wyekstrahowanego mózgu, pozwól mózgowi schłodzić się przez około dwie minuty. Następnie umieść kawałek bibuły filtracyjnej na wypełnionej lodem szalce Petriego i przenieś mózg na bibułę filtracyjną.Następnie podziel mózg na dwie półkule. Przyklej wycięte półkule do wibratomicznej platformy do cięcia i zanurz ją w tacy do cięcia wypełnionej lodowato natlenioną sacharozą ACSF. Następnie pokrój plastry o grubości 300 mikrometrów w temperaturze jednego stopnia Celsjusza za pomocą chłodziarki wibratomu lub umieść lód wokół tacki na wibratomy.Za pomocą pędzla przenieś plastry zawierające hipokamp do kąpieli z natlenionym odzyskiem ACSF podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Na tym etapie przenieś wycinek hipokampa do kąpieli pod obiektywem laserowego mikroskopu dwufotonowego. Ciągle perfundować kąpiel natlenizowanym ACSF-normal.Następnie użyj mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej w podczerwieni, aby zlokalizować interesującą komórkę na podstawie jej rozmiaru, kształtu i położenia. Następnie napełnij pipetę stymulującą roztworem ACSF zawierającym czerwony fluorofor. Opuść go na wierzch wycinka, tak aby końcówka znajdowała się w tym samym obszarze co komórka zainteresowania.Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem plastra i przymocuj ją do stopnia głównego. Umieść go nad plasterkiem tak, aby jego końcówka znajdowała się bezpośrednio nad komórką zainteresowania. Następnie włóż strzykawkę do trójdrożnego kranu i podłącz ją do pipety z plastrem za pomocą plastikowej rurki.Wstrzykiwać stałe nadciśnienie do pipety z plastrem i utrzymywać kran w pozycji zamkniętej. Następnie otwórz moduł oprogramowania sterującego wzmacniaczem MultiClamp i przełącz się w tryb Voltage Clamp, klikając przycisk VC. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych Clampex do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych i kliknij ikonę testu membranowego, aby wysłać impuls o stałym napięciu kwadratowym w celu monitorowania zmian oporu pipety.Teraz opuść pipetę z plastrem, aż znajdzie się na docelowej komórce. Po zetknięciu się z błoną komórkową usuń ciśnienie, obracając kran do pozycji otwartej. Następnie należy zastosować lekkie podciśnienie do pipety z plastrem za pomocą pustej strzykawki włożonej w kran do momentu, aż opór pipety osiągnie jeden gigaom.W oknie Membrane Test (Test membrany) oprogramowania do akwizycji danych clamp ogniwo przy ujemnym napięciu 60 miliwoltów. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż opór pipety spadnie i zostanie osiągnięta konfiguracja całej kuwety. W module oprogramowania sterującego wzmacniaczem MultiClamp ustaw konfigurację łaty na cęgi prądowe, klikając przycisk IC i zapisz właściwości membrany w odpowiedzi na somatyczne wstrzyknięcia prądów hiperpolaryzujących i depolaryzujących.Odczekać co najmniej 30 minut, aż komórka zostanie wypełniona wskaźnikami obecnymi w roztworze plastru. Aby uzyskać obrazy, zlokalizuj interesujący nas dendryt za pomocą sygnału czerwonej fluorescencji. Zapewnij widoczną odpowiedź, wybierając proksymalny dendryt krótszy niż 50 mikrometrów, ponieważ wydajność wstecznej propagacji AP może znacznie spaść wraz z odległością w interneuronach GABA-ergicznych i przełącz się w tryb xt.Za pomocą regulatorów intensywności lasera ustaw laser dwufotonowy na minimalny poziom mocy, w którym podstawowa zielona fluorescencja jest tylko nieznacznie widoczna, aby uniknąć fototoksyczności. Następnie, w oknie protokołu oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych Clampex i oprogramowaniu do akwizycji obrazu, utwórz próbę nagrania o żądanym czasie trwania, zawierającą wstrzyknięcie prądu somatycznego o pożądanej amplitudzie. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie i uzyskaj fluorescencję w sposób ciągły przez jedną do dwóch sekund.Powtórz akwizycję obrazu od trzech do 10 razy. Odczekaj co najmniej 30 sekund między pojedynczymi skanami, aby uniknąć fotouszkodzenia. Aby zarejestrować dendrytyczne stany przejściowe wapnia indukowane stymulacją elektryczną, zlokalizuj interesujący nas dendryt za pomocą sygnału czerwonej fluorescencji.Umieść pipetę stymulującą na powierzchni plastra powyżej interesującego nas dendrytu. Powoli opuść pipetę stymulacyjną na odległość od 10 do 15 mikrometrów od dendrytu, minimalizując ruch, aby uniknąć zakłócenia konfiguracji całej komórki. Aby zobrazować lokalizację mikrodomen synaptycznych w neuronach aspinycznych, w oprogramowaniu do akwizycji obrazu przełącz się w tryb xt i ustaw linię wzdłuż interesującej nas gałęzi dendrytycznej.W oknie Protokół utwórz próbę nagrania, która wyzwala stymulację. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, skanuj wzdłuż dendrytu w sposób ciągły przez jedną do dwóch sekund. Powtórz akwizycję od trzech do pięciu razy, odczekując 30 sekund między skanowaniami, aby zapobiec fotouszkodzeniu.Aby uzyskać wstępne informacje na temat morfologii komórki i prowadzić rejestr lokalizacji pipety stymulacyjnej, należy uzyskać stos Z komórki w kanale czerwonym. Korzystając z oprogramowania do akwizycji w trybie xyz, ustaw górny i dolny limit stosu, aby zobrazować całą komórkę ze wszystkimi uwzględnionymi procesami. Następnie ustaw rozmiar kroku na jeden mikrometr i zainicjuj akwizycję stosu za pomocą przycisku Rozpocznij nagrywanie.Po zakończeniu akwizycji stosu Z użyj opcji Maksymalna projekcja w oprogramowaniu, aby nałożyć wszystkie plany ogniskowe stosu i zweryfikować jakość akwizycji. Następnie powoli wyjmij pipetę z plastrem z plastrem. Aby utrwalić plasterek w celu identyfikacji morfologicznej post hoc, szybko wyjmij plasterek z kąpieli za pomocą pędzla i umieść go między dwiema bibułami filtracyjnymi na szalce Petriego wypełnionej ACSF.Zastąp ACSF 4% roztworem paraformaldehydu i pozostaw naczynie na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na tym rysunku maksymalna projekcja dwufotonowego stosu Z pokazuje połatany interneuron wypełniony Alexą-594. Białe groty strzałek wskazują na położenie zakończeń aksonalnych w warstwie piramidalnej, co sugeruje, że interneuron jest komórką koszyczkową.Rysunek ten przedstawia gałąź dendrytyczną, w pobliżu której umieszczono elektrodę stymulującą. Linia przerywana pokazuje lokalizację skanowania linii. Poniższe obrazy ilustrują wynik skanowania linii w kanałach czerwonym i zielonym.Wzrost zielonej fluorescencji w czasie stymulacji wskazuje na wzrost stężenia wapnia w tym obszarze. Obrazy można łączyć w mniejsze segmenty, co pozwala na analizę rozkładu odpowiedzi. Widoczne tutaj ślady pokazują stany przejściowe wapnia wywołane w różnych segmentach w odpowiedzi na stymulację elektryczną zarejestrowaną na poziomie somatycznym podczas badania obrazowego.Amplituda stanów przejściowych wapnia maleje wraz z odległością od centralnego hotspotu, co wskazuje, że odpowiedź jest zlokalizowana przestrzennie. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie barwników wrażliwych na napięcie lub optogenetyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalne zmiany potencjału pamięci w gałęziach dendrytycznych lub integracja określonych danych wejściowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować zależne od aktywności fluktuacje wapnia w dendrytach neuronalnych za pomocą kombinacji technik optofizjologicznych, które będą przydatne do zbadania zawiłości integracji i plastyczności wejść dendrytycznych.

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Ten film demonstruje protokół rejestracji całej komórki i dwufotonowego obrazowania wapnia w wycinkach hipokampa mózgu. Metoda ta pozwala na badanie dynamiki lokalnych stanów przejściowychCa2+ (CaT) w dendrytach różnych typów neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Ustalenie konfiguracji całej komórki do dwufotonowego obrazowania wapnia wycinków mózgu

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania wapnia w dendrytach neuronów w wycinkach mózgu myszy. Technika łączy rejestrację patch-clamp z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, umożliwiając szczegółową analizę sygnałów wapniowych podczas integracji synaptycznej.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów