Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca²⁺ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie wzrostu stężenia wapnia w dendrytach neuronalnych w odpowiedzi na różne paradygmaty stymulacji przy użyciu zapisów patch-clamp z całych komórek w somie neuronalnej równolegle z dwufotonowym obrazowaniem wapnia w dendrytach. Metoda ta może być stosowana do monitorowania sygnalizacji wapniowej w małych przedziałach dendrytycznych, co pozwala na dokładną obserwację procesów zachodzących w gałęziach dendrytycznych podczas integracji wejść synaptycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obserwację wzorców sygnalizacji wapniowej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej i swoistości.

Umieść mózg myszy na szalce Petriego zawierającej stale natlenioną, zimną sacharozę ACSF. Aby przygotować plastry hipokampa z wyekstrahowanego mózgu, pozwól mózgowi schłodzić się przez około dwie minuty. Następnie umieść kawałek bibuły filtracyjnej na wypełnionej lodem szalce Petriego i przenieś mózg na bibułę filtracyjną.

Następnie podziel mózg na dwie półkule. Przyklej wycięte półkule do wibratomicznej platformy do cięcia i zanurz ją w tacy do cięcia wypełnionej lodowato natlenioną sacharozą ACSF. Następnie pokrój plastry o grubości 300 mikrometrów w temperaturze jednego stopnia Celsjusza za pomocą chłodziarki wibratomu lub umieść lód wokół tacki na wibratomy.

Za pomocą pędzla przenieś plastry zawierające hipokamp do kąpieli z natlenionym odzyskiem ACSF podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Na tym etapie przenieś wycinek hipokampa do kąpieli pod obiektywem laserowego mikroskopu dwufotonowego. Ciągle perfundować kąpiel natlenizowanym ACSF-normal.

Następnie użyj mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej w podczerwieni, aby zlokalizować interesującą komórkę na podstawie jej rozmiaru, kształtu i położenia. Następnie napełnij pipetę stymulującą roztworem ACSF zawierającym czerwony fluorofor. Opuść go na wierzch wycinka, tak aby końcówka znajdowała się w tym samym obszarze co komórka zainteresowania.

Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem plastra i przymocuj ją do stopnia głównego. Umieść go nad plasterkiem tak, aby jego końcówka znajdowała się bezpośrednio nad komórką zainteresowania. Następnie włóż strzykawkę do trójdrożnego kranu i podłącz ją do pipety z plastrem za pomocą plastikowej rurki.

Wstrzykiwać stałe nadciśnienie do pipety z plastrem i utrzymywać kran w pozycji zamkniętej. Następnie otwórz moduł oprogramowania sterującego wzmacniaczem MultiClamp i przełącz się w tryb Voltage Clamp, klikając przycisk VC. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych Clampex do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych i kliknij ikonę testu membranowego, aby wysłać impuls o stałym napięciu kwadratowym w celu monitorowania zmian oporu pipety.

Teraz opuść pipetę z plastrem, aż znajdzie się na docelowej komórce. Po zetknięciu się z błoną komórkową usuń ciśnienie, obracając kran do pozycji otwartej. Następnie należy zastosować lekkie podciśnienie do pipety z plastrem za pomocą pustej strzykawki włożonej w kran do momentu, aż opór pipety osiągnie jeden gigaom.

W oknie Membrane Test (Test membrany) oprogramowania do akwizycji danych clamp ogniwo przy ujemnym napięciu 60 miliwoltów. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż opór pipety spadnie i zostanie osiągnięta konfiguracja całej kuwety. W module oprogramowania sterującego wzmacniaczem MultiClamp ustaw konfigurację łaty na cęgi prądowe, klikając przycisk IC i zapisz właściwości membrany w odpowiedzi na somatyczne wstrzyknięcia prądów hiperpolaryzujących i depolaryzujących.

Odczekać co najmniej 30 minut, aż komórka zostanie wypełniona wskaźnikami obecnymi w roztworze plastru. Aby uzyskać obrazy, zlokalizuj interesujący nas dendryt za pomocą sygnału czerwonej fluorescencji. Zapewnij widoczną odpowiedź, wybierając proksymalny dendryt krótszy niż 50 mikrometrów, ponieważ wydajność wstecznej propagacji AP może znacznie spaść wraz z odległością w interneuronach GABA-ergicznych i przełącz się w tryb xt.

Za pomocą regulatorów intensywności lasera ustaw laser dwufotonowy na minimalny poziom mocy, w którym podstawowa zielona fluorescencja jest tylko nieznacznie widoczna, aby uniknąć fototoksyczności. Następnie, w oknie protokołu oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych Clampex i oprogramowaniu do akwizycji obrazu, utwórz próbę nagrania o żądanym czasie trwania, zawierającą wstrzyknięcie prądu somatycznego o pożądanej amplitudzie. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie i uzyskaj fluorescencję w sposób ciągły przez jedną do dwóch sekund.

Powtórz akwizycję obrazu od trzech do 10 razy. Odczekaj co najmniej 30 sekund między pojedynczymi skanami, aby uniknąć fotouszkodzenia. Aby zarejestrować dendrytyczne stany przejściowe wapnia indukowane stymulacją elektryczną, zlokalizuj interesujący nas dendryt za pomocą sygnału czerwonej fluorescencji.

Umieść pipetę stymulującą na powierzchni plastra powyżej interesującego nas dendrytu. Powoli opuść pipetę stymulacyjną na odległość od 10 do 15 mikrometrów od dendrytu, minimalizując ruch, aby uniknąć zakłócenia konfiguracji całej komórki. Aby zobrazować lokalizację mikrodomen synaptycznych w neuronach aspinycznych, w oprogramowaniu do akwizycji obrazu przełącz się w tryb xt i ustaw linię wzdłuż interesującej nas gałęzi dendrytycznej.

W oknie Protokół utwórz próbę nagrania, która wyzwala stymulację. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, skanuj wzdłuż dendrytu w sposób ciągły przez jedną do dwóch sekund. Powtórz akwizycję od trzech do pięciu razy, odczekując 30 sekund między skanowaniami, aby zapobiec fotouszkodzeniu.

Aby uzyskać wstępne informacje na temat morfologii komórki i prowadzić rejestr lokalizacji pipety stymulacyjnej, należy uzyskać stos Z komórki w kanale czerwonym. Korzystając z oprogramowania do akwizycji w trybie xyz, ustaw górny i dolny limit stosu, aby zobrazować całą komórkę ze wszystkimi uwzględnionymi procesami. Następnie ustaw rozmiar kroku na jeden mikrometr i zainicjuj akwizycję stosu za pomocą przycisku Rozpocznij nagrywanie.

Po zakończeniu akwizycji stosu Z użyj opcji Maksymalna projekcja w oprogramowaniu, aby nałożyć wszystkie plany ogniskowe stosu i zweryfikować jakość akwizycji. Następnie powoli wyjmij pipetę z plastrem z plastrem. Aby utrwalić plasterek w celu identyfikacji morfologicznej post hoc, szybko wyjmij plasterek z kąpieli za pomocą pędzla i umieść go między dwiema bibułami filtracyjnymi na szalce Petriego wypełnionej ACSF.

Zastąp ACSF 4% roztworem paraformaldehydu i pozostaw naczynie na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na tym rysunku maksymalna projekcja dwufotonowego stosu Z pokazuje połatany interneuron wypełniony Alexą-594. Białe groty strzałek wskazują na położenie zakończeń aksonalnych w warstwie piramidalnej, co sugeruje, że interneuron jest komórką koszyczkową.

Rysunek ten przedstawia gałąź dendrytyczną, w pobliżu której umieszczono elektrodę stymulującą. Linia przerywana pokazuje lokalizację skanowania linii. Poniższe obrazy ilustrują wynik skanowania linii w kanałach czerwonym i zielonym.

Wzrost zielonej fluorescencji w czasie stymulacji wskazuje na wzrost stężenia wapnia w tym obszarze. Obrazy można łączyć w mniejsze segmenty, co pozwala na analizę rozkładu odpowiedzi. Widoczne tutaj ślady pokazują stany przejściowe wapnia wywołane w różnych segmentach w odpowiedzi na stymulację elektryczną zarejestrowaną na poziomie somatycznym podczas badania obrazowego.

Amplituda stanów przejściowych wapnia maleje wraz z odległością od centralnego hotspotu, co wskazuje, że odpowiedź jest zlokalizowana przestrzennie. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie barwników wrażliwych na napięcie lub optogenetyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalne zmiany potencjału pamięci w gałęziach dendrytycznych lub integracja określonych danych wejściowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować zależne od aktywności fluktuacje wapnia w dendrytach neuronalnych za pomocą kombinacji technik optofizjologicznych, które będą przydatne do zbadania zawiłości integracji i plastyczności wejść dendrytycznych.