Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Ogólnym celem tego ilościowego testu genu reporterowego opartego na komórkach dla gamma-sekretazy jest zbadanie zróżnicowanego wpływu domniemanych modulatorów gamma-sekretazy na rozszczepienie, w którym pośredniczy gamma-sekretaza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Alzheimera, takie jak identyfikacja nowych modulatorów gamma-sekretazy w leczeniu choroby Alzheimera. Zaletą tej techniki jest to, że jest to bardzo wydajny system testowy i może łatwo identyfikować modulatory gamma-sekretazy.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera poprzez potencjalne odkrycie leków przeciw chorobie Alzheimera o minimalnych skutkach ubocznych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat selektywności substratowej gamma-sekretazy. Może być również stosowany do badań nad innymi chorobami, takimi jak nerwiak zarodkowy.

Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć problemy ze starannym usunięciem i dodaniem pożywki do hodowli komórkowej do 96 mikropłytek, ponieważ zbyt duże zakłócenia mogą skomplikować końcowe wyniki. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek NG i CG, zgodnie z odniesieniem w protokole tekstowym. Policz komórki NG lub CG za pomocą hemocytometru.

Następnie wysiewaj komórki w 20 000 komórek na studzienkę na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę w pożywce wzrostowej. Przenieś mikropłytki do nawilżonego inkubatora dwutlenku węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji usuń 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej z każdej studzienki.

Dodać 100 mikrolitrów na studzienkę pożywki wzrostowej zawierającej dwa mikrogramy na mililitr tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem, dwoma mikromolowymi CL-387, 785, dwoma mikromolowymi DAPT lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1 / ErbB2. Inkubować leczone komórki i mikropłytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć 150 mikrolitrów pożywki wzrostowej na studzienkę z mikropłytek.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy. Następnie przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy świetlika za pomocą predefiniowanego programu zapisanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.

Najpierw otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. Następnie z menu Narzędzie wybierz opcję Luminometria. W ustawieniu Parameters (Parametry) wybierz No Filter (Brak filtra) dla filtra emisji, zaznacz Normal (Normalny) dla przysłony emisyjnej, wprowadź jeden dla czasu zliczania i kliknij OK, aby ustawić odczyt luminescencji.

Na karcie Sterowanie instrumentem przewiń listę aktywnych protokołów i wybierz wstępnie zapisany protokół do odczytu luminescencji. Na karcie Wyświetlanie na żywo zdefiniuj skalę z menu rozwijanego i wybierz opcję Logarytm lub Liniowy jako typ. Na karcie Temperatura wybierz opcję Wyłącz dla ogrzewania płytowego.

Na koniec kliknij przycisk Start, aby wykonać odczyt luminescencji. Wyeksportuj wyniki do formatu arkusza kalkulacyjnego za pomocą Eksploratora wbudowanego w oprogramowanie sterujące. Oszacuj luminescencję tła z komórek CG lub NG potraktowanych pożywką wzrostową, która nie zawiera tetracykliny.

Zdefiniuj sygnał luminescencyjny emitowany przez komórki CG lub NG traktowane 0,1% DMSO w pożywce wzrostowej zawierającej jeden mikrogram na mililitr samej tetracykliny jako 100% względną aktywność gamma-sekretazy. Na koniec znormalizuj sygnały lucyferazy z komórek CG lub NG, które są hodowane z pożywką wzrostową zawierającą tetracyklinę i CL-387, 785 lub DAPT do sygnału lucyferazy emitowanego przez komórki CG lub NG traktowane DMSO. Pokazane tutaj są reprezentatywne wyniki demonstrujące ilościowe pomiary rozszczepienia APP-C99 gamma-sekretazy w komórkach CG.

Komórki traktowano jednym mikromolem CL-387, 785 lub DAPT w obecności jednego mikrograma na mililitr tetracykliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Luminescencję pochodzącą z proteolizy C99-GV za pośrednictwem gamma-sekretazy określono ilościowo po dodaniu 100 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy. Sygnał lucyferazy emitowany przez komórki traktowane samym nośnikiem został ustawiony jako 100% luminescencja względna.

Reprezentatywne wyniki demonstrujące ilościowe pomiary rozszczepienia N-delta-E promieniowania gamma-sekretazą w komórkach NG przedstawiono tutaj. Podobnie, komórki traktowano jednym mikromolem CL-387, 785 lub DAPT w obecności jednego mikrograma na mililitr tetracykliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Luminescencję pochodzącą z proteolizy N-delta-E-GV za pośrednictwem gamma-sekretazy określono ilościowo po dodaniu 100 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy.

Sygnał lucyferazy emitowany przez komórki traktowane samym nośnikiem został ustawiony jako 100% luminescencja względna. Po opanowaniu ta technika wymaga jedynie praktycznego czasu od jednej do dwóch godzin, w oczekiwaniu na liczbę związków do zbadania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się chorobą Alzheimera do zbadania genetycznego i chemicznego modyfikatora gamma-sekretazy w poszukiwaniu nowych metod leczenia choroby Alzheimera.