Name: Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj ilościowe pomiary aktywności γ-sekretazy w komórkowych testach reporterowych lucyferazy. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych modulatorów γ-sekretazy w badaniach nad chorobą Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Głównej Placówce Instytutu Biologii Komórkowej i Organizmów, Academia Sinica, za wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 103-2320-B-001-016-MY3 do Y.-F. L.), Program for Translational Innovation of Biopharmaceutical Development – Technology Supporting Platform Axis Scheme (NP7 do Y.-F.L.) oraz Academia Sinica (do Y.-F.L.).

1. Pomiar sygnałów reporterowych lucyferazy, które odpowiadają rozszczepieniu γ-sekretazy APP-C99 lub NΔE
UWAGA: Szczegółowe opisy generacji komórek CG i NG można znaleźć w poprzednich publikacjach20,21.
<ol>
	<li>Wysiewać komórki NG lub CG (20 000 komórek/studzienkę) na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 μl/studzienkę w pożywce wzrostowej, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml blasticydyny, 250 μg/ml antybiotyku (np. zeocyny) i 200 μg/ml higromycyny B.
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Przenieść mikropłytki do nawilżonego inkubatora CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń 100 μl podłoża wzrostowego z każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 100 μl/basenik pożywki wzrostowej zawierającej 2 μg/ml tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetylo-L-alanylo)]-S-fenyloglicyny t-butylestru (DAPT) lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1/ErbB2.</li>
	<li>Inkubować poddane działaniu CG lub NG komórki w mikropłytkach w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć 150 μl/studzienkę z mikropłytek.</li>
	<li>Dodać 50 μl/dostór do oznaczania lucyferazy (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
	<ol>
		<li>Utrzymuj mikropłytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy świetlika (FL) za pomocą wstępnie zdefiniowanego programu przechowywanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów).</li>
		<li>Z menu "Narzędzie" wybierz "Luminometria".
		<ol>
			<li>W ustawieniach "Parametry" wybierz "Brak filtra" dla filtra emisji, zaznacz "Normalny" dla przysłony emisyjnej, wprowadź "1" dla czasu zliczania i kliknij "OK", aby ustawić odczyt luminescencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W zakładce "Sterowanie instrumentem" przewiń listę aktywnych protokołów i wybierz wstępnie zapisany protokół do odczytu luminescencji.</li>
		<li>W zakładce "Wyświetlanie na żywo" zdefiniuj skalę z listy rozwijanej i wybierz "Logarytm" lub "Liniowy" jako Typ.</li>
		<li>W zakładce "Temperatura" wybierz opcję "Wyłącz" dla ogrzewania płytowego.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Start", aby wykonać odczyt luminescencji.</li>
		<li>W razie potrzeby wyeksportuj wyniki do formatu arkusza kalkulacyjnego za pomocą "Eksploratora" wbudowanego w oprogramowanie sterujące</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja aktywności γ-sekretazy
<ol>
	<li>Zdefiniuj sygnał luminescencyjny emitowany przez komórki CG lub NG traktowane 0,1% DMSO w pożywce wzrostowej zawierającej 1 μg / ml samej tetracykliny jako 100% względną aktywność γ-sekretazy.
	<ol>
		<li>Oszacuj luminescencję tła z komórek CG lub NG, traktując komórki pożywką wzrostową, która nie zawiera tetracykliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Normalizuj sygnały lucyferazy z komórek CG lub NG, które są hodowane z pożywką wzrostową zawierającą 1 μg / ml tetracykliny i 1 μM CL-387,785 lub 1 μM DAPT z sygnałem lucyferazy emitowanym przez komórki CG lub NG traktowane DMSO (100% względna aktywność γ-sekretazy, jak określono w 2.1).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obiecujące wyniki badania fazy 1b immunoterapii aducanumabem w chorobie Alzheimera zdecydowanie ustaliły kluczową rolę Aβ w patogenezie AD22 i sugerują, że podejścia anty-Aβ są nadal realną strategią rozwoju leków przeciw AD. W tym miejscu opisujemy testy komórkowe do ilościowego określania proteolizy APP-C99 i NΔE katalizowanej γ-sekretazą przy użyciu systemów reporterowych lucyferazy świetlika. APP-C99 i NΔE to dwa najlepiej zbadane substraty γ-sekretazy i razem reprezentują zarówno patogenną, j...

Oligomeryczne formy β amyloidu (Aβ) są uważane za główną przyczynę neurodegeneracji w mózgach pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera (AD)1. Peptydy Aβ są wytwarzane w wyniku stopniowego rozszczepienia białka prekursorowego amyloidu (APP), najpierw przez β-sekretazę, a następnie przez γ-sekretazę2. W ciągu ostatniej dekady podejścia terapeutyczne do leczenia AD koncentrowały się na zapobieganiu produkcji Aβ3. Większość badań koncentrowała się na zwiększeniu aktywności α-sekretazy, co może wykluczyć rozszczepienie APP przez γ-sekretazę, a tym samym zmniejszyć produkcję Aβ, lub na hamowaniu aktywności β-i/lub γ-sekretazy4. Niestety, nieselektywne hamowanie β- lub γ-sekretaz powoduje nieuniknione skutki uboczne, które wynikają z zakłóceń w funkcjonowaniu innych fizjologicznych substratów β- i γ-sekretazy5,6. Jeśli chodzi o inhibitory γ-sekretazy, ostatnie badania wykazały odkrycie szeregu chemicznych i genetycznych modulatorów, które mogą regulować produkcję Aβ, wywierając jednocześnie znikomy wpływ na podstawowe przetwarzanie za pośrednictwem γ sekretazy w Notch7,8,9,10,11,12, jednak skuteczne terapie nie zostały jeszcze opracowane. W związku z tym uzasadnione są dalsze systematyczne badania przesiewowe w celu odkrycia nowych modyfikatorów genetycznych i chemicznych, które mogą selektywnie modulować przetwarzanie APP za pośrednictwem γ-sekretazy.
γ-sekretaza jest znana z tego, że rozszczepia ponad 90 różnych białek zakotwiczonych w błonie. Wśród tych substratów znajduje się Notch, którego aktywność ma kluczowe znaczenie dla określania losu i różnicowania komórek podczas rozwoju13. Selektywne modulowanie przetwarzania APP katalizowanego γ-sekretazą przy braku wpływu na przetwarzanie Notch będzie miało zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania skutków ubocznych związanych z Notch inhibitorów γ-sekretazy, a ta selektywność jest uważana za główny czynnik, który będzie dyktował biologiczną skuteczność potencjalnych modulatorów γ-sekretazy w przewlekłym leczeniu AD. Stwierdzono wiele pochodnych arylosulfonamidu, takich jak GSI-953 (begacestat) i BMS-708163 (awagacestat), które wykazują silne i selektywne hamowanie γ-sekretazy14,15. Poprzednie badanie wykazało, że różnicowe hamowanie rozszczepienia γ-sekretazy APP i Notch można zaobserwować za pomocą ilościowego testu opartego na teście ELISA w połączeniu z walidacją in vivo przy użyciu danio pręgowanego16. Ponadto ustanowiono paradygmaty testów komórkowych w celu zbadania potencjalnej selektywności substratowej γ-sekretazy w stosunku do APP i Notch17,18. Korzystając z protokołów podobnych do opisanych w niniejszym dokumencie, niedawno odkryliśmy nową klasę (D)-leucynamidów, które silnie modulują rozszczepienie γ-sekretazy APP z selektywnością oszczędzającą Notch19. Łącznie ten zbiór badań dostarcza dowodu słuszności koncepcji potwierdzającego pogląd, że selektywność/dostępność substratu γ-sekretazy może podlegać modulacji chemicznej i weryfikacji eksperymentalnej. Jednak te platformy testowe często opierają się na odczytach o stosunkowo niskiej przepustowości i pracochłonnych podejściach, które mogą nie spełniać standardów przemysłowych dla programów odkrywania leków.
Niedawno przeprowadziliśmy testy genów reporterowych lucyferazy opartej na komórkach, które mogą ilościowo określić aktywność katalityczną γ-sekretazy w stosunku do dwóch różnych substratów, 99-aminokwasowego C-końcowego fragmentu APP (APP-C99) i peptydu Notch z delecją w domenie zewnątrzkomórkowej (NΔE). Zarówno APP-C99, jak i NΔE są szeroko stosowane jako bezpośrednie substraty γ-sekretazy w różnych testach. Aby wygenerować jednorodne i spójne testy genu reporterowego lucyferazy dla rozszczepienia γ-sekretazy APP-C99 lub NΔE, wygenerowaliśmy jedną stabilną linię komórkową (CG) pochodzącą z HEK, która konstytutywnie wyraża reporter lucyferazy świetlika napędzany promotorem Gal4 (Gal4-Luc) i białko fuzyjne APP-C99 znakowane Gal4 / VP16 (C99-GV). Ponadto wygenerowaliśmy kolejną stabilną linię komórkową (NG) pochodzącą z HEK, która konstytutywnie wyraża Gal4-Luc i znakowane Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). Korzystając z tych nowatorskich, specyficznych dla substratu testów γ-sekretazy, zapewniamy teraz metodę ilościowego określania i rozróżniania aktywności katalitycznej γ-sekretazy w kierunku różnych substratów (APP-C99 w komórkach CG lub NΔE w komórkach NG). Co więcej, specyficzne dla substratu testy γ sekretazy zaprojektowano tak, aby sprzyjały platformom przesiewowym o wysokiej zawartości. Te nowo wygenerowane testy γ-sekretazy mogą utorować drogę do odkrycia nowych modulatorów γ-sekretazy, które mogą poprawić funkcje poznawcze poprzez hamowanie produkcji Aβ bez wywoływania niepożądanego hamowania Notch w leczeniu choroby Alzheimera nowej generacji.

<table><tbody><tr><td>Czytnik płytek luminescencyjnych VictorLight</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Klasa II, Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego typu 2</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>główny składnik pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytomer</td><td>Sigma-Aldrich</td> BR717805 96-dołkowa mikropłytka <td>Aldricha</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania lucyferazy Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżony inkubator CO2</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa T-REx293</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 wersja oprogramowania 3.0</td><td>Oprogramowanie sterujące instrumentem PerkinElmer</td><td></td><td>czytnika mikropłytek luminescencyjnych</td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Opracowaliśmy parę testów genów reporterowych opartych na komórkach, aby ilościowo mierzyć rozszczepienie γ sekretazy różnych substratów. W tym manuskrypcie opisano procedury, które mogą być stosowane do monitorowania rozszczepienia APP-C99 lub Notch za pośrednictwem γ-sekretazy, przy użyciu systemu reporterowego lucyferazy świetlika napędzanego przez promotor Gal4. Testy te zostały ustalone przez stabilną kotransfekcję komórek HEK293 z genem reporterowym lucyferazy napędzanym przez Gal4 i albo znakowanym Gal4 / VP16 C-końcowym fragmentem APP (APP-C99; CG) lub Notch-ΔE oznaczone Gal4/VP16 (NΔE; Ogniwa NG). Korzystając z tych testów reporterowych równolegle, wykazaliśmy, że inhibitor ErbB2, CL-387,785, może preferencyjnie hamować rozszczepienie γ-sekretazy APP-C99 w komórkach CG, ale nie NΔE w komórkach NG. Zróżnicowane odpowiedzi wykazywane przez komórki CG i NG po potraktowaniu CL-387,785 reprezentują preferowaną cechę modulatorów γ-sekretazy, a odpowiedzi te są w wyraźnym kontraście do pan-inhibicji γ-sekretazy indukowanej przez DAPT. Nasze badania dostarczają bezpośrednich dowodów na to, że aktywność γ-sekretazy w stosunku do różnych substratów może być różnicowana w kontekście komórkowym. Te nowe testy mogą być zatem użytecznymi narzędziami w odkrywaniu leków na lepsze terapie choroby Alzheimera.

Hamowanie ErbB2 przez CL-387,785 może różnicowo promować przetwarzanie APP-C99 przez γ-sekretazę bez wpływu na rozszczepianie Notch 
Aby opracować test komórkowy umożliwiający ilościowy pomiar proteolitycznego rozszczepiania konkretnego substratu γ-sekretazy, wygenerowano linię komórkową CG pochodzącą z komórek HEK293 poprzez stabilną kotransfekcję indukowalnego tetracykliną APP-C99 z Gal4/VP16 przyłączonym do końca C oraz genu reporte...

Udało nam się wygenerować dwa testy γ sekretazy specyficzne dla substratu. Oba przedstawione tutaj testy komórkowe mają na celu ilościowe określenie aktywności enzymatycznej γ-sekretazy poprzez wyniki reporterów lucyferazy świetlika.

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Ogólnym celem tego ilościowego testu genu reporterowego opartego na komórkach dla gamma-sekretazy jest zbadanie zróżnicowanego wpływu domniemanych modulatorów gamma-sekretazy na rozszczepienie, w którym pośredniczy gamma-sekretaza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Alzheimera, takie jak identyfikacja nowych modulatorów gamma-sekretazy w leczeniu choroby Alzheimera. Zaletą tej techniki jest to, że jest to bardzo wydajny system testowy i może łatwo identyfikować modulatory gamma-sekretazy.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera poprzez potencjalne odkrycie leków przeciw chorobie Alzheimera o minimalnych skutkach ubocznych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat selektywności substratowej gamma-sekretazy. Może być również stosowany do badań nad innymi chorobami, takimi jak nerwiak zarodkowy.Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć problemy ze starannym usunięciem i dodaniem pożywki do hodowli komórkowej do 96 mikropłytek, ponieważ zbyt duże zakłócenia mogą skomplikować końcowe wyniki. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek NG i CG, zgodnie z odniesieniem w protokole tekstowym. Policz komórki NG lub CG za pomocą hemocytometru.Następnie wysiewaj komórki w 20 000 komórek na studzienkę na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę w pożywce wzrostowej. Przenieś mikropłytki do nawilżonego inkubatora dwutlenku węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji usuń 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej z każdej studzienki.Dodać 100 mikrolitrów na studzienkę pożywki wzrostowej zawierającej dwa mikrogramy na mililitr tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem, dwoma mikromolowymi CL-387, 785, dwoma mikromolowymi DAPT lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1 / ErbB2. Inkubować leczone komórki i mikropłytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć 150 mikrolitrów pożywki wzrostowej na studzienkę z mikropłytek.Następnie dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy. Następnie przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy świetlika za pomocą predefiniowanego programu zapisanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.Najpierw otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. Następnie z menu Narzędzie wybierz opcję Luminometria. W ustawieniu Parameters (Parametry) wybierz No Filter (Brak filtra) dla filtra emisji, zaznacz Normal (Normalny) dla przysłony emisyjnej, wprowadź jeden dla czasu zliczania i kliknij OK, aby ustawić odczyt luminescencji.Na karcie Sterowanie instrumentem przewiń listę aktywnych protokołów i wybierz wstępnie zapisany protokół do odczytu luminescencji. Na karcie Wyświetlanie na żywo zdefiniuj skalę z menu rozwijanego i wybierz opcję Logarytm lub Liniowy jako typ. Na karcie Temperatura wybierz opcję Wyłącz dla ogrzewania płytowego.Na koniec kliknij przycisk Start, aby wykonać odczyt luminescencji. Wyeksportuj wyniki do formatu arkusza kalkulacyjnego za pomocą Eksploratora wbudowanego w oprogramowanie sterujące. Oszacuj luminescencję tła z komórek CG lub NG potraktowanych pożywką wzrostową, która nie zawiera tetracykliny.Zdefiniuj sygnał luminescencyjny emitowany przez komórki CG lub NG traktowane 0,1% DMSO w pożywce wzrostowej zawierającej jeden mikrogram na mililitr samej tetracykliny jako 100% względną aktywność gamma-sekretazy. Na koniec znormalizuj sygnały lucyferazy z komórek CG lub NG, które są hodowane z pożywką wzrostową zawierającą tetracyklinę i CL-387, 785 lub DAPT do sygnału lucyferazy emitowanego przez komórki CG lub NG traktowane DMSO. Pokazane tutaj są reprezentatywne wyniki demonstrujące ilościowe pomiary rozszczepienia APP-C99 gamma-sekretazy w komórkach CG.Komórki traktowano jednym mikromolem CL-387, 785 lub DAPT w obecności jednego mikrograma na mililitr tetracykliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Luminescencję pochodzącą z proteolizy C99-GV za pośrednictwem gamma-sekretazy określono ilościowo po dodaniu 100 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy. Sygnał lucyferazy emitowany przez komórki traktowane samym nośnikiem został ustawiony jako 100% luminescencja względna.Reprezentatywne wyniki demonstrujące ilościowe pomiary rozszczepienia N-delta-E promieniowania gamma-sekretazą w komórkach NG przedstawiono tutaj. Podobnie, komórki traktowano jednym mikromolem CL-387, 785 lub DAPT w obecności jednego mikrograma na mililitr tetracykliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Luminescencję pochodzącą z proteolizy N-delta-E-GV za pośrednictwem gamma-sekretazy określono ilościowo po dodaniu 100 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy.Sygnał lucyferazy emitowany przez komórki traktowane samym nośnikiem został ustawiony jako 100% luminescencja względna. Po opanowaniu ta technika wymaga jedynie praktycznego czasu od jednej do dwóch godzin, w oczekiwaniu na liczbę związków do zbadania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się chorobą Alzheimera do zbadania genetycznego i chemicznego modyfikatora gamma-sekretazy w poszukiwaniu nowych metod leczenia choroby Alzheimera.

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia procedurę pomiaru aktywności γ-sekretazy w genetycznie zmodyfikowanych komórkach ludzkich przy użyciu systemu indukowanego tetracykliną. Proces ten polega na indukowaniu ekspresji genu APP za pomocą tetracykliny, generowaniu peptydów β amyloidu i aktywacji produkcji lucyferazy. Następnie mierzy się bioluminescencję wynikającą z reakcji lucyferazy-substratu, odzwierciedlającą aktywność γ-sekretazy.

Test lucyferazy do pomiaru aktywności γ-sekretazy w komórkach ludzkich

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Opisujemy metodę ilościowego określania agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek. Nasz protokół szczegółowo opisuje indukowane lentiwirusem stabilne generowanie linii komórkowych, automatyczne obrazowanie konfokalne i analizę obrazu agregatów białkowych. Jako przykładowe zastosowanie, zbadaliśmy wpływ małych cząsteczek na promowanie agregacji SOD1 w sposób zależny od czasu i dawki.

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj ilościowe pomiary aktywności γ-sekretazy w komórkowych testach reporterowych lucyferazy. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych modulatorów γ-sekretazy w badaniach nad chorobą Alzheimera.

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów