Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie modelu regresji do przewidywania parazytemii malarii przy użyciu spektroskopii ATR-FTIR z wieloczynnikową analizą danych. Ta metoda może pomóc w przyspieszeniu diagnostyki przyłóżkowej, co może pomóc w poprawie wyników leczenia pacjentów w przyszłości. Główną zaletą tej techniki jest to, że chociaż zbudowanie modelu może zająć trochę czasu, jest on wysoce przenośny, przyjazny dla użytkownika, bardzo czuły i tani

Chociaż metoda ta umożliwia ilościowe określenie pasożytów malarii, może być również stosowana do obserwacji fenotypowej odpowiedzi na zmiany środowiskowe, takie jak zmiany w składzie pasożytów spowodowane środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Pomysł rozwinął się na podstawie prac, które przeprowadziliśmy w Australijskim Synchrotronie na komórkach zakażonych malarią. Działo się to na poziomie pojedynczej komórki.

Stamtąd zdecydowaliśmy się użyć spektroskopii ATR-FTIR do opracowania testu diagnostycznego. Przed rozpoczęciem procedury synchronizacji należy przeprowadzić hodowlę 30 mililitrów pasożytów Plasmodium falciparum szczepu 3D7 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą automatycznej pipety ponownie zawieś kulturę i przenieś ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Odwirować kulturę w temperaturze od 300 do 400 g w standardowych warunkach laboratoryjnych przez pięć minut. Usunąć supernatant, pobierając go za pomocą automatycznej pipety, nie naruszając osadu. Wyrzuć odpady do 10% roztworu wybielacza.

Powoli dodaj 12 do 15 mililitrów 4% roztworu sorbitolu do osadu i wymieszaj kulturę, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po 15 minutach odwiruj kulturę przez pięć minut.

Użyj automatycznej pipety, aby usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj 10 do 15 mililitrów 0,9% soli fizjologicznej do osadu i wymieszaj roztwór, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna. Powtórz wirowanie i płukanie roztworem soli jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie pozostałości sorbitolu.

Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj podstawowe krwinki czerwone lub erytrocyty. Usuń supernatant i przemyj 0,9% solą fizjologiczną w sumie trzy razy. Odwirować podstawowe krwinki czerwone i kulturę w ilości 300-400 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant z każdej probówki.

Oznaczyć osiem probówek do mikrowirówek zgodnie ze wskazaniami. Następnie użyj pipety o pojemności od 0,2 do 20 mikrolitrów, aby dodać odpowiednią ilość kultury do każdej probówki. Następnie dodaj odpowiednią ilość podstawowych erytrocytów do każdej probówki, aby uzyskać pożądane rozcieńczenie parazytemii.

Odwirować świeżą krew dawcy zebraną w probówkach przeciwzakrzepowych w stężeniu 1 200 g i w standardowych warunkach laboratoryjnych przez 10 minut. Usuń osocze, pobierając je pipetą i wrzucając do 10% roztworu wybielacza. Dodaj 900 mikrolitrów izolowanych krwinek czerwonych dawcy do każdej probówki mikrowirówki i dokładnie wymieszaj, odwracając 10 razy.

Do uzyskania widma zostanie użyty prosty spektrometr ATR-FTIR z transformacją Fouriera z tłumieniem całkowitego odbicia i transformacją Fouriera lub ATR-FTIR. Przygotuj i wyczyść kryształ za pomocą niestrzępiących się chusteczek zwilżonych ultraczystą wodą, aby delikatnie wyszorować kryształ okrężnymi ruchami. Następnie użyj kolejnej niestrzępiącej się chusteczki, aby dokładnie wysuszyć kryształ.

Wykonaj pomiar tła powietrza, klikając Pomiar tła. Co 20 minut czyść kryształ i powtarzaj ten pomiar. Otwórz podgląd na żywo, klikając przycisk Podgląd.

Obserwuj płaską, poziomą linię podstawową, która wskazuje, że kryształ jest czysty. Odpipetuj 10 mikrolitrów wody dejonizowanej bezpośrednio na środek kryształu i kliknij przycisk Zmierz próbkę. Wysusz kryształ za pomocą niestrzępiącej się chusteczki i delikatnych ruchów okrężnych.

Odpipetuj 10 mikrolitrów próbki na środek kryształu i kliknij przycisk Zmierz próbkę. Oczyść kryształ między próbkami. W tej demonstracji wielowymiarowa analiza danych zostanie przeprowadzona przy użyciu programu MATLAB.

Aby rozpocząć przetwarzanie danych, wprowadź analizę w oknie poleceń, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole X, aby znaleźć pozycję Importuj dane. Wybierz typ pliku do analizy.

Zaimportuj widma próbki, wody i linii bazowej jako zestawy danych do miejsca pracy, zaznaczając osobno wszystkie widma w każdym zestawie, klikając przycisk Otwórz i nadając każdemu zestawowi krótką nazwę. Kliknij pozycję Nowa zmienna w oknie poleceń i nadaj wektorowi nazwę Parasitemia. Wprowadź parazytemię każdej próbki.

Kliknij prawym przyciskiem myszy pole X, aby znaleźć pozycję Kreśl dane. Kliknij ikonę Kreśl dane, aby wykreślić dane. Sprawdź widma pod kątem efektów pary wodnej, klikając przycisk Zoom i powiększając od 1 800 do 1 400 na centymetr, najwyraźniej obserwowane jako krótkie, ostre, wąskie piki wzdłuż zboczy pasm Amidu I i Amidu II.

W przypadku ekstremalnej pary wodnej otwórz kartę Edytuj dane przetwarzania wstępnego i wybierz opcję Wygładzanie. Zmniejsz hałas i/lub silny wpływ pary wodnej poprzez wygładzenie widma próbki i wody. Po dalszym przetwarzaniu danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym otwórz kartę Edytuj dane, a następnie w zmiennych kolumnowych wybierz od 2980 do 2800 centymetrów i od 1750 do 850 centymetrów, upewniając się, że zaznaczone są tylko ich pola.

Dane są teraz gotowe do analizy. Aby przeprowadzić analizę składowych głównych (PCA), kliknij opcję Dekompozycja analizy i wybierz opcję PCA. Kliknij przycisk Zbuduj model.

Obserwuj granicę ufności 95%, przerywany pierścień, na wykresie wyników między PC 1 i PC 2. Użyj narzędzia Wybierz widma, aby oznaczyć widma próbki z wynikami, które występują poza limitem, jako potencjalne wartości odstające. Aby wykonać częściową regresję metodą najmniejszych kwadratów (PLSR), kliknij opcję Regresja analizy i wybierz opcję PLSR.

Kliknij prawym przyciskiem myszy blok Y i wybierz wektorowy model kompilacji Parasitemia. Przeanalizuj model regresji i wektor regresji oraz zidentyfikuj pasma biologiczne. Częściowy wykres regresji najmniejszych kwadratów erytrocytów o wzroście od zera do jednego procenta Parasitemia wygenerował wartość R-kwadrat równą 0,87 i średni kwadrat błędu walidacji krzyżowej wynoszący 0,13%Parasitemia.

Pokazuje to zdolność modelu do przewidywania parazytemii w każdej próbce ze znaną parazytemią na osi x i przewidywaną parazytemią na osi y. Powiązany współczynnik regresji opisuje wkład każdego pasma w zdolność predykcyjną modelu. Im intensywniejsza opaska, tym bardziej przyczynia się do modelu, a tym samym do tego, jak pasożyt zmienia skład chemiczny krwi.

Wyniki pokazują, że sygnał od pasożytów jest na tyle różny od erytrocytów, że można go wykorzystać do stworzenia modelu regresji liniowej do przewidywania pasożytów w przyszłych zestawach danych. Po opanowaniu technika ta może zająć mniej niż trzy minuty na próbkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o oczyszczeniu kryształów ATR z wszelkich pozostałości.

Zgodnie z tą procedurą, inne gatunki malarii, takie jak P vivax i P malariae, mogą być modelowane w celu uzyskania odpowiedzi na takie pytania, jak: Czy spektroskopia ATR-FTIR jest wystarczająco czuła, aby rozróżnić gatunki? Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biospektroskopią do badania wykrywania i kwantyfikacji innych patogenów przenoszonych przez krew, a nawet analizowania we krwi, takich jak glukoza i mocznik. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć spektroskopię ATR-FTIR i analizę NVDA, aby zbudować model regresji.

Nie zapominaj, że praca z próbkami krwi pacjenta i malarii może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przeprowadzić odpowiednie szkolenie w zakresie poziomu bezpieczeństwa biologicznego i powstrzymywania rozprzestrzeniania się wirusa.