Name: Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę wykrywania i ilościowego oznaczania Plasmodium falciparum w krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii ATR-FTIR z analizą wieloczynnikową. Ta technika umożliwia szybką diagnostykę malarii w miejscu opieki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie dla autorów zostało zapewnione przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (Future Fellowship FT120100926 do BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (grant programowy i Senior Research Fellowship dla JGB; Stypendia na początku kariery JSR; Dotacja w ramach programu wsparcia infrastruktury dla instytutów badawczych dla Instytutu Burnet) oraz dotacja na wsparcie infrastruktury operacyjnej rządu stanu Wiktoria dla Instytutu Burneta. Dziękujemy Panu Finlayowi Shanksowi za wsparcie instrumentalne.

Proszę zapoznać się z odpowiednimi Kartami Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) i zasięgnąć odpowiedniego szkolenia w zakresie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wszystkie etapy hodowli muszą być wykonywane w komorze BSL-2 przy użyciu techniki aseptycznej, co oznacza, że istnieje ryzyko narażenia na szkodliwe promieniowanie UV z etapów dekontaminacji, zranień igłą oraz potencjalnego narażenia biologicznego i infekcji, jeśli kultura pasożyta dostanie się do jakichkolwiek obrażeń. Co więcej, krew z banków krwi jest badana pod kątem tylko niektórych chorób, a potencjalne ryzyko rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez krew stanowi potencjalne ryzyko. Natychmiast wezwij pomoc medyczną w przypadku wystąpienia urazu.
1. Przygotowanie i pomiar serii rozcieńczeń pasożytów 3D7 Plasmodium falciparum 
UWAGA: Hodowla Plasmodium sp. jest bardzo wrażliwa. Używaj świeżych/nieprzeterminowanych odczynników i regularnie karmij pasożyty, zmieniając pożywkę. Karm kultury poniżej 5% parazytemii co drugi dzień; karmić kultury od 6-10% parazytemii raz lub dwa razy dziennie; i karmić kultury od 11 do 20% do 4 razy dziennie. Pasożyty, które zaczynają głodować, tracą swój kształt i zaczynają się kurczyć. W takim przypadku należy natychmiast podać i rozcieńczyć, zmieniając pożywkę i dodając podstawowe krwinki czerwone. Krew dawcy należy pobrać do probówek do pobierania krwi zawierających heparynę jako antykoagulant i zmierzyć w ciągu pierwszych 6 godzin.
<ol>
	<li>Hodowla łącznie 30 ml pasożytów Plasmodium falciparum szczepu 3D7 zgodnie ze standardowym protokołem, aż pasożyt osiągnie 10% pierścieni.</li>
	<li>Synchronizacja pasożytów
	<ol>
		<li>11 godzin po wprowadzeniu szizogenii do cyklu życiowego pasożyta ponownie zawiesić hodowlę i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą automatycznej pipety.</li>
		<li>Odwirować kulturę w temperaturze 300–400 x g i w standardowych warunkach laboratoryjnych (25°C i 100 kPa) przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant poprzez pobranie go pipetą lub za pomocą pipety Pasteura podłączonej do próżni, nie naruszając osadu. Wyrzuć odpady do 10% roztworu wybielacza.</li>
		<li>Powoli dodaj 12–15 ml 4% roztworu sorbitolu do osadu za pomocą automatycznej pipety i wymieszaj kulturę, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna.</li>
		<li>Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Odwirować kulturę przy 300–400 x g i standardowych warunkach laboratoryjnych przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Dodaj 10-15 ml 0,9% soli fizjologicznej do osadu i wymieszaj roztwór, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.6–1.2.8 jeszcze dwa razy, aby zmyć wszystkie pozostałości sorbitolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie serii rozcieńczeń parazytemii
	<ol>
		<li>Umyć podstawowe RBC jak w krokach 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Odwirować kulturę w standardowych warunkach laboratoryjnych, przechowywać erytrocyty w ilości 300–400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant, jak w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Oznacz probówki do mikrowirówek odpowiednio jako 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0,750% i 1,000%, a następnie dodaj 0,2 μl, 1 μl, 2,5 μl, 7,5 μl, 10 μl, 25 μl, 75 μl i 100 μl kultury za pomocą pipety 0,2-20 μl.</li>
		<li>Dodać 100 μl, 99 μl, 97,5 μl, 92,5 μl, 80 μl, 75 μl, 25 i 0 μl podstawowych krwinek czerwonych do probówek oznaczonych odpowiednio 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0,750% i 1,000%.</li>
		<li>Odwirować świeżą krew dawcy zebraną w probówkach przeciwzakrzepowych o stężeniu 1 200 x g i w standardowych warunkach laboratoryjnych przez 10 minut.</li>
		<li>Usunąć osocze, pobierając je pipetą i wyrzucając zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Dodać 900 μl wyizolowanych erytrocytów do każdej probówki mikrowirówki i dokładnie wymieszać, odwracając 10x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja spektralna
	<ol>
		<li>Korzystając z dołączonego programu do akwizycji spektralnej, kliknij "Konfiguracja instrumentu" i ustaw parametry zbierania danych na następujące: 128 skanów w poszukiwaniu tła; 32 skany dla próbki; i rozdzielczość do 8/cm w maksymalnym zakresie próbki instrumentu.</li>
		<li>Ustaw temperaturę spektrometru ATR-FTIR zgodnie z zaleceniami producenta lub na noc.</li>
		<li>Wyczyść kryształ, delikatnie szorując okrężnymi ruchami za pomocą niestrzępiących się chusteczek zwilżonych ultraczystą wodą. Następnie dokładnie wysusz za pomocą innej niestrzępiącej się chusteczki.</li>
		<li>Wykonaj pomiar tła powietrza, klikając "Pomiar tła". Co 20 minut czyść kryształ jak w kroku 1.4.3 i powtarzaj ten pomiar.</li>
		<li>Otwórz podgląd na żywo, klikając "Podgląd". Obserwuj płaską, poziomą linię podstawową, która wskazuje, że kryształ jest czysty.</li>
		<li>Odpipetuj 10 μl wody dejonizowanej bezpośrednio na środek kryształu i kliknij "Zmierz próbkę". Powtórzyć ten pomiar wody po co piątej próbce.</li>
		<li>Osusz kryształ za pomocą niestrzępiącej się chusteczki i delikatnych ruchów okrężnych.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl próbki i kliknąć przycisk "Zmierz próbkę".</li>
		<li>Oczyść kryształ między próbkami, jak w kroku 1.4.3.</li>
		<li>Powtarzaj tę czynność, aż uzyskane zostaną 3 powtórzenia, upewniając się, że kolejność zarówno próbek, jak i powtórzeń jest losowa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wielowymiarowa analiza danych (MVDA)
UWAGA: Przetwarzanie danych musi być przeprowadzone na całym zbiorze danych, aby uniknąć szumu i dodawania pików pochodzenia niebiologicznego. Natomiast przeanalizuj obszary istotne biologicznie: 2980-2800/cm i 1750-850/cm.
<ol>
	<li>Przetwarzanie danych 
	UWAGA: Dwa programy, np. Matlab (odtąd nazywany oprogramowaniem 1) i The Unscrambler X (odtąd określany jako oprogramowanie 2) są używane jako przykłady MVDA. Oprogramowanie 1 ma możliwość wykonywania MVDA bez dodawania graficznego interfejsu użytkownika (GUI). Zaleca się jednak zakup GUI (Table of Materials). Poniższe instrukcje odnoszące się do oprogramowania 1 zakładają, że jest ono w połączeniu z dostępnym na rynku zestawem narzędzi GUI, a przykładowy skrypt przetwarzania danych został dołączony.
	<ol>
		<li>Otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy danych wielowymiarowych, kliknij "Importuj dane" i wybierz typ pliku do analizy.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu 1 wprowadź "Analiza" w oknie poleceń, aby otworzyć GUI. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole X, aby znaleźć "Importuj dane".</li>
			<li>W oprogramowaniu 2 kliknij zakładkę "Plik", aby znaleźć "Importuj".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaimportuj widma próbki, wody i linii bazowej jako zestawy danych do obszaru roboczego, wybierając wszystkie widma w każdym zestawie osobno i klikając "Otwórz" i nadaj każdemu zestawowi krótką nazwę, np. "wat" dla zestawu danych widm wody.</li>
		<li>Wybierz nową tabelę/macierz, klikając "Nowa macierz/wektor" i wygeneruj wektor n×1, gdzie n to liczba próbek. Wprowadź parazytemię każdej próbki i nadaj wektorowi nazwę "Parasitemia".
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu 1 kliknij "Nowa zmienna" w oknie poleceń.</li>
			<li>W oprogramowaniu 2 kliknij ikonę "Nowa matryca".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykreśl dane, klikając ikonę "Wykreśl dane". Sprawdź widma pod kątem efektów pary wodnej, klikając "Zoom" i przybliżając 1800-1400/cm; najwyraźniej obserwowane jako krótkie, ostre, wąskie szczyty wzdłuż zboczy pasm amidu I i amidu II.</li>
		<li>W przypadku ekstremalnej pary wodnej otwórz zakładkę edycji/wstępnego przetwarzania danych i wybierz "Wygładzanie". Zmniejsz hałas i/lub silny wpływ pary wodnej poprzez wygładzenie próbki i widm wody przy użyciu do 25 punktów wygładzania lub zastosowanie metody korekcji pary wodnej.</li>
		<li>Skoryguj niepoziomą linię bazową, używając algorytmu korekcji linii bazowej, jeśli to konieczne, na tej samej karcie edycji/przetwarzania wstępnego danych w kroku 2.1.4.</li>
		<li>Uśrednij widma wody i skopiuj wiersze do macierzy n×m odpowiadającej przykładowemu zestawowi danych i zmniejsz ją do 70%, mnożąc ją przez 0,7.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu 1 zrób to w oknie poleceń, wprowadzając następujący skrypt "AverageWater=mean(WaterDataset)". Następnie skopiuj i wklej wiersze, aby dopasować je do przykładowego zestawu danych. Aby zmniejszyć intensywność, wprowadź "AverageWater70= AverageWater*0.70".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odejmij średnie widma wody od każdego widma próbki.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu 1 zrób to w oknie polecenia, wprowadzając następujący skrypt "WaterCorrectedData=SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Otwórz kartę edycji/wstępnego przetwarzania danych, aby zastosować drugą funkcję pochodną, a następnie znormalizuj dane, wybierając funkcję pojedynczej normalnej zmienności (SNV) i dane środka średniej.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu 1 zrób to za jednym razem. Najpierw wybierz "Pochodna" i wprowadź 25 punktów wygładzania, rząd wielomianów 3 i porządek pochodnych na zestawie próbek, używając 25 punktów wygładzania i funkcji Savitzky'ego-Golaya. Następnie wybierz "SNV" i "Mean Center". Kliknij "OK/Zastosuj".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Otwórz kartę edycji/wstępnego przetwarzania danych i w sekcji "Zmienne kolumnowe" wybierz 2,980–2,800/cm i 1,750–850/cm, upewniając się, że zaznaczone są tylko ich pola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Analiza głównych składowych (PCA)
		<ol>
			<li>Kliknij "Analiza | Dekompozycja" i wybierz opcję PCA.
			<ol>
				<li>W oprogramowaniu 1 kliknij "Zbuduj model".</li>
				<li>W oprogramowaniu 2 wprowadź metody PCA. Wprowadź optymalną liczbę głównych komponentów (PC) - w tej pracy 7- i maksymalnie 100 iteracji, a następnie wybierz krzyżową walidację dla metody walidacji. Kliknij "Uruchom".</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Zwróć uwagę na granicę ufności 95%, przerywany pierścień, na wykresie wyników między PC1 i PC2.</li>
			<li>Oznacz widma próbki wynikami, które występują poza limitem, jako potencjalne wartości odstające za pomocą narzędzia "Wybierz widma".</li>
			<li>Jeśli oznaczone widma mają wysokie wartości Hotellings, T2 i wysokie resztki Q, wykluczaj je z dalszej analizy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Częściowa regresja metodą najmniejszych kwadratów (PLS-R)
		<ol>
			<li>Kliknij "Analiza | Regresja" i wybierz "PLS-R".
			<ol>
				<li>W oprogramowaniu 1 kliknij prawym przyciskiem myszy blok Y i wybierz wektor "Parasitemia | Zbuduj model".</li>
				<li>W oprogramowaniu 2 wprowadź metody PLS-R. Wybierz wektor "Parasitemia" jako "odniesienie Y" i przykładowy zestaw danych jako "X Data Set" i wybierz walidację krzyżową jako metodę walidacji. Kliknij "Uruchom".</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przeanalizuj model regresji. Dopuszczalne są wartości R2 powyżej 0,80 i błąd średniokwadratowy wartości walidacji krzyżowej (RMSECV), które są mniejsze niż 0,1% parazytemii.</li>
			<li>Przeanalizuj wektor regresji i zidentyfikuj pasma biologiczne.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
<li>Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+threat%3A+asymptomatic+parasitemia+and+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).</li>
<li>Hanscheid, T., Grobusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+useful+is+PCR+in+the+diagnosis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">How useful is PCR in the diagnosis of malaria.</a> Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).</li>
<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
<li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Malaria+Rapid+Diagnostic+Test+Performance%3A+results+of+WHO+product+testing+of+malaria+RDTs%3A+round+6+%282014-2015%29%22">Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015)</a>. , (2014).</li>
<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model PLS-R jest nadzorowaną metodą wielowymiarową, która znajduje liniową zależność, Y=bX+E, między zmiennymi predykcyjnymi X (w tym przypadku absorbancja dla każdej liczby falowej) a zmienną ciągłą Y (w tym przypadku poziom parazytemii). Krótko mówiąc, model łączy zmienne w X, aby utworzyć nowy zestaw zmiennych utajonych (LV), które przechwytują wariancję X skorelowaną z Y, i oblicza wektor regresji (b), który pomnożony przez nowe widmo daje oszacowanie wartości y. Siłę modelu można określić na podstawie dwóch wartości...

Malaria jest jedną z najbardziej niszczycielskich chorób naszych czasów; ponad połowa populacji żyje zagrożona w regionach endemicznych i nieproporcjonalnie obciąża biednych1,2,3,4. Dużą częścią problemu są bezobjawowi nosiciele i pacjenci we wczesnym stadium choroby, którzy działają jak rezerwuary dla wektorów komarów5, powodując gwałtowne wzrosty infekcji w porze deszczowej i pozwalając im utrzymywać się w społecznościach. Malaria jest wywoływana przez pięć pasożytów Plasmodium, z których najbardziej śmiertelnym jest P. falciparum, który powoduje najcięższą postać choroby2.
Obecnie techniki diagnozowania malarii są dalekie od doskonałości. Mikroskopia optyczna, obecny złoty standard, może wykryć tylko 62-88 pasożytów/μl, w zależności od zastosowanej metody6. Ponadto, ze względu na intensywność i wysokie wymagane umiejętności, w wielu regionach mikroskopia >50% przypadków, zwłaszcza tych z niskim poziomem parazytemii2, co można bezpośrednio przypisać brakowi zasobów w okolicy i prowadzi do nadużywania leków przeciwmalarycznych. Pozostałe 2 główne metody diagnostyczne to szybkie testy diagnostyczne (RDT), które wykorzystują przeciwciała do wykrywania, oraz testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które dyskryminują i określają ilościowo pasożyty na podstawie DNA. Obecnie RDT są w stanie wykryć P. falciparum i P. vivax tylko na co najmniej 100 pasożytów/μl krwi, co powoduje, że rzadsze formy choroby nie są leczone. 7,8 W przeciwieństwie do tego, testy PCR rozróżniają i określają ilościowo różne gatunki Plasmodium przy czułości 0,0004-5 pasożytów/μL krwi. Wymaga jednak drogich odczynników, sprzętu i umiejętności technicznych, a zatem nie nadaje się do zastosowań w terenie.
Wysoce czuła, niezawodna i przystępna cenowo technika jest niezbędna do skrócenia czasu diagnozy, a tym samym poprawy wyników leczenia pacjentów i umożliwienia eliminacji chorób. Spektroskopia z transformacją Fouriera z tłumieniem całkowitego odbicia (ATR-FTIR) oferuje potencjalne rozwiązanie tego problemu. Wcześniejsze prace wykazały, że możliwe jest wykrycie i ilościowe określenie P. falciparum w utrwalonych błonach krwi metanolu, osiągając granice wykrywalności <1 pasożyta/μl krwi (<0,0002 % parazytemii)9, co jest porównywalne z metodami PCR. Ostatnie badania wykazały, że możliwe jest wykrycie i ilościowe określenie pasożytów w próbkach wodnych, a tym samym wyeliminowanie etapu fiksacji. Jednak czynniki takie jak para wodna, szum spektralny i przetwarzanie danych muszą być brane pod uwagę w celu uzyskania optymalnych wyników10.
Ten protokół ma na celu pokazanie nowym użytkownikom, jak pozyskiwać widma ATR-FTIR i przygotować model regresji do wykrywania P. falciparum z próbek krwinek czerwonych (RBC) w stanie roztworu wodnego10.

<table><tbody><tr><td>Krew dawcy</td> <td>-</td><td></td> <td>musi być pobrana przez przeszkolonego lekarza</td></tr><tr><td>Krew zapasowa</td><td>Australijski Czerwony Krzyż'</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>Burnet</td> <td>Institute-Laboratory</td> <td>Odpowiednik dzikiego szczepu</td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-hepes bez wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Porcję do probówek sokoła o pojemności 50 ml i przechowuj w zamrażarce</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Należy przefiltrować przed użyciem w hodowli</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Naczynia hodowlane</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Końcówki do pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Szkiełka</td> mikroskopowe Falcon <td>357530</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny kontroler pipet</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend X1R</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Inkubatory CO2 z bezpośrednim ciepłem</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Mikroskop lornetkowy</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Przy zakupie upewnij się, że soczewka 100x jest olejem obiektyw zanurzeniowy</td></tr><tr><td>Spektrometr Ft-IR Bruker Alpha z szybkozłączką ATR</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Pamiętaj, aby poprosić o przystawkę "Eco-ATR" przy zakupie</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych wielowymiarowych</td></tr><tr><td>Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Multivariate oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>Graficzny interfejs użytkownika dla Matlaba</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i oznaczanie ilościowe plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Demonstrujemy metodę kwantyfikacji i wykrywania pasożytów w krwinkach czerwonych (RBC) za pomocą prostego spektrometru ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared) w połączeniu z Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum zostały wyhodowane do 10% pasożytów w stadium pierścieniowym parazytemii i użyte do zwiększenia świeżych krwinek czerwonych izolowanych od dawcy w celu stworzenia serii rozcieńczeń między 0-1%. Umieszczono 10 μL każdej próbki na środek okna diamentowego ATR, aby uzyskać widmo. Dane próbki poddano obróbce w celu poprawy stosunku sygnału do szumu i usunięcia udziału wody, a następnie zastosowano drugą pochodną w celu rozwiązania cech spektralnych. Dane zostały następnie przeanalizowane przy użyciu dwóch typów MVDA: najpierw analizy głównych składowych (PCA) w celu określenia wszelkich wartości odstających, a następnie częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów (PLS-R) w celu zbudowania modelu kwantyfikacji.

Wykres częściowych najmniejszych kwadratów (PLS-R) oraz powiązany z nim wektor regresji, odpowiednio na rysunku 1a i 1b, wykazują, że sygnał pochodzący od pasożytów jest na tyle odróżnialny od sygnału RBC, że można go wykorzystać do stworzenia modelu regresji liniowej służącego do przewidywania obecności pasożytów w przyszłych zestawach danych.
Stworzono odporny, liniowy model PLS-R...

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego Plasmodium falciparum w zakażonych czerwonych krwinkach wodnych za pomocą spektrometru podczerwonego o całkowitym odbiciu i wielowymiarowej analizy danych.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie modelu regresji do przewidywania parazytemii malarii przy użyciu spektroskopii ATR-FTIR z wieloczynnikową analizą danych. Ta metoda może pomóc w przyspieszeniu diagnostyki przyłóżkowej, co może pomóc w poprawie wyników leczenia pacjentów w przyszłości. Główną zaletą tej techniki jest to, że chociaż zbudowanie modelu może zająć trochę czasu, jest on wysoce przenośny, przyjazny dla użytkownika, bardzo czuły i tani.Chociaż metoda ta umożliwia ilościowe określenie pasożytów malarii, może być również stosowana do obserwacji fenotypowej odpowiedzi na zmiany środowiskowe, takie jak zmiany w składzie pasożytów spowodowane środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Pomysł rozwinął się na podstawie prac, które przeprowadziliśmy w Australijskim Synchrotronie na komórkach zakażonych malarią. Działo się to na poziomie pojedynczej komórki.Stamtąd zdecydowaliśmy się użyć spektroskopii ATR-FTIR do opracowania testu diagnostycznego. Przed rozpoczęciem procedury synchronizacji należy przeprowadzić hodowlę 30 mililitrów pasożytów Plasmodium falciparum szczepu 3D7 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą automatycznej pipety ponownie zawieś kulturę i przenieś ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Odwirować kulturę w temperaturze od 300 do 400 g w standardowych warunkach laboratoryjnych przez pięć minut. Usunąć supernatant, pobierając go za pomocą automatycznej pipety, nie naruszając osadu. Wyrzuć odpady do 10% roztworu wybielacza.Powoli dodaj 12 do 15 mililitrów 4% roztworu sorbitolu do osadu i wymieszaj kulturę, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po 15 minutach odwiruj kulturę przez pięć minut.Użyj automatycznej pipety, aby usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj 10 do 15 mililitrów 0,9% soli fizjologicznej do osadu i wymieszaj roztwór, zamykając i odwracając probówkę, aż kultura będzie jednorodna. Powtórz wirowanie i płukanie roztworem soli jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie pozostałości sorbitolu.Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj podstawowe krwinki czerwone lub erytrocyty. Usuń supernatant i przemyj 0,9% solą fizjologiczną w sumie trzy razy. Odwirować podstawowe krwinki czerwone i kulturę w ilości 300-400 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant z każdej probówki.Oznaczyć osiem probówek do mikrowirówek zgodnie ze wskazaniami. Następnie użyj pipety o pojemności od 0,2 do 20 mikrolitrów, aby dodać odpowiednią ilość kultury do każdej probówki. Następnie dodaj odpowiednią ilość podstawowych erytrocytów do każdej probówki, aby uzyskać pożądane rozcieńczenie parazytemii.Odwirować świeżą krew dawcy zebraną w probówkach przeciwzakrzepowych w stężeniu 1 200 g i w standardowych warunkach laboratoryjnych przez 10 minut. Usuń osocze, pobierając je pipetą i wrzucając do 10% roztworu wybielacza. Dodaj 900 mikrolitrów izolowanych krwinek czerwonych dawcy do każdej probówki mikrowirówki i dokładnie wymieszaj, odwracając 10 razy.Do uzyskania widma zostanie użyty prosty spektrometr ATR-FTIR z transformacją Fouriera z tłumieniem całkowitego odbicia i transformacją Fouriera lub ATR-FTIR. Przygotuj i wyczyść kryształ za pomocą niestrzępiących się chusteczek zwilżonych ultraczystą wodą, aby delikatnie wyszorować kryształ okrężnymi ruchami. Następnie użyj kolejnej niestrzępiącej się chusteczki, aby dokładnie wysuszyć kryształ.Wykonaj pomiar tła powietrza, klikając Pomiar tła. Co 20 minut czyść kryształ i powtarzaj ten pomiar. Otwórz podgląd na żywo, klikając przycisk Podgląd.Obserwuj płaską, poziomą linię podstawową, która wskazuje, że kryształ jest czysty. Odpipetuj 10 mikrolitrów wody dejonizowanej bezpośrednio na środek kryształu i kliknij przycisk Zmierz próbkę. Wysusz kryształ za pomocą niestrzępiącej się chusteczki i delikatnych ruchów okrężnych.Odpipetuj 10 mikrolitrów próbki na środek kryształu i kliknij przycisk Zmierz próbkę. Oczyść kryształ między próbkami. W tej demonstracji wielowymiarowa analiza danych zostanie przeprowadzona przy użyciu programu MATLAB.Aby rozpocząć przetwarzanie danych, wprowadź analizę w oknie poleceń, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole X, aby znaleźć pozycję Importuj dane. Wybierz typ pliku do analizy.Zaimportuj widma próbki, wody i linii bazowej jako zestawy danych do miejsca pracy, zaznaczając osobno wszystkie widma w każdym zestawie, klikając przycisk Otwórz i nadając każdemu zestawowi krótką nazwę. Kliknij pozycję Nowa zmienna w oknie poleceń i nadaj wektorowi nazwę Parasitemia. Wprowadź parazytemię każdej próbki.Kliknij prawym przyciskiem myszy pole X, aby znaleźć pozycję Kreśl dane. Kliknij ikonę Kreśl dane, aby wykreślić dane. Sprawdź widma pod kątem efektów pary wodnej, klikając przycisk Zoom i powiększając od 1 800 do 1 400 na centymetr, najwyraźniej obserwowane jako krótkie, ostre, wąskie piki wzdłuż zboczy pasm Amidu I i Amidu II.W przypadku ekstremalnej pary wodnej otwórz kartę Edytuj dane przetwarzania wstępnego i wybierz opcję Wygładzanie. Zmniejsz hałas i/lub silny wpływ pary wodnej poprzez wygładzenie widma próbki i wody. Po dalszym przetwarzaniu danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym otwórz kartę Edytuj dane, a następnie w zmiennych kolumnowych wybierz od 2980 do 2800 centymetrów i od 1750 do 850 centymetrów, upewniając się, że zaznaczone są tylko ich pola.Dane są teraz gotowe do analizy. Aby przeprowadzić analizę składowych głównych (PCA), kliknij opcję Dekompozycja analizy i wybierz opcję PCA. Kliknij przycisk Zbuduj model.Obserwuj granicę ufności 95%, przerywany pierścień, na wykresie wyników między PC 1 i PC 2. Użyj narzędzia Wybierz widma, aby oznaczyć widma próbki z wynikami, które występują poza limitem, jako potencjalne wartości odstające. Aby wykonać częściową regresję metodą najmniejszych kwadratów (PLSR), kliknij opcję Regresja analizy i wybierz opcję PLSR.Kliknij prawym przyciskiem myszy blok Y i wybierz wektorowy model kompilacji Parasitemia. Przeanalizuj model regresji i wektor regresji oraz zidentyfikuj pasma biologiczne. Częściowy wykres regresji najmniejszych kwadratów erytrocytów o wzroście od zera do jednego procenta Parasitemia wygenerował wartość R-kwadrat równą 0,87 i średni kwadrat błędu walidacji krzyżowej wynoszący 0,13%Parasitemia.Pokazuje to zdolność modelu do przewidywania parazytemii w każdej próbce ze znaną parazytemią na osi x i przewidywaną parazytemią na osi y. Powiązany współczynnik regresji opisuje wkład każdego pasma w zdolność predykcyjną modelu. Im intensywniejsza opaska, tym bardziej przyczynia się do modelu, a tym samym do tego, jak pasożyt zmienia skład chemiczny krwi.Wyniki pokazują, że sygnał od pasożytów jest na tyle różny od erytrocytów, że można go wykorzystać do stworzenia modelu regresji liniowej do przewidywania pasożytów w przyszłych zestawach danych. Po opanowaniu technika ta może zająć mniej niż trzy minuty na próbkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o oczyszczeniu kryształów ATR z wszelkich pozostałości.Zgodnie z tą procedurą, inne gatunki malarii, takie jak P vivax i P malariae, mogą być modelowane w celu uzyskania odpowiedzi na takie pytania, jak: Czy spektroskopia ATR-FTIR jest wystarczająco czuła, aby rozróżnić gatunki? Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biospektroskopią do badania wykrywania i kwantyfikacji innych patogenów przenoszonych przez krew, a nawet analizowania we krwi, takich jak glukoza i mocznik. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć spektroskopię ATR-FTIR i analizę NVDA, aby zbudować model regresji.Nie zapominaj, że praca z próbkami krwi pacjenta i malarii może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przeprowadzić odpowiednie szkolenie w zakresie poziomu bezpieczeństwa biologicznego i powstrzymywania rozprzestrzeniania się wirusa.

detection-quantification-plasmodium-falciparum-aqueous-red-blood

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służąca do identyfikacji transkryptów mRNA w pojedynczych komórkach umożliwia analizę aktywności poligenowej, takiej jak jednoczesna transkrypcja więcej niż jednego członka wielogenowej rodziny var w erytrocytach zakażonych Plasmodium falciparum 1. Technika ta jest adaptowalna i może być stosowana w odniesieniu do różnych typów genów, komórek i organizmów.

Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) RNA

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Paramagnetyczne właściwości hemozoiny są wykorzystywane do izolowania późnych stadiów wzrostu czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum w hodowli. Metoda jest prosta i szybka i nie wpływa na późniejsze zdolności inwazyjne pasożytów.

Separacja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum w późnym stadium za pomocą środków magnetycznych

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Poznaj metodę wykrywania i ilościowego oznaczania Plasmodium falciparum w krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii ATR-FTIR z analizą wieloczynnikową. Ta technika umożliwia szybką diagnostykę malarii w miejscu opieki.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Przeglądaj więcej filmów