$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest ważną metodą określania struktury molekularnej i czystości próbek w chemii organicznej.
W spektroskopii NMR próbki są wystawione na działanie silnego pola magnetycznego. Po ekspozycji pewne jądra przechodzą lub rezonują między dyskretnymi poziomami energii. Luka energetyczna między tymi poziomami może być mierzona i wizualizowana jako widma. Dane te można wykorzystać do wyjaśnienia struktury chemicznej próbki.
Nie wszystkie jądra mają wymagane właściwości, aby być aktywnymi w NMR. Powszechnie badane izotopy to 1H, 2H, 13C, 19F i 31P.
W tym filmie przedstawimy zasady rządzące NMR, przejdziemy przez przykładowe preparaty próbek NMR z różnych etapów reakcji chemicznej i omówimy kilka zastosowań.
W przyrządzie NMR ciekły azot i hel są używane do chłodzenia magnesu nadprzewodzącego. Magnes przykłada stałe pole magnetyczne do próbki. W próbce jądra atomowe z nieparzystą liczbą protonów i/lub neutronów ustawią się albo w linii z polem, przyjmując stan o niskiej energii, albo przeciwko niemu, przyjmując stan o wysokiej energii.
Różnica energii między tymi dwoma poziomami to częstotliwość rezonansowa, która zależy od natężenia przyłożonego pola i rodzaju jądra. W przypadku magnesów stosowanych w NMR wartość ta mieści się w zakresie częstotliwości radiowej lub RF.
Cewka RF wzbudza próbkę impulsem o częstotliwości radiowej, przesuwając jądra o niskiej energii do wyższego stanu, zanim powróci z powrotem. Cewka wykrywa te zmiany namagnesowania, które są wyświetlane jako szczyty.
Siła NMR polega na jego zdolności do rozróżniania jąder – w tym przypadku wodoru – na podstawie ich środowiska chemicznego. Elektrony na sąsiednich atomach będą blokować lub "osłaniać" jądra przed częścią pola magnetycznego. To efektywne pole zmienia częstotliwość rezonansową dla poszczególnych jąder, co nazywa się przesunięciem chemicznym. W etanolu protony metylenowe, hydroksylowe i metylowe mają unikalne częstotliwości rezonansowe. Określenie obszaru pod każdym pikiem wyjaśnia liczbę każdego rodzaju protonu.
Ponieważ instrumenty o różnej sile magnetycznej będą przesuwać częstotliwości rezonansowe, są one odnoszone do standardowej cząsteczki dodanej do próbki, często tetrametylosilanu lub TMS. Przesunięcie chemiczne częstotliwości jest bardzo małe, często podawane w częściach na milion lub ppm.
W przypadku korzystania z silnego magnesu o wysokiej rozdzielczości, piki czasami dzielą się na podszczyty. Jest to spowodowane przez sąsiednie jądra, z których niektóre są ustawione w linii pola magnetycznego, inne przeciwko; dalsza zmiana pola efektywnego przyłożonego do jąder. W etanolu 2 protony metylenowe dwukrotnie rozbijają pik metylowy na tryplet, a 3 protony metylowe trzykrotnie dzielą pik metylenowy na kwartet. Odległość rozszczepienia lub sprzężenia w kształcie litery J jest związana z odległością jąder, co pomaga w odkryciu jakościowym.
Teraz, gdy rozumiesz podstawowe zasady NMR, przyjrzyjmy się przykładowej procedurze, która wykorzystuje proton NMR do monitorowania syntezy chalkonu z aldehydu i ketonu.
Zacznij od użycia pipety Pasteura, aby dodać niewielką ilość materiału wyjściowego do zlewki. Przenieść do dygestorium i rozcieńczyć materiał wyjściowy 0,7 ml deuterowanego rozpuszczalnika. Stosuje się rozpuszczalniki deuterowane, ponieważ częstotliwość rezonansowa deuteru wykracza poza zakres dla protonów.
Za pomocą pipety Pasteura dodaj 0,7 ml rozcieńczonego materiału wyjściowego do czystej probówki NMR o średnicy 5 mm, wypełniając dno na głębokość 4,5 × 5 cm. Zakryj probówkę NMR i oznacz ją. Delikatnie potrząśnij probówką, uważając, aby uniknąć kontaktu między próbką a nasadką. Następnie włóż rurkę do błystka.
Wyczyść zewnętrzną część rurki i wirówki za pomocą 2-propanolu i chusteczek laboratoryjnych. Następnie umieść zespół próbek w ograniczniku głębokości i skalibruj głębokość wsunięcia.
Po kalibracji załadować zestaw próbki do spektrometru NMR ręcznie lub za pomocą automatycznego próbnika. Na koniec użyj komputerowej stacji roboczej, aby uzyskać widmo NMR.
Wygeneruj widma NMR, korzystając z tej procedury, dla każdego z materiałów wyjściowych reakcji. Do syntezy chalkonu należy uzyskać widma zarówno dla metoksybenzaldehydu, jak i metyloacetofenonu.
Następnie należy przeprowadzić syntezę próbki, łącząc materiały wyjściowe i odczynniki w kolbie, aby rozpocząć reakcję.
W odstępach 30-minutowych usuń małą porcję mieszaniny reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodaj 3 krople do czystej probówki NMR.
Rozcieńczyć ten surowy produkt reakcji deuterowanym rozpuszczalnikiem i przygotować do NMR, stosując wcześniej opisaną procedurę.
W miarę postępu reakcji utworzy się żółty osad. Po zakończeniu reakcji przemyć i przefiltrować osad i wygenerować widma NMR dla oczyszczonego produktu reakcji.
Teraz, gdy wygenerowaliśmy widma NMR na każdym etapie reakcji chemicznej, przeanalizujmy je.
Piki widm NMR dla każdego z materiałów wyjściowych są przypisane do różnych grup protonów w cząsteczce zgodnie z ich przesunięciami chemicznymi i liczbą protonów przyczyniających się do każdego piku. Tutaj przypisujemy 4 główne grupy protonowe dla metyloacetofenonu i metoksybenzaldehydu, zwracając uwagę na pik aldehydu między 9,5 a 10,5 ppm. Porównując widma NMR surowych produktów reakcji w różnych punktach czasowych, wyjaśnia się ewolucję reakcji chemicznej, w której syntetyzuje chalkon. Na przykład pik aldehydu z materiału wyjściowego metoksybenzaldehydu jest nadal obecny po 30 minutach reakcji, ale całkowicie znika po 3 godzinach, co oznacza zakończenie reakcji.
Badając widmo oczyszczonego produktu, możemy przypisać każdy pik do grupy protonów w strukturze chalkonu. Na przykład, badając piki 3 i 4, widzimy, że ich całki są jednością, odpowiadającą grupom zawierającym tylko jeden proton.
Piki 3 i 4 to tzw. dublety wskazujące na jeden sąsiadujący proton. Oba mają stałe sprzężenia J wynoszące 16 Hz, co sugeruje, że protony są usytuowane w poprzek podwójnego wiązania E. Przypisując wszystkie piki NMR oczyszczonego produktu reakcji, potwierdzamy syntezę czystego chalkonu.
Spektroskopia NMR ma szerokie zastosowanie i znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach naukowych i medycznych.
W tym zastosowaniu protonowy NMR służy do weryfikacji syntezy i struktury zarówno diamidokarbenu, jak i mononoamidokarbiny, których widma NMR mają różne wzorce podziału pików. Karbeny te wytwarzały również pozornie różne produkty reakcji w połączeniu z białym fosforem; DAC1 wygenerował jaskrawoczerwony produkt reakcji, podczas gdy MAAC2 wytworzył jasnopomarańczowy produkt. Te różnice w produktach reakcji zostały potwierdzone przy użyciu drugiego zastosowania NMR, 31P? NMR, który generuje widma na podstawie różnic w częstotliwości rezonansowej jąder fosforu.
W tym przypadku obrazowanie magnetycznego rezonansu jądrowego (MRI) zostało wykorzystane do wygenerowania anatomicznej mapy mózgu i wybrania obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania. Następnie wykorzystano spektroskopię NMR do wygenerowania widm kluczowych metabolitów. Na koniec, za pomocą MRI, oceniono zmiany w metabolizmie mózgu w różnych warunkach eksperymentalnych.
W tej aplikacji NMR został wykorzystany do analizy właściwości wiązania i zaproponowania struktury 3D peptydu wiążącego miedź. Po pierwsze, widma NMR porównano pod kątem stanów niezwiązanych i związanych z miedzią peptydu. Następnie, przy użyciu bardziej zaawansowanych technik 2-wymiarowego NMR, oceniono różne potencjalne konformacje struktury peptydu. Wreszcie, te ograniczenia strukturalne pochodzące z NMR wykorzystano do opracowania proponowanej trójwymiarowej struktury dla niezwiązanego peptydu.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do analizy NMR. Powinieneś teraz zrozumieć podstawowe zasady stojące za generowaniem i analizą widm NMR, a także procedurę przygotowania próbki NMR.
Dzięki za oglądanie!
