Name: Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego. Technika REF umożliwia wielokrotne badanie tych samych zwierząt, zwiększając moc statystyczną badań nad patogenezą i terapią gruźlicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University. Może być wymagany przegląd i zgoda urzędnika ds. bezpieczeństwa zagrożeń biologicznych lub komitetu w Twojej instytucji. 
Uwaga: Wszystkie procedury wymagają zabezpieczenia BSL3. Personel jest zobowiązany do noszenia środków ochrony osobistej przez cały czas. Wszystkie manipulacje są wykonywane wewnątrz Komory Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC), a wszystkie ostre przedmioty są wyrzucane do pojemników na ostre przedmioty. Powierzchnie robocze i BSC są czyszczone buforowanym fenolem i 70% etanolem przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu. Procedury normalnie byłyby wykonywane na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 w przypadku Mycobacterium tuberculosis, ale w celach ilustracyjnych i filmowych autorzy demonstrują te procedury na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 z mniej zjadliwymi bakteriami.
1. Szczepy i warunki hodowli
Uwaga: szczep M. tuberculosis CDC1551 jest używany w tym badaniu, ale każdy szczep M. tuberculosis może być użyty w ten sam sposób.
<ol>
	<li>Hoduj bakterie w podłożu M-OADC-TW (bulion 7H9 uzupełniony 0,5% glicerolu, 10% kompleks dekstrozy kwasu oleinowego bez katalazy i 0,05% Tween-80) w temperaturze 37 °C do OD600 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę w M-OADC-TW (seria rozcieńczeń bakterii w stosunku 1:10). Rozcieńczone roztwory bakterii (105, 106, 107, 108) należy roztoczyć trzykrotnie na selektywnych płytkach 7H11, aby umożliwić oznaczenie CFU.</li>
	<li>Inkubować płytki przez cztery tygodnie w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy będzie można dokładnie policzyć kolonie.</li>
	<li>Odwirować inokulum bakteryjne przy sile 8,534 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Umyj granulkę raz 10 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i ponownie zawiesić osad w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl).</li>
</ol>
2. Zakażenie aerozolem myszy za pomocą komory Madison
<ol>
	<li>Pozwól myszom zaaklimatyzować się w nowym otoczeniu przez tydzień.</li>
	<li>Zważ myszy przed załadowaniem ich do komory.</li>
	<li>Podłącz trzy przewody do listwy zasilającej: zasilanie komory głównej, pompę próżniową i sprężarkę powietrza, w tej kolejności.</li>
	<li>Ostrożnie odkręć szklany słoik. Przynieś szklany słoik do szafki bezpieczeństwa biologicznego i dodaj inokulum prowokacyjne zawieszone w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby uzyskać ~ 104 - 106 CFU bakterii w płucach.</li>
	<li>Zamknij pokrywkę szklanego słoika w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przymocuj słoik do nebulizatora i wyreguluj pionową rurkę ze stali nierdzewnej tak, aby dolny koniec (wlotowy) znajdował się około ćwierć cala poniżej poziomu płynu w słoiku.</li>
	<li>Załaduj wszystkie zwierzęta potrzebne do eksperymentu (komora może pomieścić do 90 myszy) do komory i zamknij wszystkie zatrzaski na drzwiach.</li>
	<li>Sprawdź główny (pokojowy) przepływomierz powietrza. Upewnij się, że środek pływaka (kuli) porusza się z prędkością około 50 l/min, jak zmierzono na skali po lewej stronie.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start na panelu sterowania komory. Ustaw natężenie przepływu powietrza przez przepływomierz powietrza sprężarki (mniejszy miernik po lewej stronie) na 4 l/min na skali. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że inokulum prowokacyjne jest poddawane nebulizacji.</li>
	<li>Po 15 minutach, gdy z przodu panelu sterowania pojawi się czerwona lampka, a sygnał dźwiękowy wskaże koniec biegu, naciśnij przycisk Reset w prawym dolnym rogu panelu sterowania, aby zresetować timery.</li>
	<li>Przytrzymaj mały czerwony przycisk na drzwiach komory, aby zwolnić podciśnienie.</li>
	<li>Otwórz drzwi komory i wyjmij zwierzęta. Umieść myszy z powrotem w klatkach.</li>
	<li>Wyjmij szklany słoik nebulizatora i umieść go w szczelnym, szczelnym pojemniku transportowym. Umieść pojemnik w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wyrzuć zawiesinę prowokacyjną do wyznaczonego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Umieść zużyty słoik nebulizatora w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamknij worek na czas transportu do autoklawu.</li>
	<li>Pod koniec procedury infekcji spryskaj wnętrze komory buforowanym fenolem i 70% etanolem i pozostaw komorę na 10 minut.</li>
	<li>Następnie bardzo dokładnie wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie wewnętrzne. Wyrzuć wszystkie zanieczyszczone ręczniki papierowe itp. w koszu na zagrożenia biologiczne. Autoklaw śmieci, pojemnik na odpady i zużyte słoiki nebulizatora.</li>
	<li>Umieść zwierzęta z powrotem w pomieszczeniu przechowawczym do momentu obrazowania.</li>
	<li>W dniu obrazowania należy przenieść zwierzęta w pojemniku wtórnym do pomieszczenia do obrazowania.</li>
</ol>
3. Znieczulenie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulij myszy izofluranem za pomocą dostosowanego systemu znieczulenia gazowego.</li>
	<li>Zważ każdy z dwóch kanistrów z filtrem węglowym znajdujących się na górze jednostki anestezjologicznej.</li>
	<li>Wymień na nowy kanister, jeśli jego waga jest o 50 g wyższa od masy początkowej.</li>
	<li>Sprawdź parownik, aby upewnić się, że izofluran jest wystarczający do zabiegu.</li>
	<li>Umieść uchwyt stożka nosowego w komorze obrazowania. Umieść liczbę stożków nosowych wymaganą do zabiegu i uszczelnij pozostałe otwory za pomocą blokerów stożka nosowego.</li>
	<li>Włącz dopływ tlenu z butli wysokociśnieniowej i ustaw go na 55 psi.</li>
	<li>Włącz pompę ewakuacyjną znajdującą się przed jednostką anestezjologiczną i ustaw ją na 8 l/min.</li>
	<li>Włącz przełącznik tlenu znajdujący się przed unitem anestezjologicznym.</li>
	<li>Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia, aby ustawić przepływ gazu na 1,5 l/min. Wyłączyć dopływ gazu.</li>
	<li>Włącz dopływ gazu do komory obrazowania, aby ustawić przepływ gazu na 0,25 l/min. Wyłącz przepływ gazu.</li>
	<li>Włącz waporyzator izofluranu i ustaw go na 2 - 2,5%. Dostosuj poziom izofluranu do liczby i wagi zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie, obracając pokrętło na parowniku izofluranu (2 - 2,5% dla myszy o wadze ~20 g; 4% dla świnki morskiej o wadze 300 g).</li>
	<li>Umieść myszy w komorze anestezjologicznej i zamknij pokrywę. Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia.</li>
	<li>Pozostaw myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia na 5 - 10 minut, aż do całkowitego znieczulenia.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy nałóż maść optyczną na oczy, aby chronić je podczas obrazowania.</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji brzusznej lub mostkowej tak, aby ich nosy były umieszczone w stożku nosowym, aby ułatwić znieczulenie myszy podczas procedury obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF)
<ol>
	<li>Wstrzyknąć substrat (20 μM, 2,5 μl/g wagi) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe do myszy zakażonych, jak również kontrolnych. Myszy są pod narkozą w komorze obrazowania przez mniej niż 1 minutę. </li>
	<li>Uruchom system obrazowania.</li>
	<li>Zainicjuj system, klikając przycisk Inicjuj. Poczekaj, aż pasek temperatury zmieni kolor na zielony. 
	UWAGA: Komora obrazowania składa się z podgrzewanej platformy do utrzymywania temperatury ciała zwierzęcia podczas obrazowania.</li>
	<li>Aby ustawić akwizycję obrazu, wybierz Fluorescencyjny | Trans-iluminacja dla całego zwierzęcia lub Epi-iluminacja dla tkanek płucnych, struktura i nakładka w Panelu sterowania akwizycją.</li>
	<li>Ustaw Pole widzenia na B dla pojedynczej myszy i poziom lampy na wysoki.</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, średni bining, 2 - 3 dla przysłony, filtr wzbudzenia na 745 nm i filtry emisji od 780 nm do 840 nm.</li>
	<li>Aby ustawić sekwencję, kliknij Sequence Setup (Ustawienia sekwencji), wybierz 9 - 12 punktów trans-illumination w obszarze płuc.</li>
	<li>Kliknij Pobierz, aby uzyskać obraz.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce po obrazowaniu.</li>
	<li>Monitoruj myszy do momentu całkowitego wyzdrowienia lub poświęcenia w celu ilościowego określenia CFU, jeśli obrazowanie odbywa się w punkcie czasowym eksperymentu. Wykonaj zmodyfikowaną punktację Karnofsky'ego, aby monitorować dobrostan myszy po obrazowaniu. </li>
</ol>
5. Analiza obrazowania REF
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Załaduj pliki obrazów, klikając ikonę Przeglądaj.</li>
	<li>Aby rozmieszać spektralnie, kliknij Spektralne mieszanie w palecie narzędzi i kliknij widma wymagane do rozmieszania. Kliknij rozpocznij rozmieszanie.</li>
	<li>Aby zrekonstruować powierzchnię optyczną, kliknij na Topografia powierzchni.</li>
	<li>Wybierz orientację grzbietową, z zastrzeżeniem futra myszy i kliknij przycisk Generuj powierzchnię.</li>
	<li>Narysuj obraz kadrowania i ustaw obraz progowy dla obszaru zainteresowania. Kliknij Gotowe.</li>
	<li>Aby zarejestrować narządy, przejdź do zakładki rejestracji w menu rozwijanym Narzędzia optyczne 3D.</li>
	<li>Rejestrowanie interesujących nas narządów w atlasie narządów.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar lub lokalizację organów do wygenerowanej topografii powierzchni za pomocą narzędzia do przekształcania on/off znajdującego się w panelu-Narzędzia do rejestracji.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Rekonstrukcja 3D tomografii fluorescencyjnej (FLIT) i wybierz zakładkę Analizuj. Wybierz obrazy, które mają zostać uwzględnione do analizy, typ obrazu na Wydajność znormalizowanej fluorescencji transmisyjnej (NTF), kliknij przycisk Start.</li>
	<li>Zaznacz zaznacz wszystko i zrekonstruuj na karcie Podgląd danych.</li>
	<li>Aby określić ilościowo fluorescencję, przejdź do Narzędzia obszaru zainteresowania (ROI), dodaj kostkę ROI do narządu zainteresowania i dostosuj rozmiar sześcianu, aby pokryć interesujący nas narząd. Kliknij na Zmierz ROI 3D.</li>
	<li>W oknie Pomiary ROI przejdź do Pomiary ROI 3D, wybierz typ danych do źródła wokseli oraz jednostkę miary do pmolM-1 cm-1.</li>
	<li>Zapisz i/lub wyeksportuj wynik analizy rekonstrukcji FLIT 3D do rysunku lub pliku danych.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja bakterii za pomocą CFU
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 ml pentobarbitalu sodu (390 mg / ml).</li>
	<li>Sprawdź odruch pedałowania, ściskając opuszki stóp myszy, aby upewnić się, że nie ma reakcji odruchowej.</li>
	<li>Usuń tkankę płucną myszy za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek. Homogenizować tkankę płucną w 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenatu płuc w sterylnym 1x PBS.</li>
	<li>W celu posiewu, na płytce agarowej umieścić trzy porcje po 20 μl każdy z odpowiedniego rozcieńczenia.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i monitorować rozwój bakterii.</li>
	<li>Policz kolonie w każdym miejscu po czasie inkubacji i wyraż je jako CFU/ml, korygując objętość i rozcieńczenie, stosując następujące równanie: 
	jtk/ ml = (C/V) x M 
	Gdzie C = liczba kolonii na plamkę, V = objętość próbki zaszczepionej na każdej płytce (ml), a M = współczynnik mnożenia (odwrotność użytego rozcieńczenia). 
	UWAGA: Jeśli 11 kolonii zostanie policzonych w jednym miejscu na objętość próbki 0,002 ml przy rozcieńczeniu próbki 10-4, przy użyciu równania liczbę kolonii zostanie obliczona jako 
	(11/0,02) x 104 = 5,5 x 106 jtk/ml</li>
</ol>

<ol><li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Official+American+thoracic+society%2Finfectious+diseases+society+of+America%2F+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines%3A+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Ch%22%5BJournal%5D)">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li>
<li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+transmission%2C+diagnosis%2C+and+management+of+multidrug-resistant%2C+extensively+drug-resistant%2C+and+incurable+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Resp+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li>
<li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li>
<li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li>
<li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li>
<li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+D%22%5BJournal%5D)">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li>
<li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+%CE%B2-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li>
<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).</li>
<li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).</li>
<li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/8565/1/Multi-scale-fluorescence-imaging-of-bacterial-infections-in-animal-models/10.1117/12.2004690.short">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).</li>
<li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.896553">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).</li>
<li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li>
<li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li>
<li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li>
<li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).</li>
<li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tuberculosis+with+endogenous+%CE%B2-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li>
<li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li>
<li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest%3A+characteristic+findings+and+role+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li>
<li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography%2C+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li>
<li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li>
<li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li>
<li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice%2C+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).</li>
<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/9715/1/Whole-animal-imaging-of-bacterial-infection-using-endoscopic-excitation-of/10.1117/12.2213820.short">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150(2016).</li>
<li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40475-015-0043-1">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+in+vivo%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li>
<li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li>
<li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717(2017).</li>
<li>2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).</li>
<li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Covalent+Reporter+of+%CE%B2-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li>
<li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+%CE%B2-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li>
<li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion%3A+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT%5BTitle%5D)+AND+%22BRIT+J+RADIOL%22%5BJournal%5D)">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li>
<li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li>
</ol>

W przypadku korzystania z technik obrazowania, takich jak REF, istnieją kluczowe strategie, które umożliwiają generowanie solidnych i spójnych danych. Obrazowanie optyczne wytwarza rozproszone światło w tkankach, co może wpływać na głębokość penetracji, ponieważ trudno jest uchwycić światło emitowane we wszystkich kierunkach. Zastosowanie substratu fluoroforowego w bliskiej podczerwieni (NIR) do obrazowania REF o długości fali wzbudzenia i emisji w Querange 700 - 900 nm ułatwia minimalną absorpcję sygnału fluorescencyjnego przez tkanki ssaków. Specjalnie zaprojektowane podłoże zostało skonstruowane przez połączenie fluoroforu NIR, IRDye 800Cw z wygaszaczem, IRDye QC-1, za pomocą pierścienia laktamowego umożliwiającego wygaszanie oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji. IRDye ma doskonałe właściwości penetracji tkanek i rozpraszania światła oraz nie ma żadnego widocznego szkodliwego wpływu na ssaki36, jest usuwany z krwi i narządów w ciągu 24 godzin. Sygnał fluorescencyjny znacznie wzrasta począwszy od 4 godzin po podaniu substratu, osiągając maksymalny poziom 6 godzin po podaniu.
Bakteryjna dawka zakaźna, sposób podawania dawki zakaźnej i substratu, a także punkty czasowe obrazowania po zakażeniu poprzez wykonanie badań pilotażowych powinny być ustandaryzowane przed rozpoczęciem dużych, złożonych eksperymentów. Badania pilotażowe mogą znacznie skrócić czas i obniżyć koszty obrazowania dużej liczby zwierząt, ponieważ standardową procedurę można zoptymalizować przed przeprowadzeniem kluczowego eksperymentu. Obciążenia bakteryjne w narządach/tkankach będących przedmiotem zainteresowania należy określić po obrazowaniu całego ciała za pomocą transiluminacji i obrazowaniu płuc ex vivo przy użyciu epi-iluminacji w celu walidacji źródła sygnału i określenia jakości korelacji z obecną liczbą bakterii8. Badania pilotażowe dostarczą informacji na temat progu detekcji, zakresu dynamicznego techniki, a także określą optymalne warunki eksperymentalne dla obrazowania.
Głównymi zaletami stosowania obrazowania REF w porównaniu z innymi strategiami fluorescencyjnymi i bioluminescencyjnymi są jego wysoka czułość i zdolność do obrazowania naturalnych szczepów M. tuberculosis. Obrazowanie REF wykorzystuje katalitycznie wytrzymały enzym BlaC, który jest konserwatywny we wszystkich izolatach klinicznych M. tuberculosis i szczepach kompleksu gruźlicy. Duża czułość obrazowania REF wynika z szybkiego tempa katalitycznego BlaC w połączeniu z zatrzymywaniem rozszczepionego produktu fluorescencyjnego przez komórkę gospodarza. Sygnał stale wzrasta tak długo, jak długo substrat jest dostępny, co powoduje niemal nieograniczone gromadzenie się sygnału w zainfekowanych komórkach i tkankach. Ta zwiększona czułość obrazowania REF w porównaniu z alternatywnymi podejściami do obrazowania umożliwia specyficzne wykrywanie M. tuberculosis zarówno in vitro, jak i in vivo 8,23,24,29.
Obrazowanie REF może być stosowane do wykrywania bakterii bez modyfikacji genetycznych, co umożliwia jego bezpośrednie zastosowanie do dowolnego modelu infekcji, zarówno zwierząt laboratoryjnych 8,37, jak i materiałów klinicznych u ludzi29,38. REF może być stosowany do wykrywania i obrazowania szerokiej gamy patogenów39,40, ponieważ substraty fluorogenne mogą być opracowywane dla wielu celów enzymatycznych innych niż BlaC, takich jak proteazy, kinazy, ureazy i β-galaktozydazy. Należy jednak dokładnie przemyśleć cel, aby upewnić się, że wykazuje on optymalne cechy do obrazowania. BlaC stanowi dobry enzym modelowy dla cech, które zapewnią skuteczne zastosowanie tej strategii. Obrazowanie REF zapewnia natychmiastowy odczyt obciążenia bakteryjnego obecnego w płucach podczas infekcji, co znacznie przyspiesza postęp w badaniach nad patogenezą gruźlicy, ponieważ określenie liczby bakterii zwykle zajmuje od trzech do sześciu tygodni, ale nawet w przypadku szybciej rosnących organizmów takie podejście pozwoli zaoszczędzić dużo czasu. REF może być również stosowany do odróżniania raków od gruźlicy, kluczowego problemu w diagnostyce zmian guzkowych u pacjentów41,42. REF służy jako nowatorskie narzędzie przyspieszające translacyjne obrazowanie gruźlicy i może być nawet stosowany u ludzi, potencjalnie umożliwiając szybkie przewidywanie wyników leczenia.

Powolne tempo wzrostu M. tuberculosis jest główną przeszkodą w szybkim diagnozowaniu gruźlicy1,2,3. Podczas gdy diagnoza oparta na posiewie potrzebuje tygodni, aby uzyskać wyniki, rozmaz kwasoodporny ma ograniczenia diagnostyczne4 u dzieci5 i pacjentów jednocześnie zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności6,7. Technologie obrazowania optycznego zostały ostatnio uznane za alternatywę dla tradycyjnych metod diagnostycznych gruźlicy8,9. Fluorescencja i bioluminescencja mogą być wykorzystane do optycznego obrazowania M. tuberculosis u żywych zwierząt w czasie rzeczywistym10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Obrazowanie optyczne ma tę zaletę, że umożliwia szybką i specyficzną ocenę zakażenia M. tuberculosis20,21,22.
Przedstawiamy szczegóły optycznego obrazowania M. tuberculosis u żywych myszy za pomocą REF. Ta metoda jest bardzo specyficzna i czuła23,24 i, podobnie jak inne metody optyczne, jest tańsza niż inne metody obrazowania gruźlicy (TB)25, w tym tomografia komputerowa (CT)26, obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)27 oraz pozytonowa tomografia emisyjna F-fluorodeoksyglukozy/CT (F-FDG PET/CT)28. REF wykorzystuje niestandardowe podłoża fluorescencyjne lub bioluminescencyjne, które po rozszczepieniu przez enzym bakteryjny wytwarzają produkt fluorescencyjny8,29. W związku z tym ma tę zaletę, że nie wymaga rekombinowanego szczepu reporterowego prątków30,31. Opisany substrat FRET składa się z fluorochromu i wygaszacza połączonych pierścieniem β-laktamowym, który jest hydrolizowany przez BlaC (β-laktamazę), naturalnie wyrażaną przez kompleks gruźlicy Mycobacterium8,32. Bakterie bezpośrednio generują sygnał dzięki aktywności katalitycznej REF, która umożliwia amplifikację o wiele rzędów wielkości i czułe wykrywanie M. tuberculosis.
Substrat REF użyty w tym badaniu ma doskonałą penetrację tkanek u żywych zwierząt i zredukowane tło ze względu na jego długą długość fali. Dzięki temu substratowi o dużej długości fali możliwe jest osiągnięcie progu wykrywalności M. tuberculosis wynoszącego prawie 100 jednostek tworzących kolonie (CFU) in vitro i <1000 CFU w płucach myszy in vivo (całe zwierzę)8,33. REF może być stosowany jako narzędzie diagnostyczne plwociny, materiałów klinicznych, a nawet bezpośrednio u pacjentów z mikrosystemami endoskopowymi16,32,33,34 ze względu na wysoką czułość i swoistość. REF może być stosowany do każdego szczepu klinicznego gruźlicy, ponieważ wykorzystuje naturalnie wytwarzany enzym bakteryjny, BlaC, do wykrywania obecnego we wszystkich szczepach. Te cechy sprawiają, że obrazowanie REF jest cennym narzędziem w przedklinicznych badaniach nad gruźlicą w ogóle, aby ułatwić ocenę terapeutyczną i szczepionkową, a także analizę patogenezy, ale ostatecznie może być również stosowane w diagnostyce u pacjentów z gruźlicą.

<table><tbody><tr><td>Izofluran</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Niestandardowo syntetyzowany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór Fatal Plus</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Bulion Middlebrook</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Wzbogacanie Middlebrook</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gazowy system anestezjologiczny</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste stożki nosowe</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. gruźlica szczep CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samice myszy BALB/C, 5-7 tygodni</td><td>Laboratorium</td><td></td><td></td> Jacksona</tr></tbody></table>

obrazowanie mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzym fluorescencji (REF) wykorzystuje substraty, które są specyficzne dla enzymów obecnych w organizmach docelowych do obrazowania lub wykrywania przez fluorescencję lub bioluminescencję. Wykorzystujemy BlaC, enzym ulegający konstytutywnej ekspresji przez wszystkie szczepy M. tuberculosis. REF umożliwia szybką ocenę ilościową bakterii w płucach zakażonych myszy. Ta sama grupa myszy może być obrazowana w wielu punktach czasowych, co znacznie obniża koszty, szybciej zlicza bakterie, umożliwia nowatorskie obserwacje interakcji gospodarz-patogen i zwiększa moc statystyczną, ponieważ więcej zwierząt w grupie jest łatwo utrzymywanych. REF jest niezwykle czuły ze względu na katalityczny charakter reportera enzymatycznego BlaC i specyficzny ze względu na niestandardowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) lub zastosowane substraty fluorogeniczne. REF nie wymaga rekombinowanych szczepów, zapewniając normalne interakcje gospodarz-patogen. Opisujemy obrazowanie zakażenia M. tuberculosis przy użyciu substratu FRET o maksymalnej emisji przy 800 nm. Długość fali podłoża umożliwia czułe obrazowanie głębokich tkanek u ssaków. Omówimy zakażenie aerozolem myszy M. tuberculosis, znieczulenie myszy, podawanie substratu REF i obrazowanie optyczne. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do oceny interakcji gospodarz-patogen i skuteczności antybiotyków ukierunkowanych na M. tuberculosis.

Obrazowanie REF myszy zainfekowanych M. tuberculosis wraz z niezinfekowaną myszą kontrolną przedstawiono na Rysunku 1A. Po podaniu substratu myszy zainfekowane wykazały istotnie wyższy (P = 0,0057) sygnał fluorescencyjny z płuc w 6. tygodniu po infekcji w porównaniu do grupy kontrolnej. Typowy przebieg czasowy badania skuteczności terapeutycznej przeciwko M. tuberculosis z użyciem REF mógłby obejmować obrazowanie w 1., 2., 4., 6., 15. i 24. tygodniu po infekcji. Intensywność fluorescencji jest ilościowo określana przy użyciu epiluminacji dla tkanek płuc (Rysunek 1B). Spójny wzrost sygnału od 2. do 6. tygodnia w płucach zainfekowanych myszy sugeruje, że REF jest w stanie skutecznie wykrywać M. tuberculosis in vivo. Spadek sygnału tła u myszy kontrolnych w późniejszym punkcie czasowym (Rysunek 1B) można przypisać zwiększeniu masy ciała i objętości myszy w okresie 6 tygodni, co zmniejszyło penetrację długości fali wzbudzenia. Rekonstrukcja 3D FLIT źródeł fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis przedstawiona jest na Rysunku 2A. Sekwencje obrazów są pobierane w wielu punktach transiluminacji u myszy przy użyciu tego samego wzbudzenia i serii filtrów emisyjnych. Te sekwencje obrazów są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji 3D FLIT w celu określenia rozkładu źródeł fluorescencyjnych w organizmie zwierzęcia. Rysunek 2A-D prezentuje różne płaszczyzny (czołową, strzałkową i poprzeczną) tomografii myszy z rejestracją organu płuc. Mapy wydajności NTF służące do weryfikacji jakości rekonstrukcji przedstawiono na Rysunku 2E. NTF pozwala na odjęcie tła wynikającego z przecieku światła z obrazów transiluminacyjnych poprzez dodatkowy obraz uchwycony z filtrem neutralnym. Obraz wykonany ze specyficznym filtrem wzbudzenia (Rysunek 2E-measured) jest normalizowany do obrazu transmisji zmierzonego z tym samym filtrem emisyjnym i otwartym filtrem wzbudzenia (Rysunek 2E-simulated), aby uzyskać sygnał generowany wyłącznie przez substrat. Podobne zmierzone i symulowane profile wydajności NTF zarówno w profilu poziomym (Rysunek 2F), jak i pionowym (Rysunek 2G), z błędem procentowym bliskim 0% (Rysunek 2E-% error), stanowią dowód wysokiej jakości rekonstrukcji 3D przy zredukowanych artefaktach oraz poprawionej lokalizacji sygnału i czułości.
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne i analiza postępu infekcji u myszy; dołączono wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obrazowanie M. tuberculosis za pomocą REF. (A) Obrazowanie in vivo myszy niezinfekowanych oraz zainfekowanych M. tuberculosis w 2., 4. i 6. tygodniu po infekcji. Pasek kolorów przedstawia intensywność sygnału fluorescencyjnego w fotonach na sekundę na cm2 , od niskiej (żółty) do wysokiej (czerwony). (B) Ilościowe oznaczenie intensywności fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis. Wartości fluorescencji dla grupy kontrolnej (czarny) i zainfekowanej (czerwony) przedstawiono wraz z błędem standardowym dla każdego punktu czasowego. Istotność wyników określono za pomocą testu t Studenta; wartości p &lt;0,05 uznano za istotne. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Model obrazowania optycznego płuc z danymi symulowanymi i zmierzonymi; efektywność NTF, schemat analizy błędów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Rekonstrukcja 3D FLIT źródeł fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis. Tomografia myszy przedstawiona w różnych przekrojach: A) czołowym, B) strzałkowym oraz C) poprzecznym, wraz z D) rejestracją organu płuc. Trójwymiarowy obszar zainteresowania (ROI) dla pomiarów źródła przedstawiono jako czerwony sześcian w płucach. (E) Mapy efektywności NTF dla danych zmierzonych i symulowanych w celu weryfikacji jakości rekonstrukcji. Porównanie profili efektywności NTF zmierzonej i symulowanej wykazało wysoką jakość rekonstrukcji 3D (podobna efektywność NTF zmierzona i symulowana). F) Poziomy i G) pionowy profile sygnału reprezentujące krzywe efektywności NTF zmierzonej (niebieska) i symulowanej (czerwona). Poziome i pionowe czerwone paski wskazują położenie źródła. Pasek kolorów reprezentuje intensywność sygnału fluorescencyjnego w fotonach na sekundę na cm2 od niskiej (niebieski) do wysokiej (czerwony). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Ogólnym celem tej procedury obrazowania fluorescencji enzymu reporterowego jest ułatwienie czułego i specyficznego wykrywania prątków gruźlicy w przedklinicznych modelach zwierzęcych do patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gruźlicy, w tym mechanizmy wirulencji gatunków bakterii, a także stworzyć terapie i zrozumieć szczepionki. Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na obrazowanie tej samej grupy zwierząt w wielu punktach czasowych.To znacznie obniża koszty, pozwala nam badać interakcje patogenów gospodarza, a także zwiększa moc statystyczną, ponieważ więcej zwierząt może być łatwo utrzymywanych w tym samym czasie. Na początek wyhoduj dowolne bakterie M. tuberculosis w pożywce MOADCTW w temperaturze 37 stopni Celsjusza do gęstości optycznej 0,5 mierzonej przy 600 nanometrach. Wszystkie procedury związane z manipulowaniem materiałami zakaźnymi muszą być przeprowadzane w komorach bezpieczeństwa biologicznego lub innych zatwierdzonych urządzeniach do fizycznego zabezpieczenia.Po przygotowaniu wykonaj serię od jednego do 10 rozcieńczeń kultury w tym samym podłożu. Następnie rozcieńczenia należy rozcieńczyć trzykrotnie na selektywnych płytkach 7H11 w celu dokładnego oznaczenia CFU. Inkubuj płytki przez cztery tygodnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub do momentu, gdy kolonie będzie można dokładnie policzyć w celu określenia CFU.Przed założeniem inokulacji zawsze upewnij się, że okap bezpieczeństwa biologicznego przepływa powietrze z prędkością 50 litrów na minutę. Aby przygotować inokulum, które może zainfekować do 90 myszy, odmierz pożądaną CFU w 15-mililitrowej probówce sokoła. Zwykle używa się od 10 000 do 1 miliona CFU.Następnie opluj bakterie. Następnie umyj bakterie raz 10 mililitrami soli fizjologicznej. Następnie zawieś je w 15 mililitrach soli fizjologicznej.Następnie do szafki bezpieczeństwa biologicznego załaduj inokulum do szklanego słoika, który można przymocować do nebulizatora. Następnie podłącz nebulizator i wyreguluj pionową rurkę ze stali nierdzewnej tak, aby dolny koniec znajdował się około ćwierć cala poniżej menisku zawieszenia. Teraz przenieś zestaw do komory zaszczepiającej w szczelnym pojemniku transportowym.Aby kontynuować, załaduj zwierzęta o znanej wadze do zasilanej komory zaszczepiającej. W komorze może zmieścić się do 90 myszy. Następnie zamknij wszystkie zatrzaski w drzwiach.Następnie podłącz nebulizator za pomocą stalowego zacisku. Następnie naciśnij przycisk start na komorze. I ustaw natężenie przepływu powietrza w zakresie od trzech do pięciu litrów na minutę.Sprężone powietrze będzie przepływać z prędkością około 22 do 26 funtów na cal kwadratowy i co ważne, powinno być możliwe zobaczenie mgły inokulum w komorze. Po 15 minutach z przodu panelu sterowania pojawi się czerwona lampka, a sygnał dźwiękowy wskaże koniec biegu. Następnie naciśnij przycisk resetowania, aby zresetować timery.Aby zwolnić podciśnienie, naciśnij mały czerwony przycisk na drzwiach komory. Następnie otwórz drzwi komory i załóż myszy z powrotem do ich domowych klatek. Idąc dalej, trzymaj zwierzęta w pomieszczeniu przechowawczym.Następnie umieść słoik i pojemnik transportowy z powrotem w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Tam wyrzuć pozostałą zawiesinę bakteryjną do wyznaczonego pojemnika na odpady. Następnie umieść zużyty słoik nebulizatora w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamknij worek do transportu do autoklawu.Aby wyczyścić komorę, spryskaj wewnętrzne powierzchnie buforowanym fenolem i 70% etanolem. Pozwól tym roztworom zareagować na tych powierzchniach przez 10 minut. Następnie dokładnie je zetrzyj.Wyrzuć wszystkie chusteczki do kosza na zagrożenia biologiczne. Następnie autoklaw śmieci, pojemnik na odpady i zużyte słoiki nebulizatora. Przenieś zwierzęta do pomieszczenia do obrazowania.Tam znieczulij zwierzę zgodnie z protokołem tekstowym i wstrzyknij mu substrat kontrastowy przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. W oprogramowaniu systemów obrazowania zainicjuj system i kontynuuj, gdy pasek temperatury zmieni kolor na zielony. Po zainicjowaniu systemu umieść mysz w komorze obrazowania.Upewnij się, że jego nozdrza znajdują się w stożku nosa, aby otrzymał znieczulenie podczas obrazowania. Teraz wróć do komputera. W panelu sterowania akwizycji wybierz opcję fluorescencja, transiluminacja, aby wyświetlić wizualizację całego zwierzęcia, lub epiiluminację, aby wyświetlić tkanki płuc.W przypadku pojedynczej myszy ustaw pole widzenia na B, a poziom lampy na wysoki. Do ekspozycji użyj automatycznego czasu, średniego łączenia i dwóch lub trzech dla przysłony. Następnie ustaw filtr wzbudzenia na 745 nanometrów, a filtry emisyjne na 780 na 840 nanometrów.Następnie przejdź do ustawień sekwencji i wybierz od dziewięciu do 12 punktów transillumination w obszarze zainteresowania. Teraz naciśnij przycisk pozyskiwania, aby zebrać obrazy. Analiza obrazu jest objęta protokołem tekstowym.Aby przeanalizować zakres infekcji, należy poddać mysz eutanazji za pomocą pentobarbitalu sodu. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu pedałowania, aby upewnić się, że zwierzę zostało poddane eutanazji. A następnie wysadzić płuca za pomocą standardowej sekcji.Następnie homogenizuj tkankę płucną w jednym mililitrze PBS. Następnie wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie homogenyny za pomocą PBS. Rozcieńczoną homogenię roztoczyć trzykrotnie i inkubować na płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie można policzyć kolonie.Następnie użyj wyniku CFU, aby zmierzyć nasilenie infekcji. Myszy traktowano zgodnie z opisem. Do obserwacji progresji M. tuberculosis użyto substratu REF.Fluorescencję określono ilościowo za pomocą transiluminacji. I zwiększył się od drugiego do szóstego tygodnia u zakażonych myszy. Niewielki spadek sygnału u myszy kontrolnych można przypisać wzrostowi masy ciała i objętości w okresie sześciu tygodni.Rekonstrukcja 3D FLIT źródeł fluorescencji została wykonana z wielu punktów transiluminacji przy użyciu tych samych filtrów wzbudzenia i emisji. Mapy wydajności NTF zostały wykonane w celu sprawdzenia jakości rekonstrukcji. Obraz uzyskany ze specyficznego filtra wzbudzenia został znormalizowany do obrazu transmisyjnego wykonanego przy użyciu tego samego filtra emisyjnego i otwartego filtra wzbudzenia.Zapewnia to sygnał wytwarzany przez samo podłoże. W rekonstrukcji nie było prawie żadnego błędu. Badanie wydajności NTF danych zarówno w widoku poziomym, jak i pionowym wykazało ścisłą korelację.W związku z tym rekonstrukcja 3D miała niewiele artefaktów, lepszą lokalizację sygnału i lepszą czułość w porównaniu z innymi metodami. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się gruźlicą do zbadania skuteczności terapeutycznej leków przeciwko prątkom gruźlicy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarażać myszy drogą aerozolową prątkami gruźlicy z kontrolnym obrazowaniem optycznym przy użyciu substratu REF.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Behera, R. K. i in. Metoda oparta na fluorescencji do badania regulacji genów bakteryjnych w tkankach zakażonych. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje metodę przygotowania zakażonej tkanki nerki myszy, barwienia DNA oraz wykrywania ekspresji genów bakterii za pomocą dwóch fluorescencyjnych reporterów. Czerwony oznacza wszystkie bakterie, a zielony podkreśla komórki reagujące na infekcje.

Obrazowanie fluorescencyjne kolonizacji bakteryjnej w tkance nerek myszy

Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF) do wykrywania in vivo infekcji Mycobacterium tuberculosis. Zakażonym myszom wstrzykuje się dootrzewnowo substrat do obrazowania REF. Po hydrolizie przez bakteryjny enzym β-laktamazę substrat wydziela fluorescencję, której wykrycie pomaga w ocenie infekcji.

Obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych do śledzenia infekcji bakteryjnych in vivo

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj metodę obrazowania Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego. Technika REF umożliwia wielokrotne badanie tych samych zwierząt, zwiększając moc statystyczną badań nad patogenezą i terapią gruźlicy.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Przeglądaj więcej filmów