SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu
25 grudnia 2017
Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.
Ogólnym celem tej procedury jest szybki pomiar ruchów czułków i trąbek owadów na podstawie nagrań wideo z pospolitego preparatu zwierzęcego przy użyciu oprogramowania typu open source do lokalizacji roju oraz konwencjonalnej kamery i sprzętu komputerowego. Metody te mogą być wykorzystywane do szybkiego uzyskiwania pomiarów o wysokiej rozdzielczości ruchów anteny i trąby. Zastosowanie tych metod może wyjaśnić, w jaki sposób zmieniają się ruchy anteny i trąbki w odpowiedzi na manipulacje chemiczne, rozwojowe i genetyczne.
Główną zaletą tej techniki jest to, że może szybko mierzyć ruchy za pomocą bezpłatnego oprogramowania i nie wymaga wyrafinowanego sprzętu wideo ani komputerowego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w reakcje zapachowe pszczół miodnych, można ją również zastosować do innych systemów owadzich. Na początek użyj fiolek, aby zebrać pszczoły robotnice z wejścia do ula i na krótko umieść fiolki w lodowej zawiesinie.
Za pomocą taśmy klejącej zabezpiecz każdą pszczołę w rurze uprzęży, a następnie nałóż taśmę na górną część rury, aby ukryć nogi. Upewnij się, że nogi nie są widoczne z górnej części rury uprzęży. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj lutownicy niskotemperaturowej, aby nałożyć podgrzany wosk na tył głowy każdej pszczoły, aby ją unieruchomić.
Użyj małego pręta, aby trzymać antenę z dala od wosku i upewnij się, że anteny mogą się swobodnie poruszać. Użyj uchwytu na kamerę internetową, aby ustawić kamerę bezpośrednio nad głową pszczoły i użyj oprogramowania do nagrywania, aby sprawdzić wideo i powiększyć głowę. Po nałożeniu taśmy i wosku wyświetl podgląd sceny za pomocą kamery i poszukaj wszystkiego, co może się poruszać lub zmieniać, co nie jest anteną lub trąbką.
Następnie dostosuj taśmę i wosk w razie potrzeby. Następnie użyj ustawień oprogramowania do nagrywania, aby utrzymać stałą ekspozycję aparatu i dostosować suwak ekspozycji do żądanej wartości. Dostosuj suwaki kontrastu, jasności i ostrości, aby poprawić wykrywanie anteny.
Dostosuj oświetlenie otoczenia, aby zredukować cienie anteny. Użyj rozproszonego źródła światła, takiego jak laboratoryjna lampa na gęsiej szyi lub latarka z papierem, aby oświetlić pszczołę. Następnie umieść diodę LED umieszczoną w widoku kamery, aby wskazać, kiedy dostarczony zostanie zapach bodźca.
W dygestorii przygotuj wkłady zapachowe, które posłużą do stymulacji pszczół podczas nagrań wideo. Umieść źródło dostarczania zapachów w pobliżu rurki wiązki przewodów, uważając, aby nie zasłaniać kamery view. Umieść źródło podciśnienia naprzeciwko źródła zapachu, aby usunąć zapachy bodźcowe i włącz je przed prezentacją zapachu.
Po unieruchomieniu pszczół i zakończeniu przygotowań do kamery, sfilmuj każdą pszczołę w każdych warunkach eksperymentalnych jako osobny plik wideo. Następnie w module śledzenia anteny roju kliknij przycisk przeglądania, aby otworzyć plik wideo. Po załadowaniu pliku wideo umieść widżet czujnika anteny nad głową pszczoły.
Użyj ikon obrotu i skali, aby dostosować wyrównanie widżetu. Widżet powinien obejmować pełny zakres ruchu na antenie pszczoły. Następnie umieść widżet czujnika leczenia nad diodą LED, która wskazuje, kiedy dostarczany jest zapach bodźca.
Kliknij przycisk odtwarzania w lewym dolnym rogu, aby rozpocząć wyświetlanie pliku wideo klatka po klatce. Prawdopodobne punkty anteny i trąbki zostaną podświetlone na żółto, a żółte pierścienie wskażą końcówki wyrostka. Dostosuj suwaki w sekcji filtrów, aby zoptymalizować czułość filtra.
Po osiągnięciu idealnej czułości w kadrze zostaną podświetlone tylko przydatki pszczoły. Przewiń do przodu kolejne części filmu, aby upewnić się, że czułość filtra jest zoptymalizowana w całym filmie. Przetestuj swoją konfigurację, tworząc krótki przykładowy film z owadem i przeanalizuj go za pomocą oprogramowania, szukając obcych poruszających się obiektów, które wykrywa oprogramowanie.
Dostosuj scenę, oświetlenie i kąt kamery, aż oprogramowanie odizoluje ruchy anten i trąbki. Po skonfigurowaniu widżetów i filtrów wstrzymaj wideo, uruchom je ponownie i odtwórz od początku do końca. Na koniec rozwiń sekcję zapisywania, kliknij przycisk zapisz dane śledzenia i wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik.
Aby zweryfikować oprogramowanie do śledzenia wyrostków, dwóch oceniających zlokalizowało końcówki anten w 425 klatkach wideo, które następnie zostały przeanalizowane przez oprogramowanie. Odległość między dwoma oceniającymi ludźmi jest pokazana na tym rysunku, przy czym odległość między ludźmi i odległość między lokalizacjami wykrytymi przez oprogramowanie a ludźmi oceniającymi jest pokazana przy użyciu odległości najbliższej człowiekowi w oprogramowaniu. Dystans między ludźmi był niewielki w przypadku klatek na początku, a następnie zwiększył się w drugiej połowie filmu.
Poziomy odległości od ludzi najbliższe oprogramowaniu pozostają niezmienne przez cały film. 23 samice pszczół miodnych były wystawione na pięć różnych warunków zapachowych, a filmy z prób zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania do śledzenia wyrostków. Z wyjątkiem warunków kontrolnych, oprogramowanie było w stanie wykryć znaczące różnice w średnich zmianach kąta anten po wystawieniu na eksperymentalne warunki zapachowe.
Dodatkowo mapy gęstości kątów anten ujawniły klastry preferencji lokalizacji anteny. Czerwone skupiska na mapie wskazują, że anteny preferują kąty oddalone od źródła zapachu wkrótce po pojawieniu się zapachu i preferują kąty w kierunku źródła zapachu wkrótce po wywnioskowaniu zapachu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym sprawdzeniu każdej sceny wideo przed nagraniem pod kątem optymalnego rozmieszczenia pszczół i oświetlenia.
Dodatkowo ważne jest, aby oznaczyć ramki doprowadzające zapach wskaźnikiem wizualnym. Po wykonaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak kondycjonowanie zapachu. Ta procedura jest również przydatna do badania wrodzonych reakcji u pszczół miodnych i innych owadów.
Nie zapominaj, że praca z pszczołami i niektórymi chemikaliami może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tego zabiegu należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Po opanowaniu procedura ta może być wykorzystana do efektywnego uzyskania danych o ruchu anteny i trąbki dla dużej liczby owadów i warunków eksperymentalnych.
Swarm Sight, oprogramowanie typu open source używane w tej procedurze, można pobrać z firmy swarmsight.org.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia szczegółową metodologię wykorzystania SwarmSight, oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym, do śledzenia ruchów czułków i aparatów gębowych owadów na podstawie nagrań wideo. Podejście to wykorzystuje konwencjonalną technologię kamer internetowych i ma na celu zwiększenie dokładności oraz szybkości w porównaniu z metodami śledzenia manualnego, umożliwiając badaczom analizę modyfikacji behawioralnych w odpowiedzi na różne bodźce.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia behawioralna
- Fizjologia owadów
Wprowadzenie
- Niniejsze badanie koncentruje się na pomiarze ruchów wyrostków owadziego ciała w celu zrozumienia ich reakcji behawioralnych.
- Opracowana metodologia jest możliwa do zastosowania w różnych systemach owadziego organizmu, nie ograniczając się jedynie do pszczół miodnych.
- Technika ta ułatwia badanie reakcji na zmiany chemiczne, rozwojowe i genetyczne.
- Oprogramowanie przetwarza dane wideo znacznie szybciej niż ręczne śledzenie, co zwiększa wydajność gromadzenia danych.
Cel badania
- Opracowanie dostępnej metody dokładnego i szybkiego pomiaru ruchów wyrostków owadów.
- Umożliwienie badaczom analizy dynamiki odpowiedzi na zapachy u pszczół miodnych jako organizmu modelowego.
- Zilustrowanie wpływu warunków eksperymentalnych na ruchy czułków i trąbki.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano oprogramowanie do śledzenia o otwartym kodzie źródłowym, SwarmSight, wraz ze standardowym sprzętem w postaci kamer internetowych do przechwytywania danych.
- Jako model biologiczny wykorzystano pszczoły miodne, stosując szczegółowe protokoły ich unieruchamiania i pozycjonowania do rejestracji wideo.
- Nie wspomniano o analizach multiomicznych ani metabolicznych.
- Kluczowe etapy obejmują regulację ustawień kamery oraz optymalizację oświetlenia w celu poprawy widoczności wyrostków.
- Gromadzenie danych polega na filmowaniu pszczół poddanych działaniu różnych zapachów i analizowaniu nagrań wideo za pomocą oprogramowania do śledzenia.
Główne wyniki
- Oprogramowanie ilościowo śledziło zmiany kąta anten, wykazując istotne różnice między warunkami eksperymentalnymi.
- Wyniki obejmowały wyznaczenie klastrów preferencji lokalizacji anten w odpowiedzi na bodźce zapachowe, co wykazało adaptację behawioralną.
- Walidacja śledzenia wskazała na spójną wydajność w wykrywaniu ruchów anten w klatkach wideo.
- Analiza wzorców ruchów pozwoliła na uzyskanie istotnych informacji na temat mechanizmów odpowiedzi na bodźce chemiczne.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje solidną metodologię wysokoprzepustowej analizy zachowań owadów w odpowiedzi na bodźce sensoryczne.
- Wykorzystanie oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym ułatwia szerokie zastosowanie w badaniach nad neuronauką behawioralną bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.
- Wnioski z tej pracy pozwalają na lepsze zrozumienie wpływu sygnałów środowiskowych na ruch i zachowanie owadów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe śledzenie narządów zmysłowych owadów umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów w ramach programów agrochemicznych i kontroli wektorów. Wysokoprzepustowe fenotypowanie behawioralne zwiększa pewność prognostyczną w kampaniach przesiewowych poprzez powiązanie ekspozycji chemicznej z mierzalnymi odpowiedziami neuronalnymi. Podejście to pozwala rozwiązać problemy na krytycznych etapach wczesnego odkrywania, gdzie należy odróżnić funkcjonalne zaangażowanie celu od efektów niespecyficznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez sensorycznych poprzez ilościowe określanie retrakcji czułków jako funkcjonalnego odczytu detekcji zapachów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnych danych o ruchu o wysokiej rozdzielczości w celu wyjaśnienia relacji dawka-odpowiedź w szlakach chemosensorycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfela badań poprzez odróżnianie specyficznych mechanizmów chemosensorycznych od ogólnych zmian lokomocyjnych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe pomiary kąta anten oraz wysunięcia proboscis, odpowiednie do standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Przetwarza wideo z prędkością 120x większą niż człowiek, przy dokładności przewykszającej ludzką, co umożliwia skalowalność procesu przesiewania.
- Wartość prognostyczna: Rejestruje dynamikę anten z częstotliwością do 15 Hz, co pozwala na wykrycie szybkich odpowiedzi neuronalnych na związki lotne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: ujawnia zależne od stężenia zapachu tworzenie się skupisk na mapach gęstości pozycji anten, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Wartość operacyjna: zapewnia ciągłość od fazy odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie reakcji wrodzonych w ramach manipulacji genetycznych i rozwojowych.
- Wartość prognostyczna: ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie bodźców sensorycznych z odpowiedziami behawioralnymi w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi w biologii odkrywczej, dostarczając ilościowych danych o ruchu wyrostków, co wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w walidacji celów chemosensorycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez klatka po klatce śledzenie reakcji czułków na bodźce chemiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne wyniki ilościowe z konwencjonalnych filmów z kamer internetowych.
- Analityka: Umożliwia porównywanie warunków poprzez analizę średnich zmian kąta nachylenia czułków oraz grupowanie map gęstości.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość badań przedklinicznych dzięki śledzeniu reakcji przy różnych stężeniach zapachów i warunkach eksperymentalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia wielokrotnego użytku, otwartoźródłową funkcjonalność do wysokoprzepustowego fenotypowania behawioralnego w różnych modelach owadów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez kwantyfikację retrakcji czułków indukowanych chemosensorycznie.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki oprogramowaniu open-source przetwarzającemu wideo 30 fps z prędkością ponad 120-krotnie większą niż ludzka.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji szlaków sensorycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko poprzez zależną od dawki klasteryzację pozycji czułków i przesunięcia średniego kąta.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu preparatyki owadów, unieruchamiania oraz wideobehawioralnego śledzenia ruchu.
- Niezbędna jest standardowa kamera internetowa, rozproszone oświetlenie oraz sprzęt do podawania zapachów wewnątrz dygestorium dla bodźców lotnych.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie unieruchamiania woskiem, pozycjonowania kamery oraz ustawień czułości filtrów.
- Wymagana jest adaptacja skalowania widżetu czujnika anteny dla różnych gatunków owadów i zakresów ruchu wyrostków.
- Ograniczenie praktyczne: optymalne śledzenie zależy od zminimalizowania cieni otoczenia oraz zbędnych ruchów w kadrze wideo.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Catching and Harnessing Honey Bees and Preparation of the Video Camera
3:17
Positioning Sensors and Video Analysis
4:25
Adjusting Filter Thresholds and Saving Results
5:31
Results: Appendage Tracking Software Demonstrates Higher Efficiency and Precision Compared to Human Raters
7:05
Conclusion
