Name: Procedury produkcyjne i pomiary dwójłomności do projektowania magnetycznie reagujących zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj procedury produkcji i pomiary dwójłomności zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców. Metoda umożliwia projektowanie układów o regulowanej odpowiedzi magnetycznej przy niskich polach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za finansowanie SMhardBi (numer projektu 200021_150088/1). Eksperymenty SANS przeprowadzono w szwajcarskim sspalacyjnym źródle neutronów SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Szwajcaria. Autorzy serdecznie dziękują dr. Joachimowi Kohlbrecherowi za jego wskazówki dotyczące eksperymentów SANS. Stanowisko do pomiaru dwójłomności w warunkach silnych pól magnetycznych zostało zainspirowane istniejącym układem w laboratorium magnetycznym wysokiego pola HFML w Nijmegen w Holandii. Dziękujemy Bruno Pfisterowi za pomoc w opracowaniu elektroniki układu dwójłomności, Janowi Corsano i Danielowi Kiechlowi za skonstruowanie szkieletów umożliwiających precyzyjne i łatwe ustawienie lasera oraz dr Bernhardowi Kollerowi za bieżące wsparcie techniczne.

<ol><li>Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/007965659480012X">Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).</li>
<li>Glover, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+evaluation+of+phospholipid+bicelles+for+solution-state+studies+of+membrane-associated+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules.</a> Biophys. J. 81 (4), 2163-2171 (2001).</li>
<li>Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bicellar%22+lipid+mixtures+as+used+in+biochemical+and+biophysical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">"Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies.</a> Naturwissenschaften. 92 (8), 355-366 (2005).</li>
<li>Sanders, C. R., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelles%3A+a+model+membrane+system+for+all+seasons%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Bicelles: a model membrane system for all seasons?</a> Structure. 6 (10), 1227-1234 (1998).</li>
<li>Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+detergent+meets+bilayer%3A+birth+and+coming+of+age+of+lipid+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).</li>
<li>Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magic+of+bicelles+lights+up+membrane+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">The magic of bicelles lights up membrane protein structure.</a> Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22257923">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method.</a> J. Vis. Exp. (59), (2012).</li>
<li>Barbosa-Barros, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelles%3A+lipid+nanostructured+platforms+with+potential+dermal+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications.</a> Small. 6, 807-818 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/is/content/articlelanding/2016/ra/c6ra18112k">Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery.</a> RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).</li>
<li>Beck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+type+of+bicellar+disks+from+a+mixture+of+DMPC+and+DMPE-DTPA+with+complexed+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides.</a> Langmuir. 26 (8), 5382-5387 (2010).</li>
<li>Liebi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tailored+phospholipid+bicelles+to+generate+magnetically+switchable+material%22">Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material</a>. , ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).</li>
<li>Liebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+enhanced+bicelles+delivering+switchable+anisotropy+in+optical+gels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS.+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels.</a> ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6 (2), 1100-1105 (2014).</li>
<li>Liebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+of+bicelles+studied+with+high-field+magnetic+birefringence+and+small-angle+neutron+scattering+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements.</a> Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).</li>
<li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering%3A+a+new+model+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).</li>
<li>Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanide+chelates+as+bilayer+alignment+tools+in+NMR+studies+of+membrane-associated+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides.</a> J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).</li>
<li>Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+increases+the+magnetic+aligning+of+bicellar+disks+from+an+aqueous+mixture+of+DMPC+and+DMPE-DTPA+with+complexed+thulium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions.</a> Langmuir. 28 (29), 10905-10915 (2012).</li>
<li>Liebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate+complexed+with+thulium+ions+integrated+into+bicelles+to+increase+their+magnetic+alignability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability.</a> J. Phys. Chem. B. 117 (47), 14743-14748 (2013).</li>
<li>Isabettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+bicelle+morphology+and+thermal+stability+with+lanthanide-chelating+cholesterol+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates.</a> Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).</li>
<li>Isabettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastering+the+magnetic+susceptibility+of+magnetically+responsive+bicelles+with+3%CE%B2-Amino-5-Cholestene+and+complexed+lanthanide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).</li>
<li>De Angelis, A. A., Opella, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+samples+for+solid-state+NMR+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2332-2338 (2007).</li>
<li>Son, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Q-Titration%22+of+long-chain+and+short-chain+lipids+differentiates+between+structured+and+mobile+residues+of+membrane+proteins+studied+in+bicelles+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">"Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).</li>
<li>Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation">https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation</a> (2017).</li>
<li>Isabettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Generating+Highly+Magnetically+Responsive+Lanthanide-Chelating+Phospholipid+Polymolecular+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies.</a> Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).</li>
<li>Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SANS+study+on+the+effect+of+lanthanide+ions+and+charged+lipids+on+the+morphology+of+phospholipid+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2487-2498 (2002).</li>
<li>Watts, A., Spooner, P. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+phase+transitions+as+revealed+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lip%22%5BJournal%5D)">Phospholipid phase transitions as revealed by NMR.</a> Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).</li>
<li>Bleaney, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022236472900273">Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions.</a> J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).</li>
<li>Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+studies+of+magnetically+aligned+phospholipid+membranes%3A+taming+lanthanides+for+membrane+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies.</a> Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).</li>
<li>Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chelate-induced+magnetic+alignment+of+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes.</a> Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).</li>
<li>Shklyarevskiy, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+alignment+of+self-assembled+anthracene+organogel+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers.</a> Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).</li>
<li>Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0921452604000766">Alignment of molecular materials in high magnetic fields.</a> Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).</li>
<li>Maret, G., Dransfeld, K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F3-540-13504-9_10">Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields.</a> Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).</li>
<li>Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+magnetic+birefringence+to+determine+the+molecular+arrangement+of+supramolecular+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 10 (1), 014601(2009).</li>
<li>Shklyarevskiy, I. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Deformation+and+ordering+of+molecular+assemblies+in+high+magnetic+fields%22">Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields</a>. , Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).</li>
<li>Fuller, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+GG+%22Optical+rheometry+of+complex+fluids%22">Optical rheometry of complex fluids</a>. , Oxford University Press. NY. (1995).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li>
<li>Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation">https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation</a> (2017).</li>
<li>Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet">https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet</a> (2017).</li>
<li>Isabettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+engineering+of+lanthanide+ion+chelating+phospholipids+generating+assemblies+with+a+switched+magnetic+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).</li>
<li>Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/1977/f2/f29777300209">Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect.</a> J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73 (2), 209-221 (1977).</li>
<li>Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-field+magnetic+birefringence+study+of+the+phase+behavior+of+concentrated+solutions+of+phospholipid+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules.</a> Phys. Rev. E. 48 (1), 328-339 (1993).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+paranematic+ordering+of+rigid+and+semiflexible+amyloid-Fe3O4+hybrid+fibrils+in+an+external+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field.</a> Biomacromolecules. 17 (8), 2555-2561 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegółowy opis tego, jak pomiary dwójłomności zostały wykorzystane w połączeniu z eksperymentami SANS do oceny metod generowania wysoce magnetycznie responsywnych zgrupowań fosfolipidów chelatujących Ln3+ , znajduje się w pracy Isabettini et al.23 Zaproponowane protokoły wytwarzania są również stosowalne dla zgrupowań składających się z dłuższych fosfolipidów DPPC i DPPE-DTPA lub dla tych zawierających chemicznie zmodyfikowane pochodne steroidów w swojej dwuwarstwie.<sup clas...

Bicele są dyskowymi zgromadzeniami polimolekularnymi otrzymywanymi z licznych mieszanin lipidowych.1,2,3,4,5 Są one szeroko stosowane do charakterystyki strukturalnej biomolekuł błonowych za pomocą spektroskopii NMR.6,7 Jednakże ostatnie wysiłki mają na celu rozszerzenie zakresu możliwych zastosowań.5,8,9 Najczęściej badanym systemem biceli jest mieszanina 1,2-dimyrystoylo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DMPC), stanowiącej płaską część zgromadzenia, oraz fosfolipidu 1,2-diheksanoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DHPC) pokrywającej krawędź.1,2,3 Geometria molekularna fosfolipidów tworzących dwuwarstwę determinuje architekturę samoorganizującej się struktury polimolekularnej.4,5 Zastąpienie DHPC związkiem DMPE-DTPA pozwala na otrzymanie systemów biceli o wysokiej podatności magnetycznej i możliwości regulacji.10,11 Bicele DMPC/DMPE-DTPA/Ln3+ (stosunek molowy 4:1:1) wiążą znacznie więcej paramagnetycznych jonów lantanowców (Ln3+) na powierzchni dwuwarstwy, co skutkuje wzmocnioną odpowiedzią magnetyczną.10 Ponadto zastąpienie rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek DHPC kompleksami DMPE-DTPA/Ln3+ umożliwia tworzenie biceli odpornych na rozcieńczanie.11
Magnetyczna zdolność do wyrównywania planarnych zgromadzeń polimolekularnych jest determinowana przez ich całkowitą energię magnetyczną,
<img alt="Równanie równowagi statycznej E_mag=-nΔχB²/2μ₀Nₐ, schemat do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> (1)
gdzie B to natężenie pola magnetycznego, <img alt="Równania przenikalności magnetycznej μ₀=4π×10⁻⁷; kluczowy wzór na schemacie koncepcji fizycznej." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> stała magnetyczna, n liczba agregacji oraz <img alt="Δχ w równaniu statycznej równowagi; ΣFx=0; schemat metody; użytek edukacyjny." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> molekularna anizotropia podatności diamagnetycznej lipidów tworzących dwuwarstwę. W związku z tym odpowiedź bicelli DMPC/DMPE-DTPA/Ln3+ na pola magnetyczne jest określana przez ich rozmiar (liczba agregacji n) oraz molekularną anizotropię podatności diamagnetycznej Δχ. Tę ostatnią można łatwo zmienić poprzez modyfikację rodzaju chelatowanego Ln3+.12,13,14,15 Wprowadzenie cholesterolu (Chol-OH) lub innych pochodnych steroidowych do dwuwarstwy daje możliwość regulacji zarówno liczby agregacji n, jak i podatności magnetycznej Δχ zgromadzeń.11,16,17,18,19 Dla danego składu lipidów większe zgromadzenia zawierają więcej lipidów zdolnych do przyczyniania się do Emag (większa liczba agregacji n), co skutkuje większą liczbą gatunków podatnych na orientację. Rozmiar bicelli DMPC/DHPC jest na przykład konwencjonalnie kontrolowany poprzez optymalizację stosunku składników lipidowych lub całkowitego stężenia.20,21,22 Chociaż jest to możliwe w bicellach DMPC/DMPE-DTPA/Ln3+, ich termoodwracalna transformacja z bicelli w pęcherzyki podczas ogrzewania oferuje dodatkowe opcje modyfikacji. Metody mechaniczne, takie jak ekstruzja przez filtry membranowe, pozwalają na kształtowanie pęcherzyków. Bicelle podatne na orientację magnetyczną są regenerowane po schłodzeniu do 5 °C, a ich wymiary zależą od pęcherzyków prekursorowych.11 W niniejszej pracy skupiamy się na potencjale procedur mechanicznego wytwarzania z użyciem DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 4:1:1) lub DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 16:4:5:5) jako układów referencyjnych. Proces przebiega analogicznie w przypadku zastosowania innych Ln3+ niż Tm3+. Szeroki zakres możliwości oferowanych przez te techniki przedstawiono na Rysunku 1 i szczegółowo omówiono w innym opracowaniu.23
<img alt="Schemat hydratacji i ekstruzji filmu lipidowego; DMPC, cholesterol; efekty temperatury; formowanie pęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56812/56812fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd możliwych procedur wytwarzania. Badane polimolekularne kompleksy chelatujące Ln3+, podatne na uporządkowanie magnetyczne, składają się z DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 4:1:1) lub DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 16:4:5:5). Suchy film lipidowy jest hydratowany buforem fosforanowym 50 mM o wartości pH 7,4, a całkowite stężenie lipidów wynosi 15 mM. Efektywna hydratacja filmu lipidowego wymaga zastosowania cykli zamrażania i rozmrażania (FT) lub cykli ogrzewania i chłodzenia (H&amp;C). Cykle H&amp;C są niezbędne do regeneracji próbek po ostatnim etapie zamrażania i rozmrażania lub do regeneracji próbek przechowywanych w zamrożonym stanie przez dłuższy czas, jeżeli mają one zostać użyte bez dalszej ekstruzji. Kroki te zostały szczegółowo omówione przez Isabettini et al.23 Uzyskano kompleksy polimolekularne o maksymalnej podatności na uporządkowanie, co pozwoliło na otrzymanie różnych architektur kompleksów w zależności od składu lipidowego. Rozmiar biceli i stopień ich uporządkowania magnetycznego można regulować poprzez ekstruzję (Ext) przez membrany filtracyjne z nanoporami. Przedstawione czynniki uporządkowania Af zostały obliczone na podstawie dwuwymiarowych dyfraktogramów z małokątowego rozpraszania neutronów (SANS) dla próbki DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 16:4:5:5) ekstruowanej przez pory o rozmiarach 800, 400, 200 lub 100 nm. Pomiary SANS są uzupełniającym sposobem ilościowego określania uporządkowania biceli, który nie zostanie tutaj omówiony bardziej szczegółowo.11,16 Wartość Af mieści się w zakresie od -1 (równoległe rozpraszanie neutronów lub prostopadłe uporządkowanie biceli względem kierunku pola magnetycznego) do 0 dla rozpraszania izotropowego. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56812/56812fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Struktura bicele została szeroko zbadana za pomocą wielu technik charakteryzacji.13 Orientację bicele poddanych działaniu pola magnetycznego ilościowo określano, wykorzystując spektroskopię NMR lub eksperymenty małokątowego rozpraszania neutronów (SANS).5,10,11,12,13,16,17,18,19,24,25 Jednakże przesunięcie i poszerzenie sygnałów NMR występujące w obecności Ln3+ stanowią poważne ograniczenia tej metody.15,26,27,28 Chociaż eksperymenty SANS nie obarczone są tym ograniczeniem, pożądane są alternatywne i bardziej dostępne techniki do rutynowego określania ilościowo orientacji indukowanej magnetycznie agregatów w roztworze. Pomiary dwójłomności stanowią realną i stosunkowo prostą alternatywę. Podobnie jak w eksperymentach NMR, pomiary dwójłomności dostarczają cennych informacji na temat reorganizacji lipidów i faz lipidowych występujących w dwuwarstwie. Ponadto monitorowane są transformacje geometryczne zachodzące w agregacie polimolekularnym przy zmianie warunków środowiskowych, takich jak temperatura.11,12,13,16 Dwójłomność indukowana magnetycznie Δn′ była wykorzystywana do badania różnych rodzajów układów fosfolipidowych.13,29,30 Pomiary dwójłomności oparte na technice modulacji fazy w polu magnetycznym są skuteczną metodą wykrywania orientacji bicele.12,16,18,29,31,32 Możliwość badania bicele za pomocą dwójłomności w wysokich polach magnetycznych do 35 T została również wykazana przez M. Liebi et al.13
Gdy światło spolaryzowane wpada do materiału anizotropowego, ulega ono załamaniu na falę zwykłą i nadzwyczajną.11 Dwie te fale mają różne prędkości i są przesunięte w fazie o opóźnienie δ. Stopień opóźnienia δ jest mierzony i przeliczany na sygnał dwójłomności <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widmowego." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5">, aby ilościowo określić stopień anizotropii w materiale przy użyciu
<img alt="Równanie zmiany współczynnika załamania Δn'=-δλ/2πd; formuła do analizy pomiarów optycznych." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> (2)
gdzie λ jest długością fali lasera, a d jest grubością próbki. Fosfolipidy są optycznie anizotropowe, a ich oś optyczna pokrywa się z długimi osiami cząsteczkowymi, równolegle do ogonów węglowodorowych.11,12 Brak retardacji odnotowuje się, gdy fosfolipidy są zorientowane w roztworze w sposób losowy. Retardację mierzy się, gdy fosfolipidy są ustawione równolegle względem siebie. Magnetycznie indukowane dwójłomność <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widma." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5"> może mieć znak dodatni lub ujemny w zależności od orientacji cząsteczek w polu magnetycznym; patrz Rycina 2. Fosfolipidy ustawione równolegle do osi x spowodują ujemną wartość <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widma." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5">, natomiast te ustawione wzdłuż osi z spowodują wartość dodatnią <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widma." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5">. Nie obserwuje się dwójłomności, gdy oś optyczna pokrywa się z kierunkiem propagacji światła, gdy fosfolipid jest ustawiony równolegle do osi y.
<img alt="Diagram równowagi statycznej ze źródłem światła, polem magnetycznym (B), ruchem Browna i równaniami Δn'." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56812/56812fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Orientacja fosfolipidów i odpowiadający jej znak magnetycznie indukowanego dwójłomowania <img alt="Symbol Δn', koncepcja zmiany współczynnika załamania światła w badaniach optycznych." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 12">. Znak zmierzonego <img alt="Symbol Δn', koncepcja zmiany współczynnika załamania światła w badaniach optycznych." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 12"> zależy od orientacji fosfolipidu w polu magnetycznym. Linie przerywane wskazują oś optyczną cząsteczki. Światło jest spolaryzowane pod kątem 45° i rozchodzi się w kierunku y. Pole magnetyczne B znajduje się w kierunku z. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy M. Liebi.11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56812/56812fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W przypadku izotropowej zawiesiny koloidalnej biceli orientacja wynikająca z układu fosfolipidów w dwuwarstwie zostanie utracona, co sprowadzi opóźnienie δ do zera. Bicele muszą ulec uporządkowaniu, aby zorientować optycznie aktywne fosfolipidy w ich dwuwarstwach, co powoduje opóźnienie δ światła spolaryzowanego. W konsekwencji dwójłomność jest czułym narzędziem do ilościowego określania zdolności do wyrównywania magnetycznego kompleksów polimolekularnych. Bicele uporządkowane prostopadle do pola magnetycznego dadzą dodatnią wartość <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widma." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5">, natomiast te uporządkowane równolegle dadzą wartość ujemną <img alt="Δn', zmiana współczynnika załamania, badanie optyczne, wzór, fotonika, diagram dopasowania widma." src="/files/ftp_upload/56812/56812eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5">. Znak zależy od ustawienia aparatury i może zostać sprawdzony na próbce referencyjnej.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td>>99%</td></tr><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-dietylenotriaminooctan kwasu heksmonowego (DMPE-DTPA)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790535P</td><td>>99%</td></tr><tr><td>chlorek tulu(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439649</td><td>bezwodny, proszek, 99,9% na bazie metali śladowych</td></tr><tr><td>Chlorek dysprozu(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>325546</td><td>bezwodny, proszek, 99,9% na bazie metali śladowych</td></tr><tr><td>Chlorek iterbu(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439614</td><td>bezwodny, proszek, 99,9% na bazie metali śladowych</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319988</td><td>zawiera etanol jako stabilizator, odczynnik ACS, &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amresco</td><td>433</td><td>Ultra czysty</td></tr><tr><td>gatunek D2O</td><td>ARMAR chemikalia</td><td>1410</td><td>99,8 atom % D</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Millipore</td><td></td><td>Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)</td></tr> <tr><td>elektroniczny miernik pH</td><td>Metrohm</td><td>17440010</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtr membranowy</td><td>VWR</td><td>515-2028</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Nuclepore 25 mm Filtr membranowy 200nm</td><td>VWR</td><td>515-2029</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm</td><td>VWR</td><td>515-2030</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm</td><td>VWR</td><td>515-2032</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Bibuła filtracyjna</td><td>VWR</td><td>230600</td><td></td></tr><tr><td>25 ml kolba okrągłodenna</td><td>VWR</td><td>201-1352</td><td>14/23 NS</td></tr><tr><td>Szklany kubek zatrzaskowy 3 ml</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td>ND18, 18x30mm</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka 2,5 ml</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu dwuwodny</td><td>Merk</td><td>1.06342</td><td>Sól używana do produkcji buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>wodorofosforan sodu</td><td>Merk</td><td>1.06586</td><td>Sól używana do produkcji buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Carbagas</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gazowy azot pod ciśnieniem</td><td>Carbagas-butelka</td><td></td> <td>barowa</td></tr><tr><td>Wytłaczarka lipidowa 10 ml</td><td>Lipex-W</td><td></td> <td>pełni wyposażona w termobeczkę</td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowa rura PVC</td><td>GR NETUM-musi</td><td></td> <td>wytrzymać więcej niż 4 MPa</td></tr><tr><td>Adaptery Serto</td> Rękawice <td>Sertot-nitrylowe</td><td></td><td></td></tr> Szklane pipety <tr><td></td><td></td><td></td> VWR-2 <td></td></tr><tr><td>ml</td><td>VWR</td><td>612-1702</td> Laser diodowy o <td>długości 230 mm</td></tr><tr><td>Newport</td><td></td><td>LPM635-25C</td><td></td></tr><tr><td>DSP Dwufazowy wzmacniacz blokujący</td><td>SRS</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Detektor fotodiody</td><td>Silonex Inc.</td><td>SLSD-71N5</td><td>5mm2, krzem, fotoprzewodzący</td></tr><tr><td>5,5 T Kriogeniczny magnetyczny</td><td>kriogeniczny / Oerlikon AG-12</td><td></td> <td>bar chłodzony elektrociepłownie. Sprężarka RW4000/6000, kriogłowica RGD 5/100 TA</td></tr><tr><td>Filtr dolnoprzepustowy drugiego rzędu</td> do <td>budowy w domu</td><td></td> <td>Zasilacz liniowy 24V DC, drugiego rzędu, klucz Sallen, częstotliwość odcięcia 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA</td></tr><tr><td>Modulator fotoelastyczny</td><td>Hinds</td><td>instruments PEM-90</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polaryzator kalcytowy</td><td>Newport</td><td>10GT04</td><td>o średnicy 25,4 mm</td></tr><tr><td>Kuweta na próbki kwarcowe</td><td>Hellma</td><td>165-10-40</td><td>Cela z kontrolowaną temperaturą, 0,8 ml, długość ścieżki 10 mm</td></tr><tr><td>Sonda temperatury</td><td>Thermocontrol-Typ</td><td></td> <td>K, średnica 0,5 mm, Thermocoax</td></tr><tr><td>Lustra niepolaryzacyjne</td><td>Newport</td><td>50326-1002</td><td></td></tr><tr><td>RS 232</td> 25,4 mm <td>National Instruments</td><td>189284-02</td><td>Do podłączenia do portu RS-232 z przodu kompaktowych sterowników FieldPoint</td></tr><tr><td>BNC 50 i Omega; i złącza</td><td>National Instruments</td><td>763389-01</td><td></td></tr><tr><td>cFP-AI-110</td><td>National Instruments</td><td>777318-110</td><td>8-kanałowy analogowy moduł wejściowy napięcia i prądu do kompaktowego FieldPoint</td></tr><tr><td>cFP-CB-1</td><td>National Instruments</td><td>778618-01</td><td>Zintegrowany blok złączy do okablowania do Compact FieldPoint I/O</td></tr><tr><td>cFP-CB-3</td><td>National Instruments</td><td>778618-03</td><td>Zintegrowany blok złączy izotermicznych do podłączenia termopar do modułu cFP-TC-120</td></tr><tr><td>cFP-TC-120</td><td>National Instruments</td><td>777318-120</td><td>8-kanałowy moduł wejściowy termopary do kompaktowego FieldPoint</td></tr><tr><td>cFP-1804</td><td>National Instruments</td><td>779490-01</td><td>Interfejs Ethernet/szeregowy dla NI Compact FieldPoint</td></tr><tr><td>LabView 2010</td><td>National Instruments-Industrial</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>power zasilanie</td><td>Traco Power</td><td>TCL 060-124</td><td>100-240V AC</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Julabo</td><td>FP40-HE</td><td>cyrkulator chłodniczy/grzewczy</td></tr></tbody></table>

procedury produkcyjne i pomiary dwójłomności do projektowania magnetycznie reagujących zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców

Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies

Dwucele to przestrajalne, podobne do dysku zespoły polimolekularne, utworzone z dużej różnorodności mieszanin lipidowych. Zastosowania obejmują zarówno badania strukturalne białek błonowych za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), jak i osiągnięcia nanotechnologiczne, w tym tworzenie optycznie aktywnych i magnetycznie przełączalnych żeli. Takie technologie wymagają dużej kontroli wielkości zespołu, odpowiedzi magnetycznej i odporności termicznej. Mieszaniny 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DMPC) i jej koniugatu chelatującego fosfolipidów jonów lantanowców (Ln3+), 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfo-etanolotriaminopentaoctanu (DMPE-DTPA), łączą się w wysoce wrażliwe magnetycznie zestawy, takie jak dwucele DMPC / DMPE-DTPA / Ln3+ (stosunek molowy 4:1:1). Wprowadzenie cholesterolu (Chol-OH) i pochodnych steroidów w dwuwarstwie skutkuje powstaniem kolejnego zestawu o unikalnych właściwościach fizykochemicznych. Dla danego składu lipidowego dopasowalność magnetyczna jest proporcjonalna do wielkości bicellego. Kompleksowanie Ln3+ powoduje bezprecedensowe reakcje magnetyczne zarówno pod względem wielkości, jak i kierunku wyrównania. Termoodwracalne zapadanie się struktur przypominających dyski w pęcherzyki po podgrzaniu pozwala na dostosowanie wymiarów zespołów poprzez wytłaczanie przez filtry membranowe o określonych rozmiarach porów. Magnetycznie ustawiane bicele są regenerowane przez schłodzenie do 5 °C, co skutkuje wymiarami montażowymi określonymi przez prekursory pęcherzyków. W tym miejscu wyjaśniono tę procedurę wytwarzania, a wyrównalność magnetyczną zespołów określa się ilościowo za pomocą pomiarów dwójłomności w polu magnetycznym 5,5 T. Sygnał dwójłomności, pochodzący z dwuwarstwy fosfolipidowej, umożliwia dodatkowo monitorowanie zmian polimolekularnych zachodzących w dwuwarstwie. Ta prosta technika jest uzupełnieniem eksperymentów NMR, które są powszechnie stosowane do charakteryzowania dwuceli.

Sygnał dwójłomności próbki nieekstrudowanego DMPC/DMPE-DTPA/Tm3+ (stosunek molowy 4:1:1) monitorowano w polu magnetycznym o indukcji 5,5 T podczas cyklu ogrzewania i chłodzenia w zakresie od 5 do 40 °C i z powrotem z szybkością 1 °C/min (Rysunek 6). Wyniki pomiarów dwójłomności potwierdziły silne uporządkowanie magnetyczne w temperaturze 5 °C, z wartością 1,5 x 10-5, co jest wynikiem dwukrotnie wyższym niż w przypadku opisanych układów e...

Przedstawiono procedury wytwarzania wysoce reagujących magnetycznie zespołów polimolekularnych chelatujących jony lantanowców. Odpowiedź magnetyczna jest podyktowana rozmiarem zespołu, który jest dostosowywany przez wytłaczanie przez membrany nanoporowe. Podatność magnetyczna zespołów i zmiany strukturalne wywołane temperaturą są monitorowane za pomocą pomiarów dwójłomności, techniki uzupełniającej magnetyczny rezonans jądrowy i rozpraszanie neutronów pod małym kątem.

Procedury produkcyjne i pomiary dwójłomności do projektowania magnetycznie reagujących zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców

Bicelles are tunable disk-like polymolecular assemblies formed from a large variety of lipid mixtures. Applications range from membrane protein structural ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie wysoce reagujących magnetycznie zespołów polimolekularnych chelatujących jony lantanowców oraz łatwe monitorowanie odpowiedzi magnetycznej za pomocą pomiarów dwójłomności. Pomiary dwójłomności mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące projektowania magnetycznie reagujących zespołów polimolekularnych, takich jak bicele, zapewniając alternatywny i stosunkowo łatwy sposób monitorowania wyrównania. Główną zaletą tych wielocząsteczkowych zespołów jest zdolność do dostarczania niewyrafinowanej i przestrajalnej odpowiedzi magnetycznej przy natężeniu pola tak niskim, jak jedna lub dwie tesle, poprzez kojarzenie z liczbami na jony lantanowców magnetycznych.Chociaż monitorowanie głowicy naprowadzającej dwójłomność dostarcza ważnych informacji dla projektu dwułomności, może również mieć zastosowanie do badania innych systemów reagujących magnetycznie, takich jak neurokrystaliczne sedolo lub włókna amyloidowe domieszkowane nanocząstkami tlenku żelaza. Aby rozpocząć procedurę, użyj szklanej strzykawki o pojemności 2,5 mililitra i trzech mililitrowych fiolek z zatrzaskami, aby odmierzyć potrzebne ilości roztworów podstawowych DMPC, DMPE-DTPA, cholesterolu i chlorku tulu(III). Połączyć roztwory podstawowe w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 mililitrów.Przepłukać każdą fiolkę do kolby z 2,5 mililitrem rozpuszczalnika użytego w odpowiednim roztworze podstawowym. Zacisknąć kolbę na wyparce obrotowej. Usunąć rozpuszczalnik z mieszaniny w temperaturze 40 stopni Celsjusza poniżej 30 000 paskali, aż pozostanie tylko lepka przezroczysta warstwa.Zmniejsz ciśnienie do 100 paskali i kontynuuj pobieranie próbki przez co najmniej dwie godziny, aby uzyskać suchy film lipidowy. Następnie przepłukać kolbę argonem przez jedną minutę. Uszczelnić kolbę folią parafinową i przechowywać próbkę w temperaturze 18 stopni Celsjusza.Gdy będziesz gotowy do ponownego nawodnienia lipidu, dodaj do kolby trzy mililitry 15-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,4. Obracać kolbę w kąpieli ciekłego azotu, aż próbka zostanie całkowicie zamrożona, na co wskazuje fakt, że ciekły azot już nie wrze. Następnie obracać kolbę przez 5 minut w łaźni wodnej ustawionej na 60 stopni Celsjusza.Gdy próbka stanie się całkowicie płynna, należy ją wirować przez 30 sekund. Po ostatnim etapie zamrażania ustabilizować próbkę za pomocą dwóch cykli ogrzewania i chłodzenia. Po pierwsze, należy zaopatrzyć się w wytrawione ścieżki filtry membranowe z poliwęglanu o pożądanej wielkości porów do wytłaczania.Rozpocznij montaż 10-mililitrowej wytłaczarki lipidowej z naczyniem na próbkę z płaszczem, wspomaganym pęsetą z silikonową końcówką. Użyj kilku kropli buforu fosforanowego, aby zwilżyć siatkę nośną i poliestrową tarczę drenażową, aby uzyskać optymalne umieszczenie filtra membranowego. Ostrożnie połóż O-ring na filtrze membranowym.Upewnij się, że na membranie nie ma fałd ani zagnieceń. Zakończ montaż wytłaczarki lipidowej i podłącz naczynie na próbkę z płaszczem do cyrkulatora wody o kontrolowanej temperaturze. Podgrzej łaźnię wodną cyrkulacyjną do 60 stopni Celsjusza i rozpocznij cyrkulację.Podłącz wytłaczarkę do butli z azotem pod ciśnieniem za pomocą wysokociśnieniowej rurki PVC i szybkozłączek. Ustaw ciśnienie wytłaczania na odpowiednią wartość dla wielkości porów membrany. Użyj szklanej pipety o pojemności dwóch mililitrów, aby dodać próbkę do naczynia z płaszczem.Zamknąć naczynie i pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 30–60 sekund. Umieścić koniec rurki wylotowej próbki w kolbie do pobierania próbek. Następnie otwórz przepływ azotu do wytłaczarki, trzymając stabilnie rurkę wylotową próbki.Po zakończeniu wytłaczania próbki odpowietrz wytłaczarkę i użyj tej samej szklanej pipety o pojemności dwóch mililitrów, aby przenieść wytłaczaną próbkę do naczynia z płaszczem. Wykonaj w ten sposób 10 cykli ekstruzji. Wymiana filtra membranowego za każdym razem, gdy zaczyna się zatykać.W razie potrzeby powtórz wytłaczanie przez pory o mniejszych rozmiarach. Włącz i ustaw aparaturę do pomiaru dwójłomności. Następnie umieść próbkę w kuwecie kwarcowej o kontrolowanej temperaturze i długości ścieżki 10 milimetrów.Podłącz kuwetę do zewnętrznej łaźni wodnej ustawionej na pięć stopni Celsjusza. Włóż termoparę typu k o grubości 0,5 milimetra do próbki przez otwór w nasadce. Dostosuj temperaturę łaźni wodnej w oparciu o odczyt termopary, aż próbka osiągnie pięć stopni Celsjusza.Umieść kuwetę w otworze magnesu. Sprawdź, czy termopara nie znajduje się na ścieżce lasera, trzymając arkusz papieru na ścieżce lasera poza kuwetą i szukając cieni rzucanych przez termoparę. Ważne jest, aby bezpośrednio monitorować temperaturę próbki, ale sonda nie może przeszkadzać w świetle lasera.Można to łatwo sprawdzić za pomocą białego papieru umieszczonego na ścieżce lasera za kuwetą i szukającego cieni. Zastosuj stały przepływ suchego sprężonego powietrza o temperaturze pokojowej o natężeniu 10 000 paskali do kuwety, aby uniknąć tworzenia się kondensacji. Wybierz amplifier mnożniki czułości, upewniając się, że amplifier nie jest przeciążony, a na wyświetlaczu pojawiają się nie więcej niż cztery czerwone paski.Następnie automatycznie przełącz oba wzmacniacze blokujące. Zmętnienie próbki może ulec drastycznej zmianie podczas cyklu temperaturowego z powodu przegrupowań polimolekularnych. Najwyższe zmętnienie występuje zwykle w niskich temperaturach i aby uniknąć przeciążenia sygnału po podgrzaniu, czułość nie może być ustawiona zbyt wysoko na pięć stopni Celsjusza.Wpisz nazwę próbki i czułość wzmacniacza lock-in. Wprowadź nazwę pliku dla pomiaru i rozpocznij rejestrowanie danych. Następnie zwiększ pole magnetyczne do 5,5 Tesli za pomocą programu pomiarowego.Zbieraj dane o sygnale dwójłomności przy różnych temperaturach próbki i natężeniu pola magnetycznego zgodnie z potrzebami. Sygnał dwójłomności biceli domieszkowanych cholesterolem wytłaczanych przez błony o porach 800 nanometrów wzrastał wraz ze wzrostem natężenia pola magnetycznego, osiągając szczytową dwójłomność przy 5,5 Tesli. Kolejne wytłaczanie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez membrany o zmniejszających się rozmiarach porów skutkowało zmniejszeniem wartości dwójłomności przy pięciu stopniach Celsjusza.Zaobserwowano również zmniejszenie bezwzględnego współczynnika dopasowania. Wyniki te wskazały, że wyrównanie magnetyczne można dostroić, dostosowując rozmiary bicelli poprzez ekstruzję ich prekursorów pęcherzyków. Po opanowaniu, technika ta może być stosowana codziennie, aby skutecznie przebadać wiele próbek i zidentyfikować najbardziej obiecujących kandydatów, zapewniając optymalne magnetyczne wiązania rywalne w wymaganym zakresie temperatur.Po udanej identyfikacji najbardziej obiecującej próbki za pomocą tej procedury, można przeprowadzić metody takie jak rozpraszanie neutronów pod małym kątem lub kriotransmisyjna mikroskopia elektronowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące struktury fizycznych właściwości chemicznych zespołów. Podczas pracy z zespołami lipidowymi, takimi jak prezentowane tutaj bicele, ważne jest, aby pracować z czystymi naczyniami szklanymi w spokojnym otoczeniu. Zalecamy poświęcenie do tej pracy naczyń szklanych i mycie chloroformem.

fabrication-procedures-birefringence-measurements-for-designing

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Prezentujemy proces metalacji, oczyszczania i charakterystyki kompleksów lantanowców. Opisane tutaj kompleksy mogą być sprzęgane z makrocząsteczkami, co umożliwia śledzenie tych cząsteczek za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym.

Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do zastosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.

Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Poznaj procedury produkcji i pomiary dwójłomności zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców. Metoda umożliwia projektowanie układów o regulowanej odpowiedzi magnetycznej przy niskich polach.

Procedury produkcyjne i pomiary dwójłomności do projektowania magnetycznie reagujących zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców (Wideo) | JoVE Journal

Procedury produkcyjne i pomiary dwójłomności do projektowania magnetycznie reagujących zespołów fosfolipidów chelatujących jony lantanowców

Przeglądaj więcej filmów