Stworzenie strukturalnie realistycznego modelu geometrycznego kardiomiocytów metodą elementów skończonych w celu zbadania roli architektury komórkowej w biologii układów kardiomiocytów
April 18th, 2018
Ten protokół przedstawia nowatorską metodę tworzenia przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury kardiomiocytów na podstawie obrazów z mikroskopii elektronowej i mikroskopii konfokalnej. Moc tego szczegółowego przestrzennie modelu została zademonstrowana na podstawie studiów przypadków z zakresu sygnalizacji wapniowej i bioenergetyki.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury komórki serca. Model ten jest tworzony na podstawie danych z mikroskopii elektronowej i konfokalnej. Takie modele można wykorzystać do badania roli architektury komórkowej na funkcję komórek serca.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób zmiany w wewnętrznej organizacji komórki oraz warunki zdrowotne i chorobowe mogą wpływać na biologię systemów komórek serca. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na integrację uzupełniających się informacji z mikroskopii elektronowej i mikroskopii konfokalnej w celu stworzenia przestrzennie szczegółowego modelu architektury komórkowej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię układu komórkowego serca, ale to ogólne ogólne podejście, może być również stosowana na innych komórkach, w których musimy zrozumieć wpływ struktury komórkowej na funkcję komórki.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki symulacji i mapowania kanałów jonowych na siatkę drobniejszych elementów są tak nowe. Po preparacji wycinków tkanek wolnej ściany lewej komory i zobrazowaniu ich za pomocą tomografii elektronowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy wykonać program IMOD 3dmod. W graficznym interfejsie użytkownika wprowadź adres pliku rec lub mrc, który zawiera zrekonstruowany w 3D zestaw danych obrazu komórki, w polu wprowadzania oznaczonym Pliki obrazów, a następnie naciśnij przycisk OK.
Następnie w menu pliku wybierz Nowy model. Następnie, korzystając z elementu menu Zapisz model jako, zapisz plik o odpowiedniej nazwie. W menu Specjalne wybierz Narzędzia do rysowania, a następnie wybierz opcję Rzeźbienie i przesuń mysz do okna obrazu.
Pojawi się okrągły kontur wyśrodkowany na wskaźniku myszy. Przytrzymując środkowy przycisk myszy nad mitochondrium, które jest ciemniejszym obszarem plików obrazu, przeciągnij obwód konturu okręgu do kształtu jego granicy. Po zakończeniu konturowania granicy mitochondrium zwolnij środkowy przycisk i powtórz ten proces dla każdego mitochondrium w danych.
Każdy kontur zostanie automatycznie rozpoznany przez IMOD jako nowy kontur w tym samym obiekcie. W menu Edytuj obiekt wybierz opcję Nowy, aby utworzyć nowy obiekt. Spowoduje to automatyczne zwiększenie całkowitej liczby obiektów o jeden i przypisanie tego numeru do nowego obiektu.
Użyj opcji Sculpt, aby podzielić na segmenty i zapisać kontury miofibryli. Podziel również granicę komórki na segmenty, a następnie w menu Plik zapisz plik modelu. Po pobraniu iso2mesh zgodnie z protokołem tekstowym, pobierz kody źródłowe i dane do symulacji klastrów RyR na siatce ze strony GitHub pokazanej tutaj.
Uruchom aplikację Heart Cell Mesh Generator MATLAB. Następnie, za pomocą trzech przycisków w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika, załaduj różne maski składników organelli do MATLAB. Aby utworzyć kolejny binarny stos obrazów, który wyznacza odstępy między miofibrylami a mitochondriami, otwórz obraz J, a następnie, korzystając z okna dialogowego Otwórz plik, załaduj do programu stosy TIFF miofibryli i mitochondriów.
Uruchom wtyczkę Dodawanie obrazów, wybierając opcję Process Calculator Plus. Wybierz stos obrazów miofibryli jako I1, stos obrazów mitochondriów jako I2 i wybierz operator Dodaj, a następnie kliknij przycisk OK. Po wyświetleniu nowego stosu obrazów reprezentującego wynik wybierz opcję Edytuj odwrócenie, aby utworzyć stos obrazów.
Załaduj plik zawierający binarny stos obrazów przerw między miofibrylami a mitochondriami, naciskając przycisk pliku RyR Gaps w programie Cardiac Cell Mesh Generator, a następnie naciśnij Generuj siatkę w graficznym interfejsie użytkownika. Wygeneruj niezbędne dane wejściowe dla symulatora RyR, naciskając przycisk oznaczony jako Generuj dane wejściowe symulatora RyR-Simulator w graficznym interfejsie użytkownika. Po wykonaniu funkcji sprawdź, czy następujące pliki zostały utworzone w katalogu określonym jako ścieżka OUT_DIR, d_axial_micron.
txt, który reprezentuje odległość osiową między położeniem dysku Z a pozostałymi pikselami w stosie obrazów, plik d_radial_micron. txt, który reprezentuje odległość euklidesową z wyłączeniem składowej osiowej od każdego piksela w zestawie możliwych lokalizacji klastra RyR do pikseli na płaszczyźnie dysku Z, W W_micro. txt, który reprezentuje listę współrzędnych przestrzennych wszystkich dostępnych pozycji dla klastrów RyR, które mają być obecne.
Pozostałe trzy pliki w folderze zawierają przyrostek piksel, a nie mikron, co oznacza, że wartości w tych plikach zostały zapisane w postaci współrzędnych pikseli. Aby zasymulować rozkłady klastrów RyR na binarnym stosie obrazów miofibryli, naciśnij przycisk oznaczony Otwórz symulator RyR w R, aby zainicjować program R. W graficznym interfejsie użytkownika języka R wybierz pozycję Otwórz plik, a następnie w pakiecie RyR-Simulator znajdź ustawienia pliku.
R.Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienia parametrów w tym polu i wartości domyślnych. Użytkownicy powinni sprawdzić symulowany rozkład klastrów RyR w oknie R i dostosować ustawienia, aby upewnić się, że klastry znajdują się w pobliżu dysków Z i są równomiernie rozłożone w całym przekroju komórki. Aby odwzorować punkty jako gęstości przestrzenne na modelu obliczeniowym za pomocą generatora siatki komórek serca, wybierz przycisk oznaczony Wybierz plik punktów RyR i wybierz symulowany plik tekstowy rozkładu klastra RyR spośród tych, które zostały wyprowadzone przez symulator RyR.
Na koniec w graficznym interfejsie użytkownika w MATLABie uruchom RyR Density Mapper. Użytkownicy powinni sprawdzić wizualnie, czy wartości gęstości są rozłożone w taki sposób, że sąsiedztwa o wysokich wartościach gęstości są podobne do rozmiaru klastrów RyR w danych eksperymentalnych. Te obrazy w jasnym polu pokazują, jak wyglądają komórki, gdy są zorientowane wzdłużnie, ukośnie i przekrojowo w stosunku do płaszczyzny cięcia.
Próbki ukośne i podłużne wykazują prążki, podczas gdy próbki przekrojowe nie. Kapilary wydają się również bardziej okrągłe w widokach przekrojowych niż w widokach ukośnych. Panel ten reprezentuje dobrej jakości stos tomogramu, który można uzyskać, gdy przestrzegana jest część tego protokołu dotycząca przygotowania tkanek.
Ostrożność i doświadczenie są niezbędne, aby zapewnić, że bloki tkanek są wystarczająco wybarwione i że istnieje równomierny rozkład cząstek złota koloidalnego w objętości tkanki. Pokazany tutaj jest segmentowany model 3D miofibryli i mitochondriów. To renderowanie 3D siatki czworościennej jest tworzone przez iso2mesh.
Tak długo, jak oryginalny stos obrazów i zadania segmentacji są dobrej jakości, ten krok jest dość solidny. Na koniec panele te pokazują trzy przykłady symulowanych klastrów RyR w tej samej topologii siatki po użyciu algorytmu estymatora intensywności jądra sferycznego. Zwróć uwagę na różnice w organizacji klastrów RyR.
Po opanowaniu i prawidłowym wykonaniu strukturalnie realistycznego modelu komórki serca metodą elementów skończonych, można go wygenerować w ciągu kilku godzin przy użyciu naszej techniki. Podążając za tą procedurą, symulacjami elementów skończonych sygnalizacji wapniowej, bioenergetyki serca i mechaniki komórkowej, można przeprowadzić badania, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące roli architektury komórkowej w funkcjonowaniu kardiomiocytów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę stworzenia przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury kardiomiocytów na podstawie obrazów z mikroskopii elektronowej i konfokalnej. Model ten pomaga w zrozumieniu wpływu architektury komórkowej na funkcjonowanie komórek serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia układu krążenia
- Architektura komórkowa
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Kardiomiocyty odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu serca.
- Zrozumienie architektury komórkowej jest niezbędne do badania zdrowia i chorób serca.
- Mikroskopia elektronowa i konfokalna dostarczają uzupełniających danych do modelowania.
- Przestrzennie szczegółowe modele mogą ujawniać wgląd w sygnalizację wapniową i bioenergetykę.
Cel badania
- Stworzyć model elementów skończonych architektury kardiomiocytów.
- Zbadać, jak zmiany w organizacji komórkowej wpływają na funkcjonowanie serca.
- Dostarczyć ram dla badań nad innymi typami komórek w odniesieniu do relacji struktura-funkcja.
Zastosowane metody
- Integracja danych z mikroskopii elektronowej.
- Wykorzystanie obrazów z mikroskopii konfokalnej.
- Techniki modelowania elementów skończonych.
- Studia przypadków dotyczących sygnalizacji wapniowej i bioenergetyki.
Główne wyniki
- Udane stworzenie szczegółowego modelu architektury kardiomiocytów.
- Wgląd w rolę struktury komórkowej w funkcjonowaniu serca.
- Wykazana aplikacja w badaniu sygnalizacji wapniowej.
- Potencjał dla szerszej aplikacji w innych typach komórek.
Wnioski
- Metoda zapewnia nowatorskie podejście do badania biologii komórek serca.
- Integracja danych z mikroskopii zwiększa dokładność modelu.
- Wyniki mogą wpłynąć na przyszłe badania nad zdrowiem i chorobami serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to develop spatially resolved finite element models of cardiomyocyte architecture, providing a computational platform to interrogate structure-function relationships in cardiac cells. By integrating high-resolution electron and confocal microscopy data, the method supports mechanistic de-risking in target validation and assay development for cardiovascular therapeutics. The resulting models facilitate predictive simulations of calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, enhancing confidence in early discovery decisions and reducing reliance on empirical screening alone.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how subcellular architecture influences calcium handling and contractile function, supporting target hypothesis testing in cardiomyocyte systems biology.
- Operational Value: Provides a reusable computational framework to evaluate the impact of genetic or pharmacological perturbations on cellular architecture without requiring new wet-lab experiments for each condition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs such as organelle distribution and RyR cluster localization, enabling standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Supports assay standardization by defining structural baselines against which compound-induced remodeling can be measured and quantified.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery-scale imaging with preclinical functional assessment by modeling calcium signaling dynamics linked to cellular ultrastructure.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by simulating how structural remodeling in disease models affects electrophysiological and metabolic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural phenotyping and informing lead identification by providing architecture-informed functional readouts for compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of how changes in mitochondrial positioning, myofibril alignment, or calcium release site distribution affect cardiomyocyte function.
- Screening: Enables generation of quantitative structural metrics (e.g., organelle volume fraction, nearest-neighbor distances) that can serve as imaging-based biomarkers in high-content screening.
- Analytics: Produces spatial density maps and geometric descriptors that allow computational comparison of architectural states across genetic, environmental, or drug-treated conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical studies by linking observed structural changes to simulated functional deficits in calcium handling and energy transfer.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modality-agnostic pipeline for integrating multi-resolution imaging data into mechanistic models applicable across cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in structure-function relationships within cardiomyocytes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of architectural quantification across laboratories and imaging platforms.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling in silico prioritization of targets before committing to costly in vivo validation.
- Portfolio Impact: Supports de-risked advancement decisions by providing mechanistic rationale for selecting compounds that normalize pathological architectural phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron and confocal microscopy image processing, segmentation, and finite element modeling.
- Depends on access to high-resolution 3D imaging data and computational tools such as IMOD, iso2mesh, MATLAB, and R-based simulators.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation protocols and file naming conventions to ensure model comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to different cell types or disease models with varying ultrastructural complexity.
- Practical limitations include current exclusion of transverse-tubule and sarcoplasmic reticulum details, which may affect completeness of calcium signaling simulations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:19
Segment Myofibrils and Mitochondria Regions from the EM 3D Image Dataset
3:05
Create a Finite Element Mesh from the Segmented Components
4:36
Mathematically Map the Spatially Varying Density of Ion-channels of Interest onto the Finite Element Mesh
6:51
Results: A Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte
8:13
Conclusion
