Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ogólnym celem tej procedury jest określenie, które regiony mRNA ulegają translacji w białka, ilościowy pomiar translacji białek w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae na poziomie całego genomu. Profilowanie rybosomów może być wykorzystywane do monitorowania częstości występowania białek i chorób oraz do badania mechanizmów regulacji translacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że dodaje znacznie większą czułość w porównaniu z innymi metodami, a także z pomiarem białek i chorób in vivo w rozdzielczości pojedynczego kontaktu.

Chociaż protokół ten jest specyficzny dla pączkujących drożdży, jest również przydatny dla badaczy, którzy próbują ustalić profilowanie rybosomów w innych systemach modelowych, takich jak komórki i tkanki ssaków. Ekstrakty zostaną przygotowane z komórek drożdży wyhodowanych do połowy fazy logarytmicznej. Użyj zestawu filtrów ze szklanym uchwytem, aby przefiltrować kulturę przez filtry mikromembranowe 0,45.

Zeskrob granulkę szpatułką, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść trzy koraliki ze stali chromowanej o średnicy 3,2 milimetra w rurce ze stali nierdzewnej o pojemności 1,8 mililitra i wstępnie schłodź rurkę w ciekłym azocie. Dodaj zamrożone granulki i przykryj stalową rurkę nasadką z gumy silikonowej.

Homogenizować próbkę przez kriomielenie przez 10 sekund przy 4200 obr./min. Aby utrzymać próbki w stanie zamrożonym podczas całej procedury mielenia, konieczne jest schładzanie probówki w ciekłym azocie przez co najmniej 10 sekund pomiędzy każdym mieleniem. Po zakończeniu homogenizacji dodać do próbki jeden mililitr buforu do lizy zawierającego cykloheksymid.

Dobrze wymieszać przez pipetowanie i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować przy 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Przenieś 100 mikrolitrów lizatu do innej nowej 1,5 mililitrowej probówki w celu izolacji poli(A)mRNA. Błyskawicznie zamroź probówki z próbkami mRNA na pozostałej części lizatu, który zostanie użyty do ekstrakcji śladów w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W noc poprzedzającą ekstrakcję odcisku stopy rozmrażanie wcześniej przygotowane gradienty sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia rozmrozić lizat komórkowy na lodzie. Przenieś podwielokrotność lizatu komórkowego zawierającego 50 jednostek OD260 do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, dodaj świeży bufor do lizy do jednego mililitra i 10 mikrolitrów RNazy jeden. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym obrotem na rotatorze głowy nad piętami przez godzinę.

Następnie delikatnie ułóż próbkę lizatu na wierzchu gradientu sacharozy od 10% do 50% w probówkach polimerowych. Używając rotora SW41 ti, ultra wirować z prędkością 35 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Podczas ultra cetrifugacji skonfiguruj system frakcjonowania gradientowego.

Włącz komponenty i pozwól monitorowi UV rozgrzać się przez co najmniej 30 minut. Napełnić strzykawkę roztworem chase i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki i kaniuli. Po zakończeniu ultrawirowania zainstaluj i przebij probówkę ultrawirówki zawierającą gradient sacharozy.

Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością jednego mililitra na minutę i zebrać frakcje jednego mililitra, monitorując wartości A254. Frakcje reprezentujące pik monosomu ADS są zbierane i łączone. Przefiltruj frakcje przez 0,5 mililitrowe filtry odśrodkowe przy 12 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, odrzuć przepływ i powtarzaj, aż objętość będzie mniejsza niż 100 mikrolitrów.

Przy 400 mikrolitrach buforu o uwalnianiu, zmieszanym przez pipetowanie i inkubować na lodzie przez 10 minut, przenieść urządzenie do nowej probówki zbiorczej i odwirować przy 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zbierz przepływ. Następnie należy oczyścić fragmenty śladu stopy i wytrącić próbki za pomocą wytrącania etanolu, jak opisano w protokole tekstowym.

Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj wytrącony ślad węglowy i rozdrobnione próbki mRNA pod ciśnieniem 20 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Po usunięciu etanolu i wysuszeniu granulek powietrzem, zawieszamy każdy pellet w 7,75 mikrolitrach wody. Do każdej pastylki dodaj jeden mikrolitr buforu kinazy polinukleotydowej 10XT4, jeden mikrolitr kinazy polinukleotydowej T4 i 0,25 mikrolitra inhibitora RNazy.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Dodaj 10 mikrolitrów buforu do próbek mocznika 2X TBE do 10 mikrolitrów każdej próbki śladu i mRNA. Inkubować próbki i odpowiednie kontrole w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, odwirować i umieścić na lodzie na jedną minutę.

Załaduj każdą próbkę do dwóch dołków 15% żelu mocznikowego TBE i oddziel fragmenty RNA za pomocą elektroforezy żelowej przy napięciu 180 woltów przez jedną godzinę. Zabarwić żel barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym, chronionym przed światłem przez pięć minut. Wizualizując żel pod transiluminatorem światła niebieskiego, wytnij odpowiednie pasmo od 28 do 32 nukleotydów dla próbek śladowych i około 50 do 70 nukleotydów dla próbek mRNA.

Zamrozić wycięte kawałki żelu poliakrylamidowego w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut przed ekstrakcją RNA z żelu poliakrylamidowego. Przed odwrotną transkrypcją należy wykonać trzy główne ligacje adapterowe i wytrącić próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ponownie zawiesić każdą granulkę w 11,5 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz

Następnie dodaj 0,5 mikrolitra ośmiomikromolowego startera do odwrotnej transkrypcji i jeden mikrolitr mieszanki dNTP. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić na lodzie. Do każdej próbki dodaj cztery mikrolitry 5x buforu pierwszej nici, dwa mikrolitry 0,1 molowego DTT, 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy i 0,5 mikrolitra odwrotnej transkryptazy.

Inkubuj w temperaturze 48 stopni Celsjusza przez 30 minut, 65 stopni Celsjusza przez minutę i 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Natychmiast przystąp do hydrolizy RNA, dodając 0,8 mikrolitra dwóch molowych wodorotlenków sodu do każdej próbki i inkubując w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj 0,8 mikrolitra dwóch molowych chlorowodorów, aby zneutralizować reakcję.

Po wytrąceniu próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ponownie zawieś każdą osadkę w pięciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i dodaj pięć mikrolitrów 2x buforu do próbek mocznika TBE. Inkubować w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, odwirować i zamrażać przez minutę. Załaduj próbkę do jednego dołka 10% żelu mocznikowego TBE.

Oddzielić produkty reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą elektroforezy żelowej o napięciu 180 woltów przez 50 minut. Zabarwić żel barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym, chronionym przed światłem przez pięć minut. Za pomocą transiluminatora światła niebieskiego wytnij pasmo wokół 128 nukleotydów i więcej.

Zamrozić kawałki żelu poliakrylamidowego w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut przed ekstrakcją DNA z żelu poliakrylamidowego. Aby krążyć DNA, ponownie zawieś każdą osadę DNA w 16,75 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Dodaj dwa mikrolitry 10x jednoniciowego buforu ligazy DNA, jeden mikrolitr 50-milimolowego chlorku manganu i 0,25 mikrolitra jednoniciowej ligazy DNA.

Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Bez wytrącania należy przechowywać produkt reakcji ligacji jednoniciowego DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić amplifikację biblioteki PCR, a następnie kwantyfikację biblioteki i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono reprezentatywne profile analizatorów biologicznych biblioteki amplifikowanych śladów PCR i biblioteki sekwencjonowania uzyskanej dla próbek mRNA. Oczekiwany średni rozmiar biblioteki śladów wynosi od 148 do 152 nukleotydów, a oczekiwany rozmiar biblioteki mRNA to 170 do 190 nukleotydów. Ten wykres przedstawia łączną liczbę odczytów mRNA, śladu i rRNA uzyskanych dla dwóch niezależnych replik biologicznych próbki typu dzikiego i mutanta delecji hbs1.

Od 50% do 60% wszystkich sekwencyjnych odczytów w bibliotekach footprintów odpowiadało fragmentom footprintów chronionym przez rybosomy. Natomiast w bibliotekach mRNA zaobserwowano tylko 3% fragmentów rRNA, co pokazuje, że izolacja poli(A)mRNA pozwala na skuteczną eliminację odczytów rRNA. Zarówno biblioteki próbek śladu, jak i mRNA wykazują dobrą odtwarzalność, na co wskazuje współczynnik korelacji Pearsona wynoszący około 0,99 między dopasowanymi próbkami.

W połączeniu z pomiarami obfitości mRNA, profilowanie rybosomów umożliwia pomiar zmian w wydajności translacji między warunkami eksperymentalnymi. Znacząco regulowane w górę i w dół geny w mutancie delecji hbs1 są pogrupowane w zależności od tego, czy wpływa na nie zmiana transkrypcji mRNA, wydajność translacji, czy wspólny efekt. Po opanowaniu cały protokół można wykonać w ciągu około 11 dni.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawiczek i wykonywaniu wszystkich czynności przy użyciu odczynników i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNazy, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą i zmniejszyć ryzyko degradacji RNA w próbkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować ślady rybosomów za pomocą trawienia nukleazy, izolować nienaruszone kompleksy śladów rybosomów przez frakcjonowanie gradientu sacharozy i przygotowywać biblioteki DNA do głębokiego sekwencjonowania. Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i rękawic kriogenicznych, powinny być zawsze podejmowane podczas pracy z ekstremalnie zimnymi materiałami.