Name: Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Poznaj metodę profilowania rybosomów do kwantyfikacji translacji w całym genomie u Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia badanie regulacji translacyjnej z wysoką czułością in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health granty AG040191 i AG054566 dla VML. Badania te zostały przeprowadzone, gdy VML był laureatem grantu badawczego AFAR od Amerykańskiej Federacji Badań nad Starzeniem się.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podejście Ribo-Seq okazało się potężną technologią do analizy translacji mRNA in vivo na poziomie całego genomu 3. Badania wykorzystujące to podejście, które umożliwia monitorowanie translacji z rozdzielczością pojedynczego kodonu, przyczyniły się do naszego zrozumienia regulacji translacji. Pomimo swoich zalet, Ribo-Seq ma kilka ograniczeń. Fragmenty rybosomalnego RNA (rRNA) są zawsze oczyszczane podczas izolacji śladów chronionych przez rybosom, co zmniejsza wydajność użytecznych odczyt...

translacja mRNA jest jednym z podstawowych procesów w komórce, który odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji białek. Dlatego translacja mRNA jest ściśle kontrolowana w odpowiedzi na różne wewnętrzne i zewnętrzne bodźce fizjologiczne 1,2. Mechanizmy regulacji translacyjnej pozostają jednak niedostatecznie zbadane. W tym miejscu opisujemy protokół kwantyfikacji translacji całego genomu w pączkujących drożdżach za pomocą profilowania rybosomów. Ogólnym celem techniki profilowania rybosomów jest badanie i ilościowe określenie translacji określonych mRNA w różnych warunkach komórkowych. Technika ta wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji do ilościowej analizy zajętości rybosomów w całym genomie i umożliwia monitorowanie szybkości syntezy białek in vivo w rozdzielczości pojedynczego kodonu 3,4. Obecnie metoda ta zapewnia najbardziej zaawansowany sposób pomiaru poziomów translacji białek i okazała się użytecznym narzędziem odkrywczym dostarczającym informacji, których nie można ujawnić za pomocą innych obecnie dostępnych technik, np. mikromacierzy lub analizy tablic stanu translacji (TSAA) 5. Ponieważ profilowanie rybosomów informuje o połączonych zmianach poziomów transkryptów i wydajności translacji, zapewnia również znacznie większą czułość w porównaniu z innymi metodami.
To podejście opiera się na głębokim sekwencjonowaniu fragmentów mRNA chronionych rybosomami 3. Podczas translacji białek rybosomy chronią ~ 28 nt części mRNA (zwane śladami stóp) 6. Określając sekwencję fragmentów chronionych rybosomem, Ribo-Seq może mapować położenie rybosomów na translowanym mRNA i identyfikować, które regiony mRNA mogą być aktywnie translowane do białka 3,7. Ponadto możemy ilościowo zmierzyć translację mRNA, licząc liczbę śladów, które są zgodne z danym transkryptem mRNA.
W celu wyizolowania fragmentów chronionych przez rybosomy, lizaty komórkowe są początkowo traktowane inhibitorem translacji, aby zatrzymać rybosomy, a następnie trawienie rybonukleazą. Podczas gdy wolne mRNA i części translowanych mRNA niechronionych przez rybosomy są degradowane przez rybonukleazę, fragmenty mRNA chronione rybosomem można odzyskać poprzez oczyszczanie nienaruszonych kompleksów rybosom-ślad. Te ślady mRNA są następnie przekształcane do biblioteki cDNA i analizowane przez głębokie sekwencjonowanie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Równolegle z profilowaniem rybosomów nienaruszone mRNA jest ekstrahowane z tej samej próbki i sekwencjonowane. Porównując poziom translacji zidentyfikowany przez Ribo-Seq z pomiarami obfitości mRNA, możemy zidentyfikować geny, które są specyficznie regulowane w górę lub w dół na poziomie translacji i obliczyć wydajność translacji mRNA na poziomie całego genomu. Chociaż protokół opisany w tym artykule jest specyficzny dla drożdży, powinien być również przydatny dla badaczy, którzy będą próbowali ustalić protokół Ribo-Seq w innych systemach.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtry membranowe</td><td>M Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL filtry odśrodkowe (100 kDa MWCO)</td><td>Milipory</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 przy 4&deg; C)</td> <td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X Bufor TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% żel mocznikowy TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% żel mocznikowy TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X Bufor do próbek TBE-mocznika</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylaza (10 U/&mu; L)</td> <td>Epicentrum</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Bufor do ładowania próbki kwasu nukleinowego</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% żel TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Nadajnik światła niebieskiego</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali chromowej, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Biospec produkt</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>System frakcjonowania gradientowego</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności (2,000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Dostarczany z 5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji biblioteki sekwencjonowania nowej generacji</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Ultrawirówka Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji mRNA Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J egzonukleaza (10 U/&mu; L)</td> <td>Epicentrum</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza (200 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Dostarczany z 5-krotnym buforem pierwszej nici i 0,1 M</td></tr><tr><td>buforem fragmentacyjnym DTT RNA</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNaza I (100 U/&mu; L)</td>Inhibitor RNazy <td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>(20 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Nakładki z gumy silikonowej</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ligaza ssDNA (100 U/&mu; L)</td> <td>Epicentrum</td><td>CL9021K</td><td>Dostarczane z 10X buforem CircLigase II i 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Fiolki ze stali nierdzewnej, 1,8 ml</td><td>Produkty BioSpec</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Systemy pompowe</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 (10 000 U / ml)</td> <td>NEB</td><td>M0201S Dostarczana</td><td>z 10X buforem kinazy polinukleotydowej T4</td></tr><tr><td>Ligaza T4 RNA 2 skrócona KQ (200 000 U / mL)</td> <td>NEB</td><td>M0373S Dostarczana</td><td>z 10X buforem ligazy RNA T4 i 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne probówki poliallomerowe, 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Monitor UV Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae szczep BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translacja mRNA na białka to złożony proces obejmujący kilka warstw regulacji. Często przyjmuje się, że zmiany w transkrypcji mRNA odzwierciedlają zmiany w syntezie białek, ale zaobserwowano wiele wyjątków. Ostatnio technika zwana profilowaniem rybosomów (lub Ribo-Seq) pojawiła się jako potężna metoda, która umożliwia identyfikację z dużą dokładnością, które regiony mRNA są tłumaczone na białka i kwantyfikację translacji na poziomie całego genomu. W tym miejscu przedstawiamy uogólniony protokół kwantyfikacji translacji całego genomu przy użyciu Ribo-Seq w pączkujących drożdżach. Ponadto połączenie danych Ribo-Seq z pomiarami obfitości mRNA pozwala nam jednocześnie określić ilościowo wydajność translacji tysięcy transkryptów mRNA w tej samej próbce i porównać zmiany tych parametrów w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne lub w różnych stanach fizjologicznych. Opisujemy szczegółowy protokół generowania śladów rybosomów za pomocą trawienia nukleazy, izolacji nienaruszonych kompleksów rybosom-ślad poprzez frakcjonowanie gradientu sacharozy oraz przygotowanie bibliotek DNA do głębokiego sekwencjonowania wraz z odpowiednimi kontrolami jakości niezbędnymi do zapewnienia dokładnej analizy translacji in vivo.

Szczegółowe procedury analizy bioinformatycznej danych z profilowania rybosomów zostały opisane wcześniej 8,9. Ponadto kilka grup badawczych opracowało narzędzia bioinformatyczne do analizy różnicowej ekspresji genów oraz przetwarzania danych sekwencjonowania, które są specyficzne dla metody profilowania rybosomów 10,11,12,<sup...

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie, które regiony mRNA ulegają translacji w białka, ilościowy pomiar translacji białek w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae na poziomie całego genomu. Profilowanie rybosomów może być wykorzystywane do monitorowania częstości występowania białek i chorób oraz do badania mechanizmów regulacji translacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że dodaje znacznie większą czułość w porównaniu z innymi metodami, a także z pomiarem białek i chorób in vivo w rozdzielczości pojedynczego kontaktu.Chociaż protokół ten jest specyficzny dla pączkujących drożdży, jest również przydatny dla badaczy, którzy próbują ustalić profilowanie rybosomów w innych systemach modelowych, takich jak komórki i tkanki ssaków. Ekstrakty zostaną przygotowane z komórek drożdży wyhodowanych do połowy fazy logarytmicznej. Użyj zestawu filtrów ze szklanym uchwytem, aby przefiltrować kulturę przez filtry mikromembranowe 0,45.Zeskrob granulkę szpatułką, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść trzy koraliki ze stali chromowanej o średnicy 3,2 milimetra w rurce ze stali nierdzewnej o pojemności 1,8 mililitra i wstępnie schłodź rurkę w ciekłym azocie. Dodaj zamrożone granulki i przykryj stalową rurkę nasadką z gumy silikonowej.Homogenizować próbkę przez kriomielenie przez 10 sekund przy 4200 obr./min. Aby utrzymać próbki w stanie zamrożonym podczas całej procedury mielenia, konieczne jest schładzanie probówki w ciekłym azocie przez co najmniej 10 sekund pomiędzy każdym mieleniem. Po zakończeniu homogenizacji dodać do próbki jeden mililitr buforu do lizy zawierającego cykloheksymid.Dobrze wymieszać przez pipetowanie i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować przy 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Przenieś 100 mikrolitrów lizatu do innej nowej 1,5 mililitrowej probówki w celu izolacji poli(A)mRNA. Błyskawicznie zamroź probówki z próbkami mRNA na pozostałej części lizatu, który zostanie użyty do ekstrakcji śladów w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W noc poprzedzającą ekstrakcję odcisku stopy rozmrażanie wcześniej przygotowane gradienty sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia rozmrozić lizat komórkowy na lodzie. Przenieś podwielokrotność lizatu komórkowego zawierającego 50 jednostek OD260 do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, dodaj świeży bufor do lizy do jednego mililitra i 10 mikrolitrów RNazy jeden. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym obrotem na rotatorze głowy nad piętami przez godzinę.Następnie delikatnie ułóż próbkę lizatu na wierzchu gradientu sacharozy od 10% do 50% w probówkach polimerowych. Używając rotora SW41 ti, ultra wirować z prędkością 35 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Podczas ultra cetrifugacji skonfiguruj system frakcjonowania gradientowego.Włącz komponenty i pozwól monitorowi UV rozgrzać się przez co najmniej 30 minut. Napełnić strzykawkę roztworem chase i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki i kaniuli. Po zakończeniu ultrawirowania zainstaluj i przebij probówkę ultrawirówki zawierającą gradient sacharozy.Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością jednego mililitra na minutę i zebrać frakcje jednego mililitra, monitorując wartości A254. Frakcje reprezentujące pik monosomu ADS są zbierane i łączone. Przefiltruj frakcje przez 0,5 mililitrowe filtry odśrodkowe przy 12 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, odrzuć przepływ i powtarzaj, aż objętość będzie mniejsza niż 100 mikrolitrów.Przy 400 mikrolitrach buforu o uwalnianiu, zmieszanym przez pipetowanie i inkubować na lodzie przez 10 minut, przenieść urządzenie do nowej probówki zbiorczej i odwirować przy 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zbierz przepływ. Następnie należy oczyścić fragmenty śladu stopy i wytrącić próbki za pomocą wytrącania etanolu, jak opisano w protokole tekstowym.Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj wytrącony ślad węglowy i rozdrobnione próbki mRNA pod ciśnieniem 20 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Po usunięciu etanolu i wysuszeniu granulek powietrzem, zawieszamy każdy pellet w 7,75 mikrolitrach wody. Do każdej pastylki dodaj jeden mikrolitr buforu kinazy polinukleotydowej 10XT4, jeden mikrolitr kinazy polinukleotydowej T4 i 0,25 mikrolitra inhibitora RNazy.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Dodaj 10 mikrolitrów buforu do próbek mocznika 2X TBE do 10 mikrolitrów każdej próbki śladu i mRNA. Inkubować próbki i odpowiednie kontrole w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, odwirować i umieścić na lodzie na jedną minutę.Załaduj każdą próbkę do dwóch dołków 15% żelu mocznikowego TBE i oddziel fragmenty RNA za pomocą elektroforezy żelowej przy napięciu 180 woltów przez jedną godzinę. Zabarwić żel barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym, chronionym przed światłem przez pięć minut. Wizualizując żel pod transiluminatorem światła niebieskiego, wytnij odpowiednie pasmo od 28 do 32 nukleotydów dla próbek śladowych i około 50 do 70 nukleotydów dla próbek mRNA.Zamrozić wycięte kawałki żelu poliakrylamidowego w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut przed ekstrakcją RNA z żelu poliakrylamidowego. Przed odwrotną transkrypcją należy wykonać trzy główne ligacje adapterowe i wytrącić próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ponownie zawiesić każdą granulkę w 11,5 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.Następnie dodaj 0,5 mikrolitra ośmiomikromolowego startera do odwrotnej transkrypcji i jeden mikrolitr mieszanki dNTP. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić na lodzie. Do każdej próbki dodaj cztery mikrolitry 5x buforu pierwszej nici, dwa mikrolitry 0,1 molowego DTT, 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy i 0,5 mikrolitra odwrotnej transkryptazy.Inkubuj w temperaturze 48 stopni Celsjusza przez 30 minut, 65 stopni Celsjusza przez minutę i 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Natychmiast przystąp do hydrolizy RNA, dodając 0,8 mikrolitra dwóch molowych wodorotlenków sodu do każdej próbki i inkubując w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj 0,8 mikrolitra dwóch molowych chlorowodorów, aby zneutralizować reakcję.Po wytrąceniu próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ponownie zawieś każdą osadkę w pięciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i dodaj pięć mikrolitrów 2x buforu do próbek mocznika TBE. Inkubować w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, odwirować i zamrażać przez minutę. Załaduj próbkę do jednego dołka 10% żelu mocznikowego TBE.Oddzielić produkty reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą elektroforezy żelowej o napięciu 180 woltów przez 50 minut. Zabarwić żel barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym, chronionym przed światłem przez pięć minut. Za pomocą transiluminatora światła niebieskiego wytnij pasmo wokół 128 nukleotydów i więcej.Zamrozić kawałki żelu poliakrylamidowego w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut przed ekstrakcją DNA z żelu poliakrylamidowego. Aby krążyć DNA, ponownie zawieś każdą osadę DNA w 16,75 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Dodaj dwa mikrolitry 10x jednoniciowego buforu ligazy DNA, jeden mikrolitr 50-milimolowego chlorku manganu i 0,25 mikrolitra jednoniciowej ligazy DNA.Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Bez wytrącania należy przechowywać produkt reakcji ligacji jednoniciowego DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić amplifikację biblioteki PCR, a następnie kwantyfikację biblioteki i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przedstawiono reprezentatywne profile analizatorów biologicznych biblioteki amplifikowanych śladów PCR i biblioteki sekwencjonowania uzyskanej dla próbek mRNA. Oczekiwany średni rozmiar biblioteki śladów wynosi od 148 do 152 nukleotydów, a oczekiwany rozmiar biblioteki mRNA to 170 do 190 nukleotydów. Ten wykres przedstawia łączną liczbę odczytów mRNA, śladu i rRNA uzyskanych dla dwóch niezależnych replik biologicznych próbki typu dzikiego i mutanta delecji hbs1.Od 50% do 60% wszystkich sekwencyjnych odczytów w bibliotekach footprintów odpowiadało fragmentom footprintów chronionym przez rybosomy. Natomiast w bibliotekach mRNA zaobserwowano tylko 3% fragmentów rRNA, co pokazuje, że izolacja poli(A)mRNA pozwala na skuteczną eliminację odczytów rRNA. Zarówno biblioteki próbek śladu, jak i mRNA wykazują dobrą odtwarzalność, na co wskazuje współczynnik korelacji Pearsona wynoszący około 0,99 między dopasowanymi próbkami.W połączeniu z pomiarami obfitości mRNA, profilowanie rybosomów umożliwia pomiar zmian w wydajności translacji między warunkami eksperymentalnymi. Znacząco regulowane w górę i w dół geny w mutancie delecji hbs1 są pogrupowane w zależności od tego, czy wpływa na nie zmiana transkrypcji mRNA, wydajność translacji, czy wspólny efekt. Po opanowaniu cały protokół można wykonać w ciągu około 11 dni.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawiczek i wykonywaniu wszystkich czynności przy użyciu odczynników i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNazy, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą i zmniejszyć ryzyko degradacji RNA w próbkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować ślady rybosomów za pomocą trawienia nukleazy, izolować nienaruszone kompleksy śladów rybosomów przez frakcjonowanie gradientu sacharozy i przygotowywać biblioteki DNA do głębokiego sekwencjonowania. Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i rękawic kriogenicznych, powinny być zawsze podejmowane podczas pracy z ekstremalnie zimnymi materiałami.

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.

De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów

Poznaj metodę profilowania rybosomów do kwantyfikacji translacji w całym genomie u Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia badanie regulacji translacyjnej z wysoką czułością in vivo.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Przeglądaj więcej filmów