Ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących

Głównym celem tej procedury jest analiza jakości nasienia ryb na podstawie ruchliwości plemników, aby przyczynić się do udanego sztucznego zapłodnienia. Nazywam się Dr. Carles Soler, jestem profesorem Uniwersytetu w Walencji i dyrektorem naukowym PROiSER B+R. Nazywam się Carina Caldeira, jestem stypendystką Impress Project.

Technologia CASA została opracowana kilkadziesiąt lat temu do analizy nasienia gatunków ssaków przy użyciu komputerowej analizy nasienia. W przypadku ryb należy wziąć pod uwagę dwie rzeczy. Pierwszym z nich jest fakt, że zwierzęta te zwykle zapładniają się w niskich temperaturach, około czterech stopni, i z tego powodu nie jest możliwa analiza nasienia w temperaturze domowej, ale jest to potrzebne do opracowania specjalnych narzędzi do chłodzenia próbek.

Innym problemem jest to, że ruchliwość bardzo szybko spada po aktywacji i trzeba ten fakt przeanalizować, określić jaki jest dobry moment na analizę jakości, czyli jakości nasienia. Pokażemy więc analizę nasienia ryb, a ten protokół będzie modyfikacją protokołu ssaków i będzie zawierał analizę ruchliwości za pomocą Więc zacznijmy. Ryby są znieczulane do wstrzyknięcia hormonu, a próbki nasienia są pobierane 24 godziny później.

Okolice narządów płciowych są czyszczone, aby uniknąć zanieczyszczenia. Nasienie pobiera się poprzez delikatny nacisk. Próbki nasienia są przechowywane w temperaturze czterech stopni, do czasu przeprowadzenia analizy ruchliwości.

Rozcieńczalnik i aktywator są przygotowywane wcześniej. Ustaw blok chłodnicy na cztery stopnie, aby utrzymać próbki w stałej temperaturze. Poczekaj, aż się ustabilizuje.

Rozcieńczyć próbki nasienia za pomocą rozcieńczalnika specyficznego dla każdego gatunku. W przypadku węgorza europejskiego plemniki rozcieńcza się w pożywce P1 w stosunku 1:50. Przygotuj 500 mikrolitrów rozcieńczonego nasienia, dodając 450 mikrolitrów P1 i 50 mikrolitrów świeżej próbki nasienia.

Dobrze wymieszaj. Weź jedną czwartą roztworu aktywatora i umieść w bloku chłodzącym. Ustaw chłodniejszy stage na cztery stopnie.

Poczekaj, aż się ustabilizuje. Wybierz moduł ruchliwości i, jeśli to konieczne, użyj nazwy i hasła. Wybierz właściwości.

Kliknij gatunek i wybierz rybę. Wybierz liczbę klatek na sekundę i liczbę obrazów, których chcesz użyć. Obowiązkowe jest stosowanie kontrastu ujemnego.

Wybierz odpowiednią komorę liczenia i wagę. Dla każdego gatunku dostosuj obszar cząstek i łączność. W przypadku węgorza europejskiego minimalna powierzchnia cząstek powinna wynosić dwa, a łączność siedem.

Zapisz konfigurację. Otwórz przechwytywanie. Weź cztery mikrolitry roztworu aktywatora i umieść w komorze.

Dobrze homogenizuj rozcieńczone plemniki. Weź 5 mikrolitrów nasienia i wymieszaj z aktywatorem. Umieść pokrywę.

Skoncentruj się na próbce i znajdź najlepszy obszar wizualny. Wybierz opcję przechwytywania wideo, aby uzyskać ślady plemników, które są oddzielone według prędkości. Można przechwycić więcej pól.

Wybierz przechwytywanie i postępuj jak poprzednio. Kliknij na wyjście, aby uzyskać ogólny widok wszystkich pól. Pobranie plemników wykonano w określonych odstępach czasu po aktywacji.

Jednak analizę nasienia przeprowadzono dla każdej repliki w przedziale czasowym. Częściowy raport dla każdego przedziału czasu można uzyskać, wybierając pola i klikając częściowy. Arkusz Excela zawiera średnie wartości danych częściowych, wykresów i obrazów śladów plemników.

Powtórz tę samą procedurę dla innych pól. Drugą opcją są dane ogólne. Dane te dostarczają wartości kinetycznych dla poszczególnych plemników ze wszystkich pól.

Dzięki raportowi częściowemu można natychmiast porównać procentową ruchliwość i postępowość dla różnych czasów za pomocą wykresów kołowych. Dane ogólne dają możliwość uzyskania kilku analiz statystycznych z wykorzystaniem parametrów kinetycznych. Ślady plemników dają trzy parametry.

VCL, prędkość krzywoliniowa, VSL, prędkość progresywna i VAP, prędkość ścieżkowa. Najważniejszym parametrem jest VCL, który zmienia się wraz z liczbą klatek na sekundę. Zwiększając liczbę klatek, zwiększa się również VCL, co pozwala na niemal idealną analizę toru.

Najlepsza liczba klatek na sekundę może się różnić w zależności od gatunku. Celem jest znalezienie najwyższej wartości VCL, po przekroczeniu której można zaobserwować wszelkie potencjalne różnice w stosunku do innych narzędzi, takich jak komory liczące. Subpopulacje to obecnie ważna analiza statystyczna, która dostarcza więcej informacji na temat próbki nasienia.

Jest to przykład próbek nasienia łososia atlantyckiego. W różnych pokoleniach wytwarzanych w niewoli można zaobserwować różne subpopulacje plemników. Pokazaliśmy, jak korzystać z systemu komputerowego do analizy nasienia ryb, a także jak zoptymalizować aspekty techniczne i metodologiczne, takie jak komora zliczająca, temperatura i liczba klatek na sekundę.

Tak więc, dzięki tym danym, możemy przeprowadzić wiele analiz w różnych dziedzinach, takich jak hodowla ryb, nie tylko na potrzeby akwakultury, ale także dla programów ochrony, badań filogenetycznych lub w celu zwiększenia wiedzy na temat populacji plemników. Mam więc nadzieję, że ten protokół pomoże Ci w nauce.