Name: Ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę analizy jakości nasienia ryb za pomocą technologii CASA i urządzeń chłodzących. Ten protokół umożliwia szybką ocenę ruchliwości plemników w akwakulturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Stowarzyszenia COST (Food and Agriculture COST Action FA1205: AQUAGAMETE, oraz programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach projektu Marie Skłodowska-Curie IMPRESS (GA nr 642893). Serdecznie dziękujemy zespołowi naukowemu PROiSER, a w szczególności studentowi Alberto Vendrellowi Bernabéu, za jego aktywny udział w nagraniu wideo tego projektu.

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone (2015/VSC/PEA/00064) przez Generalną Dyrekcję Produkcji Rolnej i Hodowli na Universitat Politècnica de València.
1. Zbieraj plemniki od dojrzałych węgorzy europejskich w niewoli
UWAGA: Używaj samców węgorza europejskiego trzymanych w zbiornikach z wodą morską i systemem recyrkulacji o stałej temperaturze (20 °C). Leczenie hormonami poprzez cotygodniowe wstrzyknięcie dootrzewnowe (ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG); 1,5 IU na g masy ciała ryby). Aklimatyzuj ryby stopniowo, zaczynając od 3 dni w słodkiej wodzie, a następnie zastępuj je wodą morską (1/3 całkowitej wody w zbiorniku) co 2 dni, aż do osiągnięcia zasolenia 37,0 g / ml.
<ol>
	<li>Znieczulenie węgorza należy przeprowadzić 24 godziny po wstrzyknięciu hormonu, aby uzyskać próbki o lepszej jakości nasienia.
	<ol>
		<li>Przygotuj wcześniej znieczulenie: dodaj 300 mg benzokainy do 100 ml 70% etanolu. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć benzokainę w elastycznym wiadrze z 5 litrami wody systemowej, aby uzyskać końcowe stężenie 60 mg/l i odpowiednio wymieszać.</li>
		<li>Przełóż rybę do wiadra z wodą systemową i benzokainą. Poczekaj kilka minut, aż ryba się uspokoi</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść okolice narządów płciowych wodą i osusz papierem chłonnym, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek nasienia kałem, moczem lub wodą morską.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj okolice brzucha i zbierz próbki nasienia do plastikowych probówek o pojemności 15 ml za pomocą pompy próżniowej. Objętość plemników do 6-7 ml, w zależności od samca.</li>
	<li>Próbki nasienia należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę do czasu przeprowadzenia analizy ruchliwości.</li>
</ol>
2. Schłodzić i rozcieńczyć próbki nasienia
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej roztwór rozcieńczalnika. 
	UWAGA: Próbki nasienia należy rozcieńczyć w roztworze przedłużającym specyficznym dla każdego gatunku.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę nieaktywującą dla próbek nasienia węgorza (pożywka P1). Do 250 ml wody destylowanej dodać 0,42 g wodorowęglanu sodu, 1,828 g chlorku sodu, 0,127 g chlorku magnezu, 0,56 g chlorku potasu i 0,037 g chlorku wapnia. Dobrze wymieszaj do rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić blok chłodnicy na 4 °C, aby utrzymać próbki w stałej temperaturze. Poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki nasienia roztworem rozcieńczalnika właściwym dla każdego gatunku. 
	UWAGA: Stosunek rozcieńczenia jest specyficzny dla gatunku i musi być zdefiniowany w celu standaryzacji protokołu. Najpierw oszacuj stężenie plemników na podstawie stężenia uzyskanego we wstępnej analizie ruchliwości za pomocą oprogramowania, jak wyjaśniono w krokach 3 i 4. Dzięki tej analizie możliwe jest również wybranie najlepszych próbek plemników na podstawie procentu ruchliwości. Następnie badacz może przystąpić do zbierania danych do eksperymentu przy użyciu najlepszych próbek o odpowiednim stężeniu.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki nasienia węgorza w pożywce P1 w stosunku 1:50. Aby przygotować 500 μl nasienia rozcieńczonego węgorza, dodaj 50 μl świeżej próbki nasienia i 450 μl P1. Dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oceń parametry ruchliwości plemników
<ol>
	<li>Skonfiguruj moduł ruchliwości oprogramowania
	<ol>
		<li>Ustaw schładzany stopień na 4 °C i poczekaj, aż się ustabilizuje.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz Moduł ruchliwości. W razie potrzeby utwórz nazwę użytkownika i hasło.</li>
		<li>Wybierz Właściwości i wybierz żądane parametry przed rozpoczęciem analizy nasienia.
		<ol>
			<li>Kliknij na Gatunki | Ryba.</li>
			<li>Wybierz liczbę klatek na sekundę i liczbę obrazów, w zależności od najlepszych warunków technicznych dla każdego gatunku. Ustaw obie opcje na 120 obrazów na sekundę.</li>
			<li>Wybierz kontrast negatywny. Jest to obowiązkowe dla dokładnej rekonstrukcji trajektorii plemników16.</li>
			<li>Wybierz odpowiednią komorę zliczającą i skalę kamery wideo. Skalibruj kamerę wideo dla obiektywu powiększającego używanego w eksperymencie. Ustaw SpermTrack10 jako komorę zliczającą i 10-krotną skalę. 
			UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zalecanymi warunkami są głębokość 10 μm w komorze zliczania i soczewka powiększająca 10X, ponieważ zapewniają one lepsze skupienie wszystkich plemników i wychwytują największą liczbę komórek. Zaleca się jednak wcześniejsze zbadanie optymalnych warunków analizy ruchliwości każdego gatunku.</li>
			<li>Dostosuj obszar cząstek i łączność dla każdego gatunku. Ustaw minimalną powierzchnię cząstek na 2μm2 i łączność na 7 μm. 
			UWAGA: W przypadku ryb minimalna wartość powierzchni cząstek waha się od 2 do 5 μm, a łączność zależy od prędkości plemników i liczby klatek na sekundę.</li>
			<li>Zapisz konfigurację.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz opcję Przechwyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj plemniki węgorza europejskiego za pomocą oprogramowania
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór aktywatora (sztuczna woda morska), dodając 0,946 g soli handlowej do 25 ml wody destylowanej o zawartości 2% BSA.</li>
		<li>Weź 500 ml roztworu aktywatora (sztuczna woda morska) i umieść w bloku chłodzącym. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, plemniki ryb są aktywowane przez szok osmotyczny, chociaż dla niektórych gatunków stężenie jonów może być również ważne. W przypadku gatunków słodkowodnych pożywka aktywująca powinna mieć osmolalność hipotoniczną, natomiast w przypadku gatunków morskich pożywka powinna być hipertoniczna.</li>
		<li>Umieścić komorę liczenia pod stopniem chłodzenia i poczekać, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 4 °C.</li>
		<li>Wymieszaj aktywator i rozcieńczone plemniki, aby aktywować plemniki i rozpocznij nagrywanie wideo ruchliwości między 5-10 s po aktywacji.
		<ol>
			<li>Pobrać 4 μl roztworu aktywatora i umieścić w komorze zliczającej.</li>
			<li>Delikatnie homogenizuj rozcieńczone plemniki, potrząsając mikrowirówką 3 razy, aby uniknąć uszkodzenia komórek plemników.</li>
			<li>Weź 0,5 μl rozcieńczonego nasienia, wymieszaj z aktywatorem i szybko umieść osłonę w komorze liczącej. 
			UWAGA: Ten krok nie powinien zająć więcej niż 5 sekund, aby rozpocząć analizę tak szybko, jak to możliwe.</li>
			<li>Skoncentruj się na komórkach plemników i znajdź najlepszy obszar widzenia, który jest zdefiniowany przez małą liczbę plemników (150 do 200 komórek), aby uniknąć przechwycenia między komórkami (rysunek uzupełniający 1A). Wybierz opcję Capture Video (Przechwyć wideo), aby uzyskać ślady plemników, które są rozdzielane według prędkości.</li>
			<li>Wybierz opcję Przechwyć, aby uzyskać od 3 do 7 pól, które są optymalnym interwałem w celu uzyskania mniejszej zmienności wyników, a następnie postępuj jak poprzednio. Nagrywaj filmy do 120 s po aktywacji, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na pokrywie komory zliczającej.</li>
			<li>Wybierz opcję Zakończ, aby wyświetlić ogólny widok wszystkich pól.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Uzyskaj dane o ruchliwości
<ol>
	<li>Wybieranie pól | Częściowy | Zapisz i wybierz nazwę pliku. Kliknij Zapisz. 
	UWAGA: Arkusz kalkulacyjny zawiera średnie wartości danych cząstkowych, wykresów i obrazów śladów plemników.</li>
	<li>Wybierz pozycję Dane ogólne | Nazwa pliku | zapisz. 
	UWAGA: Dane dostarczają wartości kinetycznych dla poszczególnych plemników ze wszystkich pól.</li>
</ol>

<ol><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166445X96008065">Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals.</a> Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Bobe, J., Labbé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+and+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Egg and sperm quality in fish.</a> General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).</li>
<li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848603008330">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234, 1-28 (2004).</li>
<li>Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+reproductive+competition+in+spawning+aggregations+of+cod+%28Gadus+morhua%2C+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.).</a> Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).</li>
<li>Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+laboratory+test%3A+the+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">The neglected laboratory test: the semen analysis.</a> Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).</li>
<li>Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+tests+for+human+male+reproductive+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Teratogenesis%2C+Carcinogenesis%2C+and+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Laboratory tests for human male reproductive risk assessment.</a> Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).</li>
<li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+European+eel+%28Anguilla+anguilla%29+sperm+motility+evaluation+by+CASA+software%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software.</a> Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).</li>
<li>Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0426.2010.01529.x">Evaluation of fish sperm quality.</a> Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).</li>
<li>Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+observations+of+flagellar+motility+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).</li>
<li>Bompart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASA-Mot+technology%3A+How+results+are+affected+by+the+frame+rate+and+counting+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Vladić, T., Järvi, T. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1095-8649.1997.tb01632.x">Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature.</a> Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).</li>
<li>Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11245263">Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus).</a> Theriogenology. 55, 751-769 (2001).</li>
<li>Cosson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+fish+spermatozoa%3A+racing+ephemeral+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers.</a> Reproduction. 136, 277-294 (2008).</li>
<li>Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+best+frame+rate+for+evaluation+of+sperm+motility+in+different+species+by+computer-assisted+sperm+analysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?</a> Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holographic+solution+for+sperm+motility+analysis+in+boar+samples.+Effect+of+counting+chamber+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo+method+of+measuring+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A photo method of measuring sperm motility.</a> Journal of Animal Science. 37, 310(1973).</li>
<li>Katz, D. F., Dott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+swimming+speed+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring swimming speed of spermatozoa.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).</li>
<li>Liu, Y. T., Warme, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+evaluation+of+sperm+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Computerized evaluation of sperm cell motility.</a> Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).</li>
<li>Jecht, E. W., Russo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+quantitative+analysis+of+human+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">A system for the quantitative analysis of human sperm motility.</a> Andrologia. 5, 215-221 (1973).</li>
<li>Holt, W. V., Palomo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+continuous+real-time+computerized+semen+analysis+system+for+ram+sperm+motility+assessment%2C+and+evaluation+of+four+methods+of+semen+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation.</a> Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).</li>
<li>Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description%2C+validation%2C+and+performance+characteristics+of+a+new+computer-automated+sperm+motility+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system.</a> Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).</li>
<li>Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CellSoft+automated+semen+analysis+system+in+a+routine+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting.</a> Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+capacitating+human+spermatozoa+analysed+at+60+Hz%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz.</a> Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).</li>
<li>Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+interpretation+of+computer-assisted+sperm+analyses+and+sperm+sorting+methods+in+assisted+breeding+and+comparative+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research.</a> Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).</li>
<li>Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+two+computerized+semen+motility+analyzers%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Comparative study of two computerized semen motility analyzers.</a> Andrologia. 20, 433-440 (1988).</li>
<li>Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2254179">A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion.</a> Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).</li>
<li>Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis%3A+Evaluation+of+method+and+assessment+of+the+influence+of+sperm+concentration+on+linear+velocity+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination.</a> Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Scherr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+numerical+simulation+as+methods+for+standardization+of+zebrafish+sperm+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation.</a> Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+image+sampling+frequency+on+established+and+smoothing-independent+kinematic+values+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).</li>
<li>Hoogewijs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+counting+chamber+type+on+CASA+outcomes+of+equine+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis.</a> Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/289987642_Effect_of_counting_chamber_on_seminal_parameters_analyzing_with_the_ISASv1_R">Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®.</a> Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).</li>
<li>Didion, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis+and+its+utility+for+profiling+boar+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples.</a> Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).</li>
<li>David, G., Serres, C., Jouannet, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2384341">Kinematics of human spermatozoa.</a> Gamete Research. 4, 83-95 (1981).</li>
<li>Björndahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+semen+quality%3F+On+the+use+and+abuse+of+reference+limits+for+the+interpretation+of+semen+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results.</a> Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).</li>
<li>Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57, 149-179 (2002).</li>
<li>Alavia, S. M. H., Cosson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+motility+in+fishes.+I.+Effects+of+temperature+and+pH%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review.</a> Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).</li>
<li>Islam, M. S., Akhter, T. <a target="_blank" href="http://article.sapub.org/10.5923.j.als.20110101.03.html">Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review.</a> Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).</li>
<li>Dadras, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+common+carp+Cyprinus+carpio+sperm+motility+and+lipid+composition+using+different+in+vitro+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures.</a> Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).</li>
<li>Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+and+subpopulations%27+structure+definition+of+blue+fox+%28Alopex+lagopus%29+sperm+motility+using+the+ISASV1+CASA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system.</a> Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).</li>
<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oprogramowanie do analizy nasienia używane w tym protokole było używane przez naukowców na całym świecie dla różnych gatunków, w tym ryb. Jednak ryby mają pewne specyficzne cechy, które mogą wpływać na ocenę nasienia. Plemniki ryb wykazywały dużą prędkość w momencie aktywacji, która szybko spada i prowadzi do krótkiego czasu ruchliwości po aktywacji. Poza tym temperatura rozmnażania jest zależna od gatunku i w niektórych przypadkach może wynosić około 4 °C 2,4,8,12.</s...

Skuteczność reprodukcji zależy od jakości obu gamet (komórek jajowych i plemników)1,2. Jest to główny czynnik, który przyczynia się do udanego zapłodnienia, umożliwiając rozwój żywotnego potomstwa3,4. Wygodna ocena jakości gamet jest najlepszym narzędziem do określenia potencjału płodności próbki. 
Mieszanie nasienia od wielu samców jest powszechną praktyką w produkcji wielu komercyjnych gatunków wodnych4. Jednak zmienność plemników między samcami może prowadzić do konkurencji plemników, a w konsekwencji nie wszyscy mężczyźni w równym stopniu przyczyniają się do puli genów5. W tym sensie prawidłowa ocena cech poszczególnych ejakulatów/plemników, takich jak ruchliwość, ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania informacji różnicujących dotyczących indywidualnego potencjału płodności mężczyzn. Bezpośrednia obserwacja ruchliwości plemników może dać niedokładne i subiektywne dane, ponieważ wymaga czasu i doświadczenia, co prowadzi do braku spójności i niezgodności wyników6,7. Istnieje jednak wiele innowacyjnych, szybkich i ilościowych technik, które mogą zapewnić wiarygodną analizę jakości nasienia2,4. 
Komputerowa analiza nasienia została opracowana, aby dostarczyć dokładnych danych na temat jakości nasienia8. Technologia ta obejmuje opracowanie oprogramowania powiązanego z mikroskopem kontrastu fazowego, który umożliwia ocenę ruchliwości plemników. Jednak czynnikiem ograniczającym parametr ruchliwości jest liczba klatek na sekundę kamery wideo. Trajektorie poszczególnych plemników opierają się na położeniu środka ciężkości główki plemnika w kolejnych klatkach nagrań wideo, co jest skorelowane z wzorcami ruchów wiciowców3,9,10,11. Głównymi mierzonymi parametrami kinetycznymi są prędkość w linii prostej (VSL), prędkość krzywoliniowa (VCL) i średnia prędkość po drodze (VAP). VSL to odległość między punktem początkowym i końcowym przebyta przez plemniki podzielona przez czas. VCL to rzeczywista prędkość wzdłuż dokładnej trajektorii przebytej przez plemniki. VAP to prędkość wzdłuż wyznaczonej wygładzonej ścieżki trajektorii. Parametry te pozwalają na uzyskanie dodatkowych informacji kinetycznych, w tym liniowości (LIN), prostoliniowości (STR), chybotania (WOB) i pomiarów dudnienia, takich jak amplituda bocznego ruchu głowy (ALH) i częstotliwość krzyżowania dudnień (BCF)4,10.
System analizy nasienia był pierwotnie używany dla gatunków ssaków, a jednym z wymagań dla systemu jest działanie w temperaturze ciała dawcy (około 37 °C). To oprogramowanie może być również używane w przypadku gatunków ryb; Chociaż konieczne jest dokonanie pewnych dostosowań, aby zmniejszyć błąd wyników analizy nasienia. U niektórych gatunków ryb, takich jak łososiowate i węgorz8,12, zapłodnienie następuje w niskiej temperaturze (około 4 °C)2,4. W związku z tym należy opracowywać urządzenia chłodzące, aby uniknąć niekomfortowych warunków pracy. Ponadto plemniki ryb są nieruchome w płynie nasiennym i wymagają wstrząsu osmotycznego w celu aktywacji ruchliwości. W przypadku gatunków słodkowodnych pożywka aktywująca powinna mieć osmolalność hipotoniczną, natomiast w przypadku gatunków morskich pożywka powinna być hipertoniczna. Jednak dla niektórych gatunków, takich jak ryby łososiowate, stężenie jonów może być również ważne3,4,9. Po aktywacji nasienie ryb charakteryzuje się szybkim spadkiem ruchliwości (poniżej 2 minut)13,14 i dużą prędkością, co ma kluczowe znaczenie dla określenia optymalnej liczby klatek na sekundę w celu uzyskania wiarygodnych danych15.
Celem tego badania jest zaprojektowanie i zastosowanie systemów chłodzenia do próbek nasienia ryb. Ponadto protokół ten określa, w jaki sposób określić optymalną liczbę klatek na sekundę dla ustanowienia standardowych protokołów w zależności od gatunku. Zastosowanie tego protokołu otwiera nowe możliwości w kontekście oceny nasienia ryb, wykorzystując węgorza europejskiego jako model.

<table><tbody><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormon</td></tr><tr><td>Benzokaina</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td>P1 średni</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 średni</td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 średni</td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 średni</td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 średnia</td></tr><tr><td>sól handlowa</td><td>Aqua Medic&nbsp;</td><td>Rozwiązanie Meersalz</td><td>Activator&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie aktywatora BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Falcon wspornik</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta 20 i mikro; l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&reg; Klasyczna</td><td></td></tr><tr><td>mikropipeta 10 i mikro; l</td><td>Końcówki Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>do mikropipet 20 i mikro; l</td><td>Końcówki Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>do mikropipet 10 i mikro; l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td> Komora <td></td><td>zliczająca</td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td> Mikroskop <td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Płyta chłodząca</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototyp</td>bloku chłodzącego PROiSER</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Prototyp</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>Oprogramowanie PROiSER</td><td>ISAS</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Do oceny jakości gamet istnieją innowacyjne, szybkie i ilościowe techniki, które mogą dostarczyć użytecznych danych dla akwakultury. Komputerowe systemy do analizy nasienia zostały opracowane w celu pomiaru kilku parametrów, a jednym z najczęściej mierzonych jest ruchliwość plemników.
Początkowo ta technologia komputerowa była przeznaczona dla gatunków ssaków, chociaż może być również używana do analizy nasienia ryb. Ryby mają specyficzne cechy, które mogą wpływać na ocenę plemników, takie jak krótki czas ruchliwości po aktywacji i, w niektórych przypadkach, adaptacja do niższych temperatur. W związku z tym konieczna jest modyfikacja zarówno komponentów programowych, jak i sprzętowych, aby analiza ruchliwości była bardziej wydajna w przypadku analizy nasienia ryb. W przypadku plemników ssaków płytka grzewcza służy do utrzymania optymalnej temperatury plemników. Jednak w przypadku niektórych gatunków ryb korzystne jest stosowanie niższej temperatury w celu przedłużenia czasu ruchliwości, ponieważ plemniki pozostają aktywne przez mniej niż 2 minuty. W związku z tym urządzenia chłodzące są niezbędne do schładzania próbek w stałej temperaturze w czasie analizy, w tym pod mikroskopem optycznym. Protokół ten opisuje analizę ruchliwości plemników ryb przy użyciu oprogramowania do analizy nasienia i nowych urządzeń chłodzących w celu optymalizacji wyników.

Analiza wpływu czasu na ruchliwość plemników
W przypadku węgorza europejskiego odsetek spermatozoów nieruchomych wzrósł od 15 s do 120 s po aktywacji (z 24,4% do 40,7%), natomiast odsetek progresywnie ruchomych spermatozoów spadł (z 36,9% do 20,9%) (Rycina 1A i 1B). Pod względem prędkości komórki spermatozoów wykazały spadek prędkości w czasie (...

Niniejszy protokół opisuje procedurę oceny nasienia ryb za pomocą wspomaganych komputerowo urządzeń do analizy nasienia i chłodzenia. Oprogramowanie zapewnia szybką, dokładną i ilościową analizę jakości nasienia ryb na podstawie ruchliwości plemników, co może być przydatnym narzędziem w akwakulturze w celu poprawy sukcesu reprodukcyjnego.

Ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Głównym celem tej procedury jest analiza jakości nasienia ryb na podstawie ruchliwości plemników, aby przyczynić się do udanego sztucznego zapłodnienia. Nazywam się Dr. Carles Soler, jestem profesorem Uniwersytetu w Walencji i dyrektorem naukowym PROiSER B+R. Nazywam się Carina Caldeira, jestem stypendystką Impress Project.Technologia CASA została opracowana kilkadziesiąt lat temu do analizy nasienia gatunków ssaków przy użyciu komputerowej analizy nasienia. W przypadku ryb należy wziąć pod uwagę dwie rzeczy. Pierwszym z nich jest fakt, że zwierzęta te zwykle zapładniają się w niskich temperaturach, około czterech stopni, i z tego powodu nie jest możliwa analiza nasienia w temperaturze domowej, ale jest to potrzebne do opracowania specjalnych narzędzi do chłodzenia próbek.Innym problemem jest to, że ruchliwość bardzo szybko spada po aktywacji i trzeba ten fakt przeanalizować, określić jaki jest dobry moment na analizę jakości, czyli jakości nasienia. Pokażemy więc analizę nasienia ryb, a ten protokół będzie modyfikacją protokołu ssaków i będzie zawierał analizę ruchliwości za pomocą Więc zacznijmy. Ryby są znieczulane do wstrzyknięcia hormonu, a próbki nasienia są pobierane 24 godz

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Protokoły dojrzewania europejskiego węgorza i kriokonserwacji plemników zostały ulepszone w ciągu ostatnich lat. W tym artykule opisano najlepszy dostępny protokół wykorzystujący ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) do indukowania dojrzewania i metanol jako krioprotektant.

Postępowanie z samcami węgorza europejskiego (Anguilla anguilla) i ich leczenie w celu dojrzewania hormonalnego i kriokonserwacji nasienia

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Ten protokół opisuje metodę badania przesiewowego wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA poprzez wykorzystanie cech ruchliwości plemników i thigmotaxis. Metoda wykorzystuje poziomy tor pływacki w kształcie litery U, dzięki czemu wysokiej jakości plemniki docierają do przeciwnej strony przez kropelki buforowe, przy jednoczesnym wykluczeniu martwych plemników, szczątków komórek i zanieczyszczeń.

Technika pływania poziomego w kształcie litery U do przygotowywania wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA

Poznaj metodę analizy jakości nasienia ryb za pomocą technologii CASA i urządzeń chłodzących. Ten protokół umożliwia szybką ocenę ruchliwości plemników w akwakulturze.

Ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących

Przeglądaj więcej filmów