Name: Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji aktywnej transkrypcji w wirusowych fabrykach transkrypcyjnych przy użyciu RNA-FISH i barwienia białek latentnych. Technika ta pozwala badać zmiany architektury genomu podczas reaktywacji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant National Institutes of Health (R01-DE025985) oraz przez American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Prace te były również wspierane przez granty z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (2015-67015-23268 i 2014-67015-21787) oraz grant New Research Initiative z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.

UWAGA: Linie komórkowe używane w tej procedurze zawierają zakaźne wirusy, bądź ostrożny i postępuj tylko w obiekcie poziomu 2 lub wyższego.
1. Przygotowanie i utrzymanie komórek
<ol>
	<li>Hodowla komórek TREx-K-RTA BCBL-1 (lub innych linii komórkowych PEL zakażonych KSHV) w pożywce RPMI1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem glutaminy penicyliny streptomycyny.</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ), upewniając się, że stale rosną i dzielisz komórki w stosunku 1:4 co 2-4 dni.</li>
	<li>Codziennie monitoruj hodowle komórkowe za pomocą mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić dobry wzrost i morfologię komórek, w przeciwnym razie zaleca się ponowne uruchomienie hodowli komórkowej lub odpowiednie dostosowanie warunków hodowli komórek.</li>
</ol>
2. Synchronizacja tymidyny i indukcja lityczna
<ol>
	<li>Na 10 cm szalce Petriego umieścić komórki TREx-K-Rta BCBL-1 w świeżo przygotowanym podłożu (1 x 106 komórek/2 ml pożywki)</li>
	<li>Dodać 200 mM tymidyny (końcowe stężenie: 2 mM) do naczynia, wymieszać i inkubować przez 18 godzin.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g. Umyć komórki sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS), ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym podłożu. Powtórz w sumie 3 prania. Zawiesić w świeżo przygotowanym podłożu.</li>
	<li>Pozwól komórkom wyjść z fazy S przez 8 godzin.</li>
	<li>Dodać tymidynę (końcowe stężenie: 2 mM), wymieszać i inkubować przez 16 godzin.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g. Umyć komórki sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS), ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym podłożu. Powtórz w sumie 3 prania. Zawiesić w świeżo przygotowanym podłożu.</li>
	<li>Aby wywołać reaktywację wirusa, dodać octan 12-O-tetradekanoilo-frobol-13-octan (TPA, stężenie końcowe 20 ng/ml) i doksycyklinę (DOX, stężenie końcowe 100 ng/ml) do hodowli komórkowej, wymieszać i inkubować przez 4 godziny. W przypadku linii komórkowych bez kasety indukowanej K-Rta należy stymulować reaktywację za pomocą TPA (stężenie końcowe 20 ng/ml i maślanu sodu (1 mM)).</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g. Umyć komórki sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS), ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach hodowlanych. Powtórz w sumie 3 prania. Zawiesić w kompletnych pożywkach hodowlanych.</li>
	<li>Pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Utrwalenie i przepuszczalność
UWAGA: Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że przygotowany jest roztwór utrwalający (3,7% formaldehydu w PBS poddanym działaniu DEPC), sól fizjologiczna buforowana fosforanem nasyconym pirowęglanem dietylu (DEPC-PBS), glicyna DEPC PBS (końcowe stężenie glicyny: 100 mM) i roztwór permeabilizujący (50% acetonu, 50% metanolu). Zazwyczaj każdy slajd wymaga co najmniej 0,5 miliona komórek, w razie potrzeby pomnóż i dodaj dodatkowe komórki do tworzenia kopii zapasowych, zwłaszcza jeśli komórki nie są zdrowe.
<ol>
	<li>Zbierz komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 2 minuty przy 200 x g. Umyć komórki 3 razy 1 ml sterylnego DEPC PBS. Zawiesić w 1,2 ml DEPC PBS.</li>
	<li>Umieścić odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych (ustaloną przez układ doświadczalny) na dnie płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl mieszaniny komórek DEPC PBS na każde szkiełko nakrywkowe, upewnić się, że na każdym szkiełku znajduje się co najmniej 0,5 miliona komórek. Pozwól komórkom osiąść na 2 minuty i odessaj nadmiar DEPC PBS, pozostawiając tylko cienką warstwę komórek. To normalne, że komórki są usuwane w tym procesie. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml roztworu utrwalającego (3,7% formaldehydu w DEPC PBS) do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom utrwalić się przez 10 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą DEPC PBS.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml glicyny DEPC PBS (końcowe stężenie glicyny: 100 mM) do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom zgasnąć przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml DEPC PBS i umieścić na shakerze na 5 minut lub mocno, ale delikatnie wstrząsnąć w dłoni przez 1 minutę. Odessać nadmiar DEPC PBS. Uważaj, aby nie zakłócić pracy komórek. Powtórz ten krok, w sumie 3 prania.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml roztworu przepuszczalnego (50% acetonu, 50% metanolu) do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom przesiąknąć przez 15 minut. 
	UWAGA: W tym momencie szkiełka nakrywkowe można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C nie dłużej niż tydzień. Unikaj zamrażania lub zminimalizuj czas spędzony w zamrażarce, ponieważ jakość obrazu może szybko ulec pogorszeniu. Upewnij się, że w zamrażarce komórki pozostają mokre i pokryte metanolem/acetonem oraz że po wyjęciu z zamrażarki prawidłowo nawadniają się za pomocą DEPC PBS.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml DEPC PBS i umieścić na shakerze na 5 minut lub mocno, ale delikatnie wstrząsnąć ręką przez 1 minutę. Odessać nadmiar DEPC PBS, uważając, aby nie zakłócić pracy komórek. Powtórz ten krok, w sumie 3 prania.</li>
</ol>
4. IFA i RNA-FISH
UWAGA: Jeśli chodzi o znakowanie i przygotowanie sondy RNA FISH: Dla intronu K-Rta, który składa się z 959 par zasad, wygenerowano 31 różnych sond, z których każda miała po 20 par zasad, zawierających zawartość GC około 50%. Roztwory robocze i podstawowe sond podzielono na stężenia odpowiednio 100 μM i 2,5 μM.
<ol>
	<li>Oznacz szkiełka mikroskopowe niezbędnymi informacjami eksperymentalnymi lub jakąś wyróżniającą się etykietą.</li>
	<li>Wyłóż dno zamykanego plastikowego pojemnika wilgotnym ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (1,5 μl przeciwciała LANA, 0,75 μl RNA przeciwciała Pol II, 3 μl tRNA DROŻDŻY PIEKARSKICH, DEPC PBS do 30 μl) i pomnożyć przepis dla każdego obecnego szkiełka nakrywkowego. Umieścić 30 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na każdym oznakowanym szkiełku mikroskopowym.
	<ol>
		<li>Najpierw miareczkować przeciwciało pierwotne będące przedmiotem zainteresowania i użyć optymalnej ilości. Pamiętaj, aby używać oczyszczonej IgG, ponieważ surowica (płyn wodobrzusza) może zawierać dużą ilość RNazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe (komórki skierowane w stronę roztworu) na oznakowanych szkiełkach mikroskopowych i przenieś szkiełka do pojemnika z wilgotnym ręcznikiem papierowym. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków. Przykryj zewnętrzną część pojemnika folią. Przenieść pojemnik do inkubatora ustawionego na 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować bufor do płukania ryb (2x solony bufor cytrynianu sodu (SSC) (końcowy), 10% formamid, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>Przygotować 2x Bufor do hybrydyzacji (4x SSC, 20% siarczan dekstranu).</li>
	<li>Przygotować przeciwciało drugorzędowe i bufor sondy intronowej FISH (20 μL 2x buforu hybrydyzacyjnego (końcowy 1x bufor Hyb), 4 μL tRNA drożdży piekarskich (końcowe 10%), 4 μL formamidu (końcowe 10%), sonda intronu K-Rta (końcowa 125 nM), 0,8 μg przeciwciała drugorzędowego, DEPC dH2O do 40 μL). Pomnóż przepis dla każdego potrzebnego preparatu.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki 3 razy DEPC PBS na płytce 6-dołkowej przez 5 minut każda.</li>
	<li>Przemyć buforem do płukania ryb 3 razy po 5 minut. Przechowywać szkiełko nakrywkowe w buforze FISH-wash do czasu zakończenia przygotowywania mieszaniny drugiego przeciwciała i sondy intronowej (krok 4.7).</li>
	<li>Czyste szkiełka podstawowe używane do inkubacji przeciwciał pierwotnych do hybrydyzacji.</li>
	<li>Umieścić 40 μl przeciwciała drugorzędowego i sondy intronowej FISH zawierającej roztwór na każdym szkiełku</li> podstawowym.
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z komórkami na szkiełkach stroną z komórkami skierowanymi w dół na górze bufora, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.</li>
	<li>Umieść szkiełka w plastikowym pojemniku z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie. Owiń plastikowy pojemnik najpierw w folię spożywczą, a następnie w folię aluminiową.</li>
	<li>Inkubować pojemnik ze szkiełkami w temperaturze 37 °C przez 16-24 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji ostrożnie zsunąć szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka podstawowego i umieścić z powrotem na płytkach 6dołkowych skierowanymi do góry i przemyć komórki buforem do płukania ryb 3 razy na płytce 6-dołkowej przez 5 minut każda.</li>
	<li>Umyj komórki 2 razy za pomocą 2x SSC.</li>
	<li>Dodaj DAPI (1:1 000) do 2x SSC i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki 2 razy za pomocą 2x SSC.</li>
	<li>Oczyść szkiełka używane do hybrydyzacji i dodaj 10 μl roztworu montażowego na szkiełka</li> podstawowe.
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na roztworze montażowym. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków.</li>
	<li>Za pomocą chusteczki laboratoryjnej delikatnie usuń nadmiar roztworu montażowego, uważając, aby nie zgnieść komórek.</li>
	<li>Za pomocą lakieru do paznokci nałóż dużą warstwę wokół krawędzi szkiełek nakrywkowych i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Przystąp do wykonania mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
5. 3D Mikroskopia fluorescencyjna
UWAGA: Chociaż protokoły będą się różnić w zależności od rodzaju używanego systemu mikroskopu fluorescencyjnego, następujące kroki pomogą zapewnić uzyskanie optymalnych danych obrazowych do analizy ilościowej.
<ol>
	<li>Wstępnie potraktuj utrwalone próbki i zamontuj w podłożu zapobiegającym blaknięciu, aby opóźnić fotowybielanie fluorescencyjne podczas obrazowania.</li>
	<li>Użyj wysokiej jakości obiektywu (takiego jak soczewka olejowa 60X 1,42 N.A), który może uchwycić całą komórkę (lub jądro komórkowe) w polu widzenia.</li>
	<li>Ustaw parametry ekspozycji (np. moc wzbudzenia, czas ekspozycji) dla każdego kanału barwnego fluorescencji, używając dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych. Pozyskiwanie obrazów fluorescencyjnych. 
	UWAGA: Próbki kontroli dodatniej, które zawierają tylko jedną etykietę fluorescencyjną, powinny być również używane do określenia poziomu "przesłuchu" między kanałami barwnymi. W przypadku obrazowania stałych próbek komórek moc wzbudzenia fluorescencji można zmniejszyć (przy nieco dłuższych czasach ekspozycji), aby zminimalizować fotowybielanie.</li>
	<li>Po ustaleniu protokołu obrazowania należy utrzymywać te same parametry ekspozycji spójne dla wszystkich próbek w badaniu, aby można było dokładnie analizować i porównywać dane obrazu.</li>
	<li>Wykonaj przetwarzanie obrazu po akwizycji i rekonstrukcję 3D. Zidentyfikuj transkrypty K-Rta za pomocą sygnału RNA-FISH (czerwony), cząsteczek LANA za pomocą immunofluorescencji (zielony) i chromatyny jądrowej (w stosownych przypadkach) wybarwionej DAPI (niebieski). 
	UWAGA: Uważa się, że regiony jądra komórkowego, w których K-Rta i LANA są zgrupowane, są związane z fabrykami transkrypcji wirusa i kompleksem replikacyjnym</li>.
</ol>

<ol><li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression%3A+the+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics%3A+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li>
<li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li>
<li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies%3A+a+long+history+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li>
<li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li>
<li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factories%3A+gene+expression+in+unions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li>
<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li>
<li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma%3A+listening+to+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li>
<li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n10/full/nrc2888.html?foxtrotcallback=true">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li>
<li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
<li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+diversity+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li>
<li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192(2007).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly%28A%29+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300(2011).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li>
<li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li>
<li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
</ol>

Autorzy artykułu nie mają powiązań finansowych ani konkurujących ze sobą konfliktów interesów.

Istnieją pewne aspekty protokołu, które można zmienić, aby dostosować się do nietypowych okoliczności. Wybór utrwalających i przepuszczalnych może być również zmieniony. W przypadku utrwalających skuteczny jest również paraformaldehyd, a do przepuszczalności można użyć etanolu. 
Zaleca się gaszenie formaldehydu glicyną PBS, ponieważ zapobiega to wyłączaniu przeciwciał przez formaldehyd przy braku albuminy surowicy bydlęcej (BSA), ale jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną wystarczająco dokładnie um...

Staje się coraz bardziej jasne, że czasoprzestrzenna organizacja jądra odgrywa ważną rolę w modulowaniu precyzyjnie dostrojonej ekspresji genów u eukariontów. Większość genów specyficznych tkankowo jest rozmieszczona na wielu chromosomach i musi być regulowana synchronicznie, aby reagować na określone bodźce w skoordynowany sposób1. Komórki konstruują aktywne koncentratory chromatyny (ACH) jako sposób na połączenie genów i ich składników cis-regulatorowych w określoną przestrzeń jądrową1.
Różne badania wykazały również, że chociaż jądro wydaje się bardzo gęste i lepkie, biologicznie aktywne cząsteczki mogą dość szybko przechodzić przez jądro poprzez dyfuzję2. W konsekwencji tej efemerycznej właściwości, większość białek wiążących DNA "przeskakuje" z miejsca wiązania do miejsca wiązania, wyczuwając swoją drogę w przestrzeni jądrowej, co pozwala na wysoce adaptacyjne i wszechstronne jądro2.
Pomimo tego dynamicznego zachowania biomolekuł w jądrze, nadal istnieją ciała jądrowe bez błon, takie jak (ale nie tylko) jąderko, ciała Cajala i jądra białaczki promielocytowej (PML-NB). Dzieje się tak dzięki różnorodnym mechanizmom, takim jak tandemowe powtórzenia DNA (jąderko), rRNA (jąderko) i białka strukturalne, takie jak coilin (ciała Cajala) lub białka PML (PML-NB), które utrzymują te konstrukty razem3,4,5. Te struktury i inne zgromadzenia, takie jak fabryki transkrypcji, służą jako rusztowania, które nie tylko zwiększają lokalne stężenie wymaganych składników, ale także regulują skład białek i kwasów nukleinowych w nich, aby ostatecznie stworzyć centralne miejsce dla wydajnych funkcji komórkowych6.
Wizualizacja, kiedy i gdzie tworzą się struktury jądrowe, dostarcza wielu informacji badaczom zajmującym się epigenetyką. Z punktu widzenia wirusologii, reaktywacja utajonych wirusów, takich jak KSHV, znacząco zmienia krajobraz jądra i dystrybucję enzymów jądrowych, aby przesunąć transkrypcję głównie z genów komórkowych na geny wirusowe, ostatecznie aby wytworzyć w pełni funkcjonalne potomstwo wirusa7,8. W jaki sposób KSHV manipuluje maszynerią ekspresji genów komórkowych, aby ułatwić ekspresję genów wirusa? Takie informacje mogą również rzucić światło na mechanizmy regulacji genów w komórkach kloszowych.
Podobnie jak wszystkie inne herpeswirusy, KSHV ma dwa cykle życia zwane replikacją lityczną i opóźnieniem. KSHV znajduje się głównie w fazie latencji, w której większość ekspresji genów wirusa jest wyciszona, z wyjątkiem genów związanych z latencją9,10. Podczas latencji KSHV wytwarza antygen jądrowy związany z latencją (LANA), który konstytutywnie wiąże genomy wirusa i wiąże chromatynę wirusa z ludzkim chromosomem11. Ze względu na bliski związek LANA z genomem wirusa, możliwe jest użycie IFA i DAPI do barwienia i lokalizowania, gdzie znajdowały się episomy wirusa w stosunku do chromatyny gospodarza.
Aby badać reaktywację KSHV na poziomie pojedynczego episomu i związek z innymi episomami wirusa w zainfekowanej komórce, ustalono strategię lokalizacji aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej in situ. W związku z tym połączono LANA i RNAPII IFA z intronem RNA-FISH, generując sondy RNA-FISH, które wiążą się z regionem intronu (dokładne sekwencje sondy można znaleźć w najnowszej publikacji laboratorium Izumiya 8) KSHV K-Rta - kluczowego białka wirusowego, które jest niezbędne i wystarczające do reaktywacji KSHV - możliwe było zidentyfikowanie, gdzie faktycznie zachodzi transkrypcja8, 11,12,13,14,15. Ta technika intronu RNA-FISH umożliwia naukowcom wizualizację, gdzie mRNA jest transkrybowane bezpośrednio przed jego złożeniem i eksportem do cytoplasm16,17.
KSHV może być reaktywowany przez różne bodźce chemiczne, w tym estry forbolu, takie jak octan 12-O-tetradekonoiloforbol-13 (TPA) i inhibitory deacetylazy histonowej, takie jak maślan sodu, dodatkowo KSHV może być indukowany do reaktywacji przez nadekspresję wirusowego czynnika transkrypcyjnego, K-Rta19. Naukowcom udało się zwiększyć skuteczność reaktywacji KSHV poprzez synchronizację cykli komórkowych przed wywołaniem reaktywacji18. Tak więc, w tych konkretnych badaniach, komórki zsynchronizowano za pomocą podwójnego bloku tymidyny (protokół opisany poniżej) i inkubowano z TPA i doksycykliną (Dox) przez krótki czas. Doksycylina została użyta, ponieważ linia komórkowa wykorzystana w tych eksperymentach ma indukowaną doksycykliną kasetę K-Rta, która została sklonowana z cDNA i nie zawiera regionu intronowego K-Rta. Chociaż możliwa jest reaktywacja KSHV przy użyciu tylko indukowanej ekspresji K-Rta, inni badacze udowodnili, że ze względu na wiele różnych czynników biochemicznych sama ekspresja K-Rta okazuje się słabym bodźcem reaktywacyjnym20. Łącząc wszystkie te czynniki i ograniczając inkubację leku do krótkiego okresu czasu, uzyskano solidną, ale niezbyt sztuczną reaktywację KSHV do obrazowania.
Po oznaczeniu LANA, RNAPII, INTRONÓW K-Rta i DNA, jak opisano w tym artykule, przeprowadzono obrazowanie fluorescencyjne 3D przy użyciu mikroskopu dekonwolucyjnego o szerokim polu. Po przetworzeniu za pomocą oprogramowania do obrazowania można właściwie ocenić rozkład przestrzenny aktywnych episomów wirusa. Za pomocą tej techniki można badać kluczowe pytania dotyczące fundamentalnej natury powstawania aktywnych węzłów chromatyny i innych struktur jądrowych. Posiadanie identycznych episomów wirusa w pojedynczej komórce, która przetwarza te same elementy regulatorowe, może stanowić unikalne narzędzie badawcze do pogłębienia zrozumienia mechanizmów regulacji genów czasoprzestrzennych.
Ograniczeniem obrazowania wielu próbek komórek ustawionych w różnych punktach czasowych w celu scharakteryzowania z natury dynamicznego procesu molekularnego jest to, że subtelne lub małe zmiany w rozkładzie fluorescencji są niewykrywane lub uważane za nieistotne. Jest to prawdą, chyba że w rzadkich przypadkach każda obserwowana komórka wykazuje tę samą subtelną zmianę. W związku z tym pełna relacja czasoprzestrzenna aktywnej transkrypcji wirusa i innych struktur jądrowych nie może być krytycznie oceniona za pomocą utrwalonego obrazowania. Aby sprostać tym wyzwaniom technicznym, najlepszym podejściem jest obrazowanie żywych komórek, które mają oznaczone episomy wirusa i śledzenie lokalizacji kluczowych enzymów komórkowych w czasie.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Musi być podgrzany do 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina (100x)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Roztwór buforowany fosforanem</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>, toksyczne, zagrażające zdrowiu</td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Toksyczność ostra&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Łatwopalny, toksyczny</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Łatwopalne, toksyczne, zagrażające zdrowiu</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Zaawansowane technologie biologiczne</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Klon przeciwciała anty-RNA polimerazy II CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Kwas rybonukleinowy, transfer z piekarza" s drożdże (S. cerevisiae)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Bufor soli fizjologicznej cytrynianu sodu 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15557044</tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% roztwór</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamindino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik przeciw blaknięciu slowFade Gold</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Mikro szkło osłonowe 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td>do <td>obrazowania 3D</td><td>VoloCITY</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>DeltaVision</tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3d

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Dobrze wiadomo, że przestrzenna i czasowa regulacja genów jest integralną częścią prawidłowego zarządzania ekspresją genów. W związku z tym nieocenione jest zrozumienie, gdzie i kiedy zachodzi transkrypcja w przestrzeni jądrowej oraz wizualizacja związku między episomami zainfekowanymi w jądrze tej samej komórki. W tym przypadku połączono zarówno immunofluorescencję (IFA), jak i RNA-FISH w celu identyfikacji aktywnie transkrybujących episomy herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV). Poprzez barwienie antygenu jądrowego związanego z opóźnieniem KSHV (LANA) możliwe jest zlokalizowanie episomów wirusa w jądrze. Ponadto, projektując sondy RNA-FISH celujące w region intronu genu wirusowego, który ulega ekspresji tylko podczas produktywnej infekcji, można zlokalizować powstające transkrypty RNA. Korzystając z tej kombinacji sond molekularnych, możliwe jest zwizualizowanie montażu dużych fabryk transkrypcji wirusa i analiza przestrzennej regulacji ekspresji genów wirusa podczas reaktywacji KSHV. Włączając barwienie przeciwciałami anty-RNA polimerazy II, można również zwizualizować związek między agregacją polimerazy RNA II (RNAPII) a transkrypcją KSHV podczas reaktywacji.

Przeprowadzono nieco skrócony protokół, w którym zastosowano komórki BCBL-1 i barwiono jedynie RNA LANA oraz K-Rta (Rycina 1). Eksperyment ten pozwala zbadać rozmieszczenie aktywnie transkrybowanych episomów wirusowych oraz heterogeniczność odpowiedzi na bodźce reaktywacji KSHV w populacji komórek. W komórce wskazanej strzałką na Rycynie 1 wyraźna fluorescencja K-Rta w obszarach ściśle odpowiadających rozmieszczeniu episomów wiru...

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Ogólnym celem połączenia powstającego RNA-FISH z barwieniem aminokwasowym utajonych białek wirusa jest wizualizacja aktywnej transkrypcji sprzężonej z tworzeniem fabryki transkrypcji wirusa. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genetyki, biologii komórki, wirusologii i wirusologii biologii komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona indukowalny model minichromosomów wirusowych do badania szczegółów molekularnych stojących za zmianami architektonicznymi genomu.Zbierz komórki w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Odwirowywać komórki przez dwie minuty przy napięciu grawitacyjnym 200 V. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego DEPC PBS.Następnie ponownie zawieś ogniwa w 1,2 mililitra DEPC PBS. Umieść szkiełka pokrywy na dnie płytki sześciodołkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów mieszaniny DEPC PBS na każde szkiełko nakrywkowe.Po tym, jak komórki osiądą przez dwie minuty, odessaj nadmiar DEPC PBS, pozostawiając tylko cienką warstwę komórek. Ostrożnie dodaj jeden mililitr roztworu utrwalającego do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom utrwalić się przez 10 minut.Umyj szkiełka nakrywkowe tr

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Źródło: Bratton, B. P. i in., Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych dla dokładnych reprezentacji komórkowych i precyzyjnej lokalizacji białek. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje metodę pozyskiwania i analizowania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych komórek bakteryjnych w celu badania organizacji białek na poziomie pojedynczych komórek.

Wizualizacja rozkładu białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Źródło: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano jednoczesną wizualizację DNA, RNA oraz białka kapsydu HIV-1 w zakażonych limfocytach ludzkich z wykorzystaniem hybrydyzacji rozgałęzionego DNA (bDNA) oraz immunofluorescencji, co umożliwia szczegółową analizę etapów replikacji wirusa w poszczególnych...

Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne kwasów nukleinowych i białek wirusowych w zakażonych limfocytach ludzkich

Źródło: Kalveram, B. et al. Wykorzystanie chemii klikalnej do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA w komórkach gospodarza. J. Vis. Exp. (2013)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano wykorzystanie chemii klik (click chemistry) oraz mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji transkrypcji nowo powstającego RNA w komórkach ssaków. Przedstawiono w jaki sposób infekcja wirusowa hamuje transkrypcję gospodarza, porównując sygnały fluorescencyjne w komórkach zainfekowanych i...

Wizualizacja supresji transkrypcyjnej w komórkach zainfekowanych wirusem

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Poznaj metodę wizualizacji aktywnej transkrypcji w wirusowych fabrykach transkrypcyjnych przy użyciu RNA-FISH i barwienia białek latentnych. Technika ta pozwala badać zmiany architektury genomu podczas reaktywacji wirusowej.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Przeglądaj więcej filmów