Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Ogólnym celem połączenia powstającego RNA-FISH z barwieniem aminokwasowym utajonych białek wirusa jest wizualizacja aktywnej transkrypcji sprzężonej z tworzeniem fabryki transkrypcji wirusa. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genetyki, biologii komórki, wirusologii i wirusologii biologii komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona indukowalny model minichromosomów wirusowych do badania szczegółów molekularnych stojących za zmianami architektonicznymi genomu.

Zbierz komórki w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Odwirowywać komórki przez dwie minuty przy napięciu grawitacyjnym 200 V. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego DEPC PBS.

Następnie ponownie zawieś ogniwa w 1,2 mililitra DEPC PBS. Umieść szkiełka pokrywy na dnie płytki sześciodołkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów mieszaniny DEPC PBS na każde szkiełko nakrywkowe.

Po tym, jak komórki osiądą przez dwie minuty, odessaj nadmiar DEPC PBS, pozostawiając tylko cienką warstwę komórek. Ostrożnie dodaj jeden mililitr roztworu utrwalającego do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom utrwalić się przez 10 minut.

Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie za pomocą DEPC PBS. Po umyciu ostrożnie dodać jeden mililitr glicyny DEPC PBS do końcowego stężenia glicyny 100 milimolowych do każdego szkiełka nakrywkowego. Pozwól komórkom zgasnąć przez pięć minut.

Dodaj 1,5 mililitra DEPC PBS i umieść na shakerze na pięć minut, a następnie mocno, ale delikatnie potrząsaj ręką przez minutę. Odessać nadmiar DEPC PBS i uważać, aby nie zakłócić pracy komórek. Ostrożnie dodaj jeden mililitr roztworu przepuszczalnego do każdego szkiełka nakrywkowego.

Pozwól komórkom przenikać przez 15 minut. Dodaj 1,5 mililitra DEPC PBS. Umieść komórki na shakerze na pięć minut i mocno, ale delikatnie potrząsaj ręką przez minutę.

Odessać nadmiar DEPC PBS i uważać, aby nie zakłócić pracy komórek. Oznacz szkiełka mikroskopowe i zwilż ręcznik papierowy, a następnie wyłóż dno zamykanego plastikowego pojemnika ręcznikiem. Następnie przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i pomnóż przepis dla każdej obecnej szkiełka nakrywkowego.

Umieścić 30 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na każdym oznakowanym szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że stężenie przeciwciał pierwszorzędowych jest prawidłowe, przytrzymując róg szkiełka nakrywkowego i delikatnie go strzepując. Dodatkowo róg chusteczki może służyć do odprowadzania nadmiaru wilgoci.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na oznaczonych szkiełkach mikroskopowych, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przykryj zewnętrzną część pojemnika folią. Przenieś pojemnik do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza na godzinę.

Podczas inkubacji przygotuj niezbędne odczynniki. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie DEPC PBS na płytce sześciodołkowej przez pięć minut każda. Następnie przemyj komórki buforem do płukania FISH trzy razy przez pięć minut każda.

I przechowywać szkiełko nakrywkowe w buforze do płukania FISH, dopóki nie zostanie przygotowane przeciwciało drugorzędowe, mieszanina sondy intronowej. Następnie wyczyść szklane szkiełka do inkubacji przeciwciał pierwotnych do hybrydyzacji wodą z mydłem. Po wyschnięciu wyczyść je etanolem i chusteczką laboratoryjną.

Umieścić 40 mikrolitrów przeciwciała wtórnego i sondy intronowej FISH z roztworem na każdym szkiełku podstawowym. Umieść szkiełka nakrywkowe z komórkami na szkiełkach stroną z komórkami skierowaną w dół na górze bufora. I uważaj, aby nie wprowadzać bąbelków.

Umieść szkiełka w plastikowym pojemniku z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie. Owiń plastikowy pojemnik najpierw w folię spożywczą, a następnie w folię aluminiową. I inkubuj pojemnik ze szkiełkami.

Po inkubacji ostrożnie zsunąć szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka podstawowego i umieścić je z powrotem na płytkach sześciodołkowych, skierowanymi do góry. Przemyć komórki buforem do płukania FISH trzy razy w sześciodołkowej płytce przez pięć minut każda. Następnie umyj komórki dwa razy podwójnym SSC.

Dodaj DAPI w stężeniu od 1 do 1000 do podwójnego SSC i pozostaw roztwór na pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki dwukrotnie podwójnym SSC. Oczyść szkiełka używane do hybrydyzacji i dodaj 10 mikrolitrów roztworu montażowego na szkiełka

Umieść szkiełka pokrywy stroną zadrukowaną do dołu na roztworze montażowym. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej delikatnie usuń nadmiar roztworu montażowego, uważając, aby nie zgnieść komórek. Za pomocą lakieru do paznokci nałóż dużą warstwę wokół krawędzi szkiełek nakrywkowych i pozostaw lakier do wyschnięcia.

Próbka jest teraz gotowa do mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki BCBL-1 wybarwiono pod kątem RNA LANA i K-Rta w celu zbadania, gdzie znajdują się aktywnie transkrybujące episomy wirusa i niejednorodność odpowiedzi na bodźce reaktywacyjne związane z mięsakiem Kaposiego lub bodźce reaktywacyjne KSHV. Wyraźna fluorescencja K-Rta w regionach, które ściśle odpowiadają rozmieszczeniu episomów wirusa, jest dowodem na aktywną transkrypcję zachodzącą w pobliżu genomów KSHV.

W tej samej próbce można zaobserwować komórki, które wykazują znacznie słabszą i rozproszoną fluorescencję K-Rta, która nie pokrywa się znacząco z LANA, co ilustruje znaczną zmienność i stopień odpowiedzi na bodźce reaktywacyjne w populacji komórek. Następnie zbadano skuteczność synchronizacji tymidyny poprzez wizualizację ekspresji białka wirusowego, co wyraźnie wykazało, że zsynchronizowane komórki reagowały bardziej na bodźce reaktywacyjne niż populacja niezsynchronizowana. Barwienie DAPI może pełnić kilka funkcji, ten przykład wyraźnie pokazuje, że zamiast jednej są trzy oddzielne komórki.

Mikroskopia 3D wraz z tą techniką ujawniła pierścieniowate struktury PII RNA widoczne z genomami KSHV rozsianymi na obrzeżach. Wraz z jego rozwojem, mini chromosom wirusowy dostarczyłby naukowcom unikalnych narzędzi do zbadania szczególnej czasowej organizacji ekspresji genów i regresji jądra komórkowego.