Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego
30 listopada 2017
Tutaj prezentujemy prostą metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) u embrionalnych danio pręgowanego. HSPC od zdysocjowanego danio pręgowanego są posiane w metylocelulozie z czynnikami podporowymi, różnicującymi się w dojrzałą krew. Pozwala to na wykrycie wad krwi i łatwe przeprowadzanie badań przesiewowych leków.
Ogólnym celem tego testu jest wyliczenie i zbadanie zróżnicowania hematopoetycznych komórek progenitorowych w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kilka naprawdę ważnych pytań w dziedzinie hematopoetycznej, takich jak to, ile komórek macierzystych i progenitorowych znajduje się w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, stosunkowo niedroga i łatwa do wykonania.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat liczby komórek progenitorowych obecnych u rozwijającego się danio pręgowanego, pozwala również naukowcom zmierzyć funkcjonalny wpływ, jaki lek lub mutacja genetyczna ma na tworzenie się progenitorów krwi. Pomysł na tę metodę zrodził się, gdy badaliśmy geny, które, jak przypuszczaliśmy, są kluczowe dla rozwoju krwi. Przewidywaliśmy, że będziemy w stanie zmierzyć różnicę między normalnie rozwijającymi się zarodkami a tymi, które były morfantami za pomocą tego testu.
Aby wybielić zarodki danio pręgowanego, użyj plastikowych pojemników, aby stworzyć trzy stacje mycia, z których jedna zawiera jeden mililitr pięcioprocentowego wybielacza na jeden litr E3 i dwie stacje zawierające sterylny E3. Za pomocą pipety transferowej umieść zarodki w sitku do herbaty i zanurz je w stacji mycia numer jeden na pięć minut. Następnie przenieś sitko do herbaty z zarodkami do stacji mycia numer dwa na pięć minut. Powtórz dla stacji mycia numer trzy przez ostatnie pięć minut.
Po ostatnim umyciu wyjmij zarodki z sitka do herbaty, obracając je do góry nogami na czystej 10-centymetrowej szalce Petriego i użyj pipety transferowej i sterylnego E3, aby delikatnie spłukać zarodki z sitka. Aby usunąć zarodki, użyj pipety transferowej, aby usunąć i wyrzucić jak najwięcej E3 z szalki Petriego. Następnie dodaj 500 mikrolitrów prodeów dechorionacyjnych do zarodków i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie delikatnie postukaj w bok szalki Petriego, aby całkowicie usunąć choriony. Następnie za pomocą pipety serologicznej dodaj 20 mililitrów sterylnego E3, aby rozcieńczyć prodeas. Pozwól zarodkom się uspokoić i użyj pipety, aby usunąć E3. Powtórz ten krok prania trzy razy, aby usunąć wszelkie ślady prodei dechorionacji.
Aby przygotować próbki zarodków, użyj pipety, aby umieścić 10 zarodków w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie ostrożnie odpipetuj E3 i wyrzuć go. Przenieś próbki do okapu z przepływem laminarnym i umyj zarodki, dodając jeden mililitr sterylnego E3, pozwalając zarodkom osiąść na dnie probówki.
Następnie użyj pipety P1000, aby usunąć supernatant. Powtórz w sumie trzy prania. Po ostatnim praniu wyjmij E3 i wyrzuć go.
Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowego DTT w E3, aby usunąć powłokę śluzową i wszelkie zarodniki, drożdże lub bakterie, które mogą być w niej uwięzione otaczające zarodki. Teraz połóż probówkę do mikrowirówki poziomo i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Aby oddzielić zarodki, użyj jednego mililitra sterylnego DPBS do trzykrotnego przemycia próbki.
Po ostatnim praniu dodaj 500 mikrolitrów DPBS z wapniem i magnezem oraz pięć mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr prodeasu dysocjacyjnego. Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min przez 60 minut. Następnie umieść próbki i okap z przepływem laminarnym i użyj P1000 do rozcierania zarodków, aż próbki zostaną całkowicie zdysocjowane.
Należy zachować ostrożność i okresowo sprawdzać zarodki, aby określić, kiedy są one dysocjowane. Chcesz, aby jakaś tkanka była obecna. Możliwe jest nadmierne trawienie zarodków, co spowoduje zniszczenie komórek progenitorowych.
Odpipetuj 10 zdysocjowanych zarodków do górnego zbiornika pięciomililitrowej okrągłej dolnej probówki z polistyrenu z nasadką sitową o średnicy 35 mikrometrów. Za pomocą pipety i sterylnego PBS przepłukać probówkę zarodkową i przenieść roztwór do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu zawierającej przefiltrowane komórki. Powtarzaj płukanie, aż w probówce znajdą się cztery mililitry płynu.
Odwirować probówki o temperaturze 300 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby spalić w palecie homogenizowaną próbkę komórkową. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant z probówki z okrągłym dnem, uważając, aby nie naruszyć komórek osadzonych na dnie. Następnie użyj 100 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić ogniwa.
Przygotuj jeden X kompletny roztwór podstawowy metylocelulozy i użyj trzech mililitrowych strzykawek i 16 igieł, aby dodać 2,5 mililitra sterylnych okrągłodennych 14-mililitrowych probówek. Użyj jednej probówki dla każdego badanego stanu. W celu różnicowania szpiku dodaj jeden procent surowicy karpia i 0,3 miligrama na mililitr rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów danio pręgowanego lub GCSF do pożywki metylocelulozowej.
W celu różnicowania erytroidalnego dodaj jeden procent surowicy karpia i 0,1 miligrama na mililitr rekombinowanej erytropoetyny danio pręgowanego lub EPO do pożywki metylocelulozowej. Aby zbadać wieloliniowych progenitorów, dodaj EPO i GCSF. Za pomocą pipety dodać 100 mikrolitrów z 10 zdysocjowanych zarodków na powierzchnię przygotowanej metylocelulozy z rekombinowanymi cytokinami w surowicy karpia.
Zakryj pokrywkę i delikatnie przemieszaj, aby w pełni zhomogenizować próbkę. Każda probówka powinna teraz zawierać zdysocjowaną tkankę 10 zarodków. Używając trzech mililitrowych strzykawek i 16 igieł, podziel jeden mililitr próbki na dwie oddzielne szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów.
Upewnij się, że próbka jest całkowicie rozproszona na szalce Petriego. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki. Umieść 35-milimetrowe szalki Petriego z komórkami i metylocelulozą na 15-centymetrowej szalce Petriego.
Do każdej dużej płytki dodaj jedno 35-milimetrowe naczynie z pięcioma mililitrami sterylnej wody, aby nawilżyć próbki. Inkubuj naczynia w temperaturze 32 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla przez siedem do 10 dni. Na koniec zwizualizuj jednostki tworzące kolonie zgodnie z protokołem tekstowym.
Po siedmiu dniach w hodowli z hematopoetycznymi czynnikami wspomagającymi, policzono i zobrazowano przodków 48 zarodków HPF. Co ważne, ilość użytej mukowiscydozy jest bezpośrednio skorelowana z liczbą platerowanych zarodków. Posiewanie czterech lub ośmiu zarodków na mililitr, co koreluje z rozpoczęciem od 10 lub 20 zarodków, na początku eksperymentu, daje odpowiednio około 1200 lub 2400 CFU.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwie i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie trawić zarodków w nadmiarze, ponieważ spowoduje to zniszczenie komórek progenitorowych. Dzięki tej procedurze możesz porównać liczbę przodków obecnych w różnych punktach czasowych.
Możesz porównać zmutowane zwierzęta ze zwierzętami typu dzikiego, a także przetestować wpływ leków na rozwój krwi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test metylocelulozy w celu wyliczenia komórek progenitorowych hematopoetycznych danio pręgowanego. Możesz zmienić tę procedurę, aby dopasować ją do swoich konkretnych potrzeb eksperymentalnych, takich jak testowanie określonych cytokin.
Nie zapominaj, że praca z krwią i igłami kręgowców może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować ostrożność podczas wykonywania tego testu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPCs) u embrionów rybek danio pręgowanych. Technika ta umożliwia wykrywanie wad krwi oraz ułatwia badanie przesiewowe leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia hematopoetyczna
- Rozwój embrionalny
- Przesiewowe badanie leków
Wprowadzenie
- Zrozumienie dynamiki hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Zebrafish służą jako organizm modelowy do badania rozwoju krwi.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niską wydajnością i ograniczoną dostępnością.
- Niniejsza metoda ma na celu zapewnienie szybkiego i kosztowo efektywnego podejścia.
Cel badania
- W celu zliczenia hematopoetycznych komórek progenitorowych w rozwijających się zarodkach rybek zebrafish.
- W celu oceny wpływu mutacji genetycznych i leków na tworzenie progenitorów krwi.
- W celu pogłębienia zrozumienia mechanizmów rozwoju krwi.
Zastosowane metody
- Dysocjacja zarodków zebrafish w celu izolacji HSPC.
- Wysiewanie komórek w metylocelulozie z dodatkiem czynników wspomagających.
- Obserwacja różnicowania w dojrzałe komórki krwi.
- Porównanie zarodków prawidłowych i genetycznie zmodyfikowanych.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby HSPCs w rozwijającym się embrionie.
- Badacze mogą wykrywać różnice w formowaniu się prekursorów krwi wynikające z modyfikacji genetycznych.
- Za pomocą tej techniki można efektywnie przeprowadzać screening leków.
- Metoda umożliwia uzyskanie wiedzy na temat roli konkretnych genów w rozwoju krwi.
Wnioski
- Ten test jest cennym narzędziem do badania rozwoju hematopoetycznego.
- Stanowi on szybką i ekonomiczną metodę dla badaczy.
- Technika ta pogłębia zrozumienie dynamiki komórek progenitorowych krwi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wyliczanie komórek macierzystych i progenitorowych układu krwiotwórczego (HSPCs) w embrionach rybek danio rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w procesie wczesnego odkrywania leków krwiotwórczych i walidacji genetycznych celów terapeutycznych. Ten test in vitro umożliwia szybką i kosztowo efektywną ocenę funkcjonalną potencjalnych interwencji, zwiększając wiarygodność predykcyjną i ograniczając ryzyko mechanistyczne na etapie przedklinicznym. Podejście to usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie skalowalnych i powtarzalnych danych na temat biologii HSPC istotnych dla rozwoju krwi oraz modelowania chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią kwantyfikację HSPC w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych w hematopoezie.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych i interwencji w szlakach sygnalizacyjnych w modelu kręgowca.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie wpływu mutacji lub związków na tworzenie progenitorów.
- Dostarcza praktycznych danych służących do priorytetyzacji celów o potencjale translacyjnym w chorobach krwi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do oceny wpływu leków lub modyfikacji genetycznych na proliferację i różnicowanie HSPC.
- Generuje ilościowe wyniki liczby jednostek tworzących kolonie (CFU), umożliwiając rzetelne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Redukuje bariery techniczne oraz koszty, co pozwala na szersze zastosowanie w inicjatywach wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy mechanistycznej lub fenotypowej w ramach procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z biologią układu krwiotwórczego istotną dla danej choroby, co pozwala na poszukiwanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie odczytów funkcjonalnych w systemie kręgowca.
- Stanowi platformę dla decyzji o dalszym rozwoju leków w procesach opracowywania preparatów hematologicznych, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test HSPC in vitro na rybkach zebrafish integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesną walidację celów, screening oraz badania translacyjne w zakresie programów hematopoetycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację odpowiedzi komórek progenitorowych na perturbacje genetyczne lub chemiczne.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary CFU w celu oceny gotowości testu i ewaluacji związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wyników HSPC w warunkach typu dzikiego, mutantów oraz po zastosowaniu leków.
- Badania translacyjne: Dostarcza danych funkcjonalnych istotnych dla hematopoezy kręgowców i modelowania chorób.
- Zastosowania wdrożeniowe: Tworzy skalowalną i adaptowalną platformę testową dla różnorodnych potrzeb badawczych i przesiewowych w dziedzinie hematopoezy.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów hematopoetycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w celu wdrożenia przez różne zespoły.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie szybkich, praktycznych danych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów hematopoetycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi danio pręgowanych, dysocjacji embrionów oraz technik sterylnych.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury hodowli komórkowych oraz urządzeń obrazujących do kwantyfikacji CFU.
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja gęstości wysiewu oraz warunków cytokinowych między zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych tło genetycznych lub paneli cytokin w zależności od konkretnych pytań badawczych.
- Wymagana jest staranna optymalizacja, aby uniknąć nadmiernego trawienia i utraty komórek progenitorowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Bleach and Dechorionate 48 hpf Zebrafish Embryos
3:19
Embryos for Dissociation
5:15
Preparation of Dissociated Embryos
6:21
Preparation of Methylcellulose
7:30
Addition of Dissociated Embryos to Methylcellulose
8:53
Results: Quantitation of Zebrafish Embryonic Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
9:32
Conclusion
