Name: Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta umożliwia badanie wpływu mutacji genetycznych i leków na hematopoezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 do D.L.S.), California State University Program for Education & Research in Biotechnology (CSUPERB: Molecular Control of the Vertebrate Hematopoietic Niche to D.L.S.) oraz przez Biuro Studiów Podyplomowych na California State University Chico (do A.C.B.).

Rada doradcza Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Kalifornii, Chico, zatwierdziła wszystkie opisane poniżej metody.
1. Wybielacz 48 hpf Zarodki danio pręgowanego
<ol>
	<li>Z plastikowymi pojemnikami o wymiarach 15 cm (szer.) x 15 cm (dł.) x 7 cm (wys.) utwórz 3 stacje mycia: 1) z 1 ml 5% wybielacza w 1000 ml pożywki dla zarodków (E3; patrz tabela 1), 2) ze sterylnym E3 i 3) ze sterylnym E3. Upewnij się, że w każdym pojemniku znajduje się 500 ml roztworu, w którym można zanurzyć zarodki. 
	UWAGA: Dla każdego badanego schorzenia potrzebnych będzie co najmniej 10 zarodków. Ta procedura mycia może pomieścić do 200 zarodków.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej umieść zarodki w sitku do herbaty i zanurz jaja w stacji mycia #1 na 5 minut. Wyjmij sitko do herbaty (z zarodkami w środku) i umieść w stacji mycia #2 na 5 minut; powtórz dla stacji mycia #3 przez ostatnie 5 minut.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu opłucz zarodki z sitka do herbaty, odwracając je do góry nogami na czystej 10 cm szalce Petriego i delikatnie spłukując zarodki z sitka do herbaty za pomocą sterylnego E3 i pipety transferowej.</li>
</ol>
2. Zarodki dechorionate
<ol>
	<li>Za pomocą pipety transferowej usunąć i wyrzucić jak najwięcej E3 z szalki Petriego i dodać 500 μl proteazy dechorionacyjnej (10 mg/ml) do zarodków. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Delikatnie postukaj w bok szalki Petriego, aby całkowicie usunąć kosmówkę.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 20 ml sterylnego E3 w celu rozcieńczenia proteazy. Pozwól zarodkom się uspokoić i usuń E3 za pomocą pipety transferowej. Powtórz ten krok prania 3 razy, aby usunąć wszelkie ślady proteazy dechorionacyjnej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek zarodków
<ol>
	<li>Za pomocą pipety P1000 umieść 10 zarodków w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Usuń E3 pipetą i wyrzuć. 
	Uwaga: Pipetę należy zachować ostrożnie, ponieważ zarodki można łatwo przemieścić i wyrzucić podczas kolejnych etapów mycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zarodków do dysocjacji
<ol>
	<li>Przenieś próbki do okapu z przepływem laminarnym i umyj zarodki, dodając 1 ml sterylnego E3. Pozwól zarodkom osiądnąć na dnie probówki i usuń supernatant za pomocą pipety P1000. Powtórz w sumie 3 prania.</li>
	<li>Po ostatnim praniu wyjmij E3 i wyrzuć. Dodaj 1 ml 10 mM ditiotreitolu (DTT) w E3, aby usunąć powłokę śluzową (i wszelkie zarodniki, drożdże lub bakterie, które mogą być w niej uwięzione) otaczającą zarodek danio pręgowanego. Ułożyć probówkę do mikrowirówki poziomo i inkubować w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym przez 25 minut.</li>
</ol>
5. Dysocjacja zarodków
<ol>
	<li>Przemyć próbkę 3 razy 1 ml sterylnego DPBS (z Ca2+ i Mg2+). Po ostatnim przemyciu dodać 500 μL DPBS (z Ca2+ i Mg2+) i dodać 5 μL proteazy dysocjacyjnej 5 mg/ml (26 U/mL). 
	Uwaga: Ten enzym potrzebuje Ca2+ i Mg2+, więc upewnij się, że DPBS zawiera te jony.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 37 °C na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min przez 60 minut. Umieścić próbki w okapie z przepływem laminarnym i rozcierać zarodki za pomocą P1000, aż do całkowitej dysocjacji próbek. 
	Uwaga: Okresowo sprawdzaj zarodki, aby określić, kiedy ulegają dysocjacji. W roztworze dla zarodków powinna znajdować się pewna ilość tkanki; Nie powinien być całkowicie jednorodny. Możliwe jest nadmierne trawienie, co spowoduje zniszczenie HSPC (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
</ol>
6. Przygotowanie rozłączonych zarodków
<ol>
	<li>Odpipetować 10 zdysocjowanych zarodków do górnego zbiornika polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nakrętką sitową o pojemności 35 μm.</li>
	<li>Za pomocą pipety przepłukać probówkę Petriego sterylnym PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) i przenieść roztwór do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml zawierającej przefiltrowane komórki z kroku 6.1. Powtarzaj, aż w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml znajdzie się 4 ml płynu. 
	Uwaga: Na tym etapie można stosować PBS, DPBS lub inne izotoniczne roztwory buforowane, o ile nie zawierają one Ca2+ lub Mg2+</li>
	<li>Probówki wirówkowe w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut w celu osadzania homogenizowanej próbki komórek. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant z probówki o okrągłym dnie. Uważaj, aby nie zakłócić komórek osadzonych na dnie probówki. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS.</li>
</ol>
7. Przygotowanie metylocelulozy
<ol>
	<li>Wygeneruj 1x kompletny roztwór podstawowy metylocelulozy (Tabela 1) i dodaj 2,5 ml do sterylnych okrągłodennych probówek o pojemności 14 ml za pomocą strzykawek 3 ml i igieł 16 G. Użyj jednej probówki dla każdego badanego stanu.</li>
	<li>Do każdej próbki dodaj cytokiny, małe cząsteczki lub inne czynniki, które mają być badane.
	<ol>
		<li>W celu różnicowania szpiku dodaj 1% surowicy karpia i 0,3 mg/ml rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów danio pręgowanego (Gcsf)34 do podłoża metylocelulozowego. Patrz: Svoboda i wsp.37 aby uzyskać pełny opis generowania surowicy karpia i rekombinowanych cytokin.</li>
		<li>W celu różnicowania erytroidalnego dodać 1% surowicy karpia i 0,1 mg/ml rekombinowanej erytropoetyny danio pręgowanego (Epo)38 do podłoża metylocelulozowego.</li>
		<li>Aby zbadać wieloliniowych przodków, dodaj Epo i Gcsf. 
		Uwaga: Cytokiny i dodatki nie powinny stanowić więcej niż 10% całkowitej objętości, ponieważ podłoże nie będzie wystarczająco lepkie, aby rozróżnić poszczególne kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Dodawanie zdysocjowanych zarodków do metylocelulozy
<ol>
	<li>Za pomocą pipety dodać 100 μl zdysocjowanych 10 zarodków na powierzchnię przygotowanej metylocelulozy z rekombinowanymi cytokinami i surowicą karpia. Pokrywkę zakręcić i delikatnie przemieszać, aby w pełni zhomogenizować próbkę. Każda probówka powinna teraz zawierać zdysocjowaną tkankę 10 zarodków.</li>
	<li>Używając strzykawek o pojemności 3 ml i igieł 16 G, podzielić 1 ml próbki na 2 oddzielne szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że próbka jest całkowicie rozproszona na szalce Petriego. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki.</li>
	<li>Umieścić 35-milimetrowe szalki Petriego z komórkami w metylocelulozie na 15-centymetrowej szalce Petriego. Do każdej 15-centymetrowej szalki dodać jedną szalkę Petriego o średnicy 35 mm z 5 ml sterylnej wody w celu nawilżenia próbek. Inkubować w temperaturze 32 °C i 5% CO2 przez 7 - 10 dni.</li>
</ol>
9. Wizualizacja jednostek tworzących kolonie (CFU) pochodzących z HSPC
<ol>
	<li>Po inkubacji 7 dni umieść próbki w odwróconym mikroskopie pod kątem 40 - 100 razy w celu wizualizacji i wyliczenia. W tym momencie poszczególne kolonie można wyizolować za pomocą pipety i poddać barwieniu i/lub analizie genetycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41%2B+cmyb%2B+precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li>
<li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li>
<li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li>
<li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li>
<li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li>
<li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li>
<li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li>
<li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+%28CHEST%29+Cells+Support+Haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644(2017).</li>
<li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+%28ZEST%29+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+%28HSPC%29+proliferation%2C+survival%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li>
<li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+%28Gcsfs%29%3A+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li>
<li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17579187">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+localization+of+side+population+%28SP%29+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li>
<li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

System modelowy danio pręgowanego stał się wydajnym, skutecznym i niedrogim modelem do badania hematopoezy prymitywnych i ostatecznych kręgowców. Generowanie testów, które są szybkie, niedrogie i wiążą się z niewielkimi trudnościami technicznymi, można wykorzystać do testowania małych cząsteczek, analizy zmutowanych zarodków i wyjaśniania szlaków molekularnych ważnych dla biologii HSPC. Posiewanie in vitro HSPC od dorosłych ryb danio pręgowanego jest skuteczną metodą badania mutagenezy, cytokin i wad układu krwi...

Hematopoeza to proces wytwarzania wielu dojrzałych komórek krwi niezbędnych do przetrwania organizmu. Jest to kluczowy proces rozwojowy, który obejmuje różnicowanie się hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) w różne typy komórek o ograniczonym rozwoju, które składają się na dojrzałą krew. Te HSC muszą się samoodnawiać, aby system nigdy nie został wyczerpany i muszą trwać od wczesnego rozwoju embrionalnego aż do śmierci. U kręgowców konieczne jest ciągłe różnicowanie i proliferacja hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), aby odpowiednio uzupełnić większość komórek krwi, które są postmitotyczne i poddawane recyklingowi każdego dnia. HSC wytwarzają dojrzałe komórki krwi, najpierw różnicując się w podzbiory ograniczonych komórek progenitorowych; powszechne komórki progenitorowe limfoidalne (CLPs)1, które ostatecznie wytwarzają komórki T, B i NK, oraz wspólne komórki progenitorowe szpiku (CMPs)2, które generują granulocyty, erytrocyty, makrofagi i megakariocyty. Ci przodkowie są zaangażowani w generowanie określonych linii komórkowych i dalej różnicują się w bardziej ograniczone rozwojowo komórki progenitorowe, takie jak mieloidalne erytroidalne komórki progenitorowe (MEP), które generują erytrocyty i płytki krwi, lub progenitory makrofagów granulocytów (GMP), które generują bazofile, eozynofile, neutrofile i makrofagi2. Identyfikacja i wyizolowanie tych komórek progenitorowych pozwala na identyfikację ważnych szlaków molekularnych zaangażowanych w różnicowanie układu krwiotwórczego, a wiele chorób układu krwiotwórczego, takich jak białaczka, powstaje, gdy te komórki progenitorowe nie różnicują się prawidłowo.
W ciągu ostatnich kilku dekad, system modelowy danio pręgowanego (Danio rerio) stał się kluczowym narzędziem badawczym dla badań nad embrionalnymi i dorosłymi krwiotwórczymi. Danio pręgowany jest podatny na analizę genetyczną i jest filogenetycznie najniższym modelowym gatunkiem kręgowców, który ma podobny układ naczyniowy i krwiotwórczy do ludzi. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się ex utero i w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu (hpf) generują HSPCs3,4,5,6,7,8. Danio pręgowany jest również bardzo płodny, a samice składają ponad 100 jaj w jednym lęgu, co pozwala na duże rozmiary próbek i replikację eksperymentalną. Zarodki danio pręgowanego są optycznie przezroczyste, co pozwala na mikroskopową wizualizację układu krwiotwórczego. Kilka fluorescencyjnych linii transgenicznych danio pręgowanego oznaczających HSC, takich jak runx1:EGFP fish9, cd41:EGFP fish10 i kdrl:mCherry; cmyb:GFP3 podwójnie dodatnie zwierzęta, pozwalają na wizualizację na żywo, w czasie rzeczywistym, pojawienia się i ekspansji HSC in vivo3,4,7,8,9. Szybki czas generacji i rozwoju danio pręgowanego ex utero doprowadził do jego wykorzystania w badaniach mutagenezy11,12,13,14,15 i badania przesiewowe leków16,17,18,19,20 dla związków, które są obiecujące terapeutycznie w leczeniu chorób krwi ludzkiej. Ogólnie rzecz biorąc, zachowanie układu krwiotwórczego, obecność i łatwy rozwój linii transgenicznych oraz szybki czas regeneracji sprawiły, że danio pręgowany jest niedrogim, szybkim, elastycznym i idealnym modelem do badań krwiotwórczych.
Liczne metody izolowania i testowania HSC zostały opracowane w układach krwiotwórczych ssaków. Badacze mogą wykorzystać kombinację receptorów na powierzchni komórki do oznaczania HSCs21,22,23,24, a także wykorzystać zdolność HSC do wypływu barwnika25,26. Po ich znakowaniu, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) umożliwia ich fizyczną separację. Udowodnienie, że komórka jest HSC, wymaga napromieniowania zwierzęcia gospodarza w celu zniszczenia endogennych HSPC, przeszczepienia przypuszczalnych HSC i obserwacji długotrwałej, wieloliniowej rekonstytucji wszystkich dojrzałych typów komórek krwi. Testy te działają dobrze u myszy, ponieważ istnieją liczne przeciwciała na powierzchni komórek przeciwko komórkom hematopoetycznym i wsobnym szczepom myszy, które ułatwiają dopasowanie immunologiczne do przeszczepu. Wygenerowano jednak niewiele przeciwciał na powierzchni komórek krwiotwórczych danio pręgowanego27, co utrudnia identyfikację i izolację HSC. Najczęstszym sposobem oznaczania i izolowania HSC danio pręgowanego są zwierzęta transgeniczne, w których specyficzna dla komórki sekwencja promotora napędza ekspresję białka fluorescencyjnego. W badaniach zwizualizowano i wyliczono HSC w brzusznej ścianie aorty grzbietowej za pomocą mikroskopii z wykorzystaniem tej techniki3,4,8,9. Inne laboratoria wygenerowały klonalne szczepy danio pręgowanego28,29 i przeprowadziły udane przeszczepy u zwierząt dopasowanych do MHC30. Jednak techniki te są zbyt kosztowne dla wielu laboratoriów, są trudne technicznie i czasochłonne. Aby rozwiązać te problemy, laboratoria przeprowadziły kilka testów in vitro w celu zbadania obecności, tempa proliferacji i zdolności różnicowania HSPCs31,32,33,34,35,36. Testy te pokazują proliferację i zróżnicowanie HSPC in vitro31,32,33,34,35,36, ratowanie wad krwiotwórczych36, oraz skuteczna metoda wykrywania i testowania cytokin33,34,35. Zostały one również wykorzystane do identyfikacji genów odpowiedzialnych za biologię HSPC 31,32. W tym badaniu idziemy o krok dalej, umożliwiając ilościowe określenie HSPC w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Testy te można również wykorzystać do ilościowego określenia liczby HSPC u zwierząt ze mutacjami i zwierząt leczonych lekami zaburzającymi układ krwiotwórczy. Zasadniczo testy te są szybkie, stanowią niewiele wyzwań technicznych i są niedrogimi sposobami ilościowego określania liczb HSPC, badania ich proliferacji i badania bloków różnicowania.

<table><tbody><tr><td>10% albumina surowicy bydlęcej w technologii MDM StemCell firmy Iscove</td><td>&nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) z Calcium2+ i magnez2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM 500 ml</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-017-CV&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Ham's F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (5000 U/mL i 5000 mg/ml) z L-glutaminą (200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny 10 ml (50 mg/ml)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>Rurka MCF 1,5 ml</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna 3 ml 23gx1 z Luer lock</td><td>BD Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistyrenowa tuba z okrągłym dnem z nasadką sitka</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polistyrenowa rurka z okrągłym dnem</td><td>Corning Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>10 mm polistyren easygrip szalka Petriego</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td> Roche <td>Proteaza dysocjacyjną</td><td>Sigma-Ald 5401119001 richa</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Roche Proteaza dechorionacyjna Sigma-Aldricha 11459643001 Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm szalka Petriego</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>Międzynarodowe Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC)</td><td>Szczep zebry</td> <td>ZL1</td> używany</tr><tr><td>Ditiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (hspc) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoeza to niezbędny proces komórkowy, w którym hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) różnicują się w wiele różnych linii komórkowych, które składają się na dojrzałą krew. Wyizolowanie i zidentyfikowanie tych HSPC jest trudne, ponieważ są one zdefiniowane ex post facto; Można je określić dopiero po ich zróżnicowaniu w określone linie komórkowe. W ciągu ostatnich kilku dekad danio pręgowany (Danio rerio) stał się organizmem modelowym do badania hematopoezy. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się ex utero, a po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf) generują ostateczne HSPC. Opracowano testy oceniające zdolności różnicowania i proliferacji HSPC, wykorzystujące przeszczep, a następnie odtworzenie układu krwiotwórczego, a także wizualizację wyspecjalizowanych linii transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak testy te są zbyt kosztowne, trudne technicznie i czasochłonne dla wielu laboratoriów. Opracowanie modelu in vitro do oceny HSPC byłoby opłacalne, szybsze i wiązałoby się z mniejszymi trudnościami w porównaniu z poprzednio opisanymi metodami, umożliwiając laboratoriom szybką ocenę mutagenezy i badań przesiewowych leków, które wpływają na biologię HSPC. Ten nowatorski test in vitro do oceny HSPC jest przeprowadzany przez posiew całych zarodków danio pręgowanego i dodanie czynników egzogennych, które promują tylko różnicowanie i proliferację HSPC. Zarodki są dysocjowane na pojedyncze komórki i powlekane czynnikami stymulującymi tworzenie kolonii wspierającymi HSPC, które powodują, że generują one jednostki tworzące kolonie (CFU), które powstają z pojedynczej komórki progenitorowej. Testy te powinny pozwolić na dokładniejsze zbadanie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za proliferację, różnicowanie i regulację HSPC, co pozwoli naukowcom zrozumieć podstawy hematopoezy kręgowców i jej rozregulowania podczas choroby.

Aby ocenić liczbę HSPC w embrionach danio pręgowanego, embriony w 48 hpf poddano trawieniu, wysiano na podłożo z metylocelulozy z egzogennymi czynnikami wzrostu wspierającymi hematopoezę i inkubowano przez 7 dni (Rysunek 1A). Po 7 dniach policzono jednostki tworzące kolonie (CFU) (Rysunek 1B) i wykonano ich obrazowanie (Rysunek 1C). Poprzez kontrolę ...

Tutaj prezentujemy prostą metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) u embrionalnych danio pręgowanego. HSPC od zdysocjowanego danio pręgowanego są posiane w metylocelulozie z czynnikami podporowymi, różnicującymi się w dojrzałą krew. Pozwala to na wykrycie wad krwi i łatwe przeprowadzanie badań przesiewowych leków.

Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Ogólnym celem tego testu jest wyliczenie i zbadanie zróżnicowania hematopoetycznych komórek progenitorowych w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kilka naprawdę ważnych pytań w dziedzinie hematopoetycznej, takich jak to, ile komórek macierzystych i progenitorowych znajduje się w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, stosunkowo niedroga i łatwa do wykonania.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat liczby komórek progenitorowych obecnych u rozwijającego się danio pręgowanego, pozwala również naukowcom zmierzyć funkcjonalny wpływ, jaki lek lub mutacja genetyczna ma na tworzenie się progenitorów krwi. Pomysł na tę metodę zrodził się, gdy badaliśmy geny, które, jak przypuszczaliśmy, są kluczowe dla rozwoju krwi. Przewidywaliśmy, że będziemy w stanie zmierzyć różnicę między normalnie rozwijającymi się zarodkami a tymi, które były morfantami za pomocą tego testu.Aby wybielić zarodki danio pręgowanego, użyj plastikowych pojemników, aby stworzyć trzy stacje mycia, z których jedna zawiera jeden mililitr pięcioprocentowego wybielacza na jeden litr E3 i dwie stacje zawierające sterylny E3. Za pomocą pipety transferowej umieść zarodki w sitku do herbaty i zanurz je w stacji mycia numer jeden na pięć minut. Następnie przenieś sitko do herbaty z zarodkami do stacji mycia numer dwa na pięć minut. Powtórz dla stacji mycia numer trzy przez ostatnie pięć minut.Po ostatnim umyciu wyjmij zarodki z sitka do herbaty, obracając je do góry nogami na czystej 10-centymetrowej szalce Petriego i użyj pipety transferowej i sterylnego E3, aby delikatnie spłukać zarodki z sitka. Aby usunąć zarodki, użyj pipety transferowej, aby usunąć i wyrzucić jak najwięcej E3 z szalki Petriego. Następnie dodaj 500 mikrolitrów prodeów dechorionacyjnych do zarodków i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie delikatnie postukaj w bok szalki Petriego, aby całkowicie usunąć choriony. Następnie za pomocą pipety serologicznej dodaj 20 mililitrów sterylnego E3, aby rozcieńczyć prodeas. Pozwól zarodkom się uspokoić i użyj pipety, aby usunąć E3. Powtórz ten krok prania trzy razy, aby usunąć wszelkie ślady prodei dechorionacji.Aby przygotować próbki zarodków, użyj pipety, aby umieścić 10 zarodków w jednej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie ostrożnie odpipetuj E3 i wyrzuć go. Przenieś próbki do okapu z przepływem laminarnym i umyj zarodki, dodając jeden mililitr sterylnego E3, pozwalając zarodkom osiąść na dnie probówki.Następnie użyj pipety P1000, aby usunąć supernatant. Powtórz w sumie trzy prania. Po ostatnim praniu wyjmij E3 i wyrzuć go.Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowego DTT w E3, aby usunąć powłokę śluzową i wszelkie zarodniki, drożdże lub bakterie, które mogą być w niej uwięzione otaczające zarodki. Teraz połóż probówkę do mikrowirówki poziomo i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Aby oddzielić zarodki, użyj jednego mililitra sterylnego DPBS do trzykrotnego przemycia próbki.Po ostatnim praniu dodaj 500 mikrolitrów DPBS z wapniem i magnezem oraz pięć mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr prodeasu dysocjacyjnego. Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min przez 60 minut. Następnie umieść próbki i okap z przepływem laminarnym i użyj P1000 do rozcierania zarodków, aż próbki zostaną całkowicie zdysocjowane.Należy zachować ostrożność i okresowo sprawdzać zarodki, aby określić, kiedy są one dysocjowane. Chcesz, aby jakaś tkanka była obecna. Możliwe jest nadmierne trawienie zarodków, co spowoduje zniszczenie komórek progenitorowych.Odpipetuj 10 zdysocjowanych zarodków do górnego zbiornika pięciomililitrowej okrągłej dolnej probówki z polistyrenu z nasadką sitową o średnicy 35 mikrometrów. Za pomocą pipety i sterylnego PBS przepłukać probówkę zarodkową i przenieść roztwór do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu zawierającej przefiltrowane komórki. Powtarzaj płukanie, aż w probówce znajdą się cztery mililitry płynu.Odwirować probówki o temperaturze 300 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby spalić w palecie homogenizowaną próbkę komórkową. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant z probówki z okrągłym dnem, uważając, aby nie naruszyć komórek osadzonych na dnie. Następnie użyj 100 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić ogniwa.Przygotuj jeden X kompletny roztwór podstawowy metylocelulozy i użyj trzech mililitrowych strzykawek i 16 igieł, aby dodać 2,5 mililitra sterylnych okrągłodennych 14-mililitrowych probówek. Użyj jednej probówki dla każdego badanego stanu. W celu różnicowania szpiku dodaj jeden procent surowicy karpia i 0,3 miligrama na mililitr rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów danio pręgowanego lub GCSF do pożywki metylocelulozowej.W celu różnicowania erytroidalnego dodaj jeden procent surowicy karpia i 0,1 miligrama na mililitr rekombinowanej erytropoetyny danio pręgowanego lub EPO do pożywki metylocelulozowej. Aby zbadać wieloliniowych progenitorów, dodaj EPO i GCSF. Za pomocą pipety dodać 100 mikrolitrów z 10 zdysocjowanych zarodków na powierzchnię przygotowanej metylocelulozy z rekombinowanymi cytokinami w surowicy karpia.Zakryj pokrywkę i delikatnie przemieszaj, aby w pełni zhomogenizować próbkę. Każda probówka powinna teraz zawierać zdysocjowaną tkankę 10 zarodków. Używając trzech mililitrowych strzykawek i 16 igieł, podziel jeden mililitr próbki na dwie oddzielne szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów.Upewnij się, że próbka jest całkowicie rozproszona na szalce Petriego. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki. Umieść 35-milimetrowe szalki Petriego z komórkami i metylocelulozą na 15-centymetrowej szalce Petriego.Do każdej dużej płytki dodaj jedno 35-milimetrowe naczynie z pięcioma mililitrami sterylnej wody, aby nawilżyć próbki. Inkubuj naczynia w temperaturze 32 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla przez siedem do 10 dni. Na koniec zwizualizuj jednostki tworzące kolonie zgodnie z protokołem tekstowym.Po siedmiu dniach w hodowli z hematopoetycznymi czynnikami wspomagającymi, policzono i zobrazowano przodków 48 zarodków HPF. Co ważne, ilość użytej mukowiscydozy jest bezpośrednio skorelowana z liczbą platerowanych zarodków. Posiewanie czterech lub ośmiu zarodków na mililitr, co koreluje z rozpoczęciem od 10 lub 20 zarodków, na początku eksperymentu, daje odpowiednio około 1200 lub 2400 CFU.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwie i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie trawić zarodków w nadmiarze, ponieważ spowoduje to zniszczenie komórek progenitorowych. Dzięki tej procedurze możesz porównać liczbę przodków obecnych w różnych punktach czasowych.Możesz porównać zmutowane zwierzęta ze zwierzętami typu dzikiego, a także przetestować wpływ leków na rozwój krwi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test metylocelulozy w celu wyliczenia komórek progenitorowych hematopoetycznych danio pręgowanego. Możesz zmienić tę procedurę, aby dopasować ją do swoich konkretnych potrzeb eksperymentalnych, takich jak testowanie określonych cytokin.Nie zapominaj, że praca z krwią i igłami kręgowców może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować ostrożność podczas wykonywania tego testu.

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Ten test jest prostą metodą do ilościowego oznaczania komórek krwiotwórczych w rozwoju embrionalnej danio pręgowanego. Komórki krwi od zdysocjowanego danio pręgowanego poddawane są analizie cytometrii przepływowej. Pozwala to na wykrycie wad krwi u zwierząt zmutowanych oraz po modyfikacji genetycznej.

Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta umożliwia badanie wpływu mutacji genetycznych i leków na hematopoezę.

Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów