Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Ogólnym celem tego protokołu jest zwiększenie ilości izolowanego dwuniciowego DNA i późniejszych wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania z okazów zielnikowych, maksymalizując ich użyteczność w badaniach filogenomicznych. Metoda ta uwalnia potencjał okazów zielnikowych, które w przeciwnym razie nie byłyby przydatne w projektach sekwencjonowania jako sekwencje genomowe ze względu na rozległą degradację próbki. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona na tyle wytrzymała, że rzadkie i historycznie znaczące okazy zielnikowe mogą być wykorzystywane bez konieczności przeprowadzania rozległych destrukcyjnych próbek.

Technika ta rozszerza głębokość próbkowania taksonów w systematycznych projektach rozłożonych w czasie. Pozyskiwanie gatunków jest krokiem ograniczającym, ale dzięki temu protokołowi zbiory historyczne mogą być łatwo wykorzystane w tych badaniach. Dodaj ciekły azot i 30 do 50 miligramów wysterylizowanego piasku, aby zmielić jeden centymetr kwadratowy wstępnie wybranej tkanki zielnikowej na drobny proszek we wstępnie schłodzonym moździerzu i tłuczku.

Odpowiednie mielenie jest niezbędne do pomyślnej izolacji DNA. Należy również zadbać o to, aby próbka została całkowicie sproszkowana. Następnie dodaj zamrożony proszek do dwóch dwumililitrowych probówek, wypełniając nie więcej niż połowę objętości tuby.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów ciepłego roztworu CTAB do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj proszek, odwracając i wirując. Następnie inkubować próbki w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną do 1,5 godziny.

W międzyczasie wiruj co 15 minut. Następnie odwirować próbki o masie 10 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przenieść około 500 mikrolitrów supernatantu do nowego, świeżego zestawu znakowanych probówek.

Do supernatantu dodaj cztery mikrolitry po 10 miligramów na mililitr RNazy A do każdej melodii. Następnie wymieszać zawartość probówki, odwracając ją lub pipetując. Próbki inkubować w bloku grzewczym lub łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Gdy probówki osiągną temperaturę pokojową, dodaj do próbek około 500 mikrolitrów mieszaniny fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego o proporcji 25:24:1. Następnie wymieszać zawartość probówek, odwracając lub powtarzając pipetowanie. Następnie odwirować próbki o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Przenieś górną warstwę wodną, która ma około 400 mikrolitrów, do świeżego zestawu oznakowanych probówek. Do warstwy wodnej w każdej probówce dodać około 400 mikrolitrów mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w proporcji 24:1. Dokładnie wymieszać próbkę przez wielokrotne pipetowanie lub odwrócenie.

Następnie odwirować probówki o masie 12 000 g przez pięć minut i przenieść około 300 mikrolitrów górnej warstwy wodnej do wstępnie schłodzonych, oznakowanych probówek. Następnie dodaj 300 mikrolitrów wstępnie schłodzonego izopropanolu i 12 mikrolitrów 2,5-molowego octanu sodu. Następnie inkubować probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut.

Po inkubacji wyjąć próbki z zamrażarki. Następnie odwirować próbki o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przemyć granulki około 300 do 500 mikrolitrami 70% etanolu.

Ponownie odwirować probówki o masie 12 000 g przez 10 minut. Następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usuń supernatant. Następnie wysusz granulki na powietrzu i rozpuść DNA w 50 mikrolitrach buforu 1X Tris-EDTA.

Dodaj jeden do 16 mikrolitrów wyizolowanego DNA i dwa mikrolitry buforu reakcji fragmentacji w 0,2-mililitrowej probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy. Dostosuj końcową objętość do 18 mikrolitrów wodą bez nukleaz. Następnie dodaj dwa mikrolitry dwuniciowego enzymu fragmentacji DNA i krótko wiruj mieszaninę przez kilka sekund drzewa.

Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 8,5 minuty w termocyklerze. Po inkubacji dodać do probówek pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA. Dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby dostosować całkowitą objętość ściętego DNA do 50 mikrolitrów.

Następnie dodaj 45 mikrolitrów kulek SPRI utrzymywanych w temperaturze pokojowej do 50 mikrolitrów ściętego DNA i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Pozostawić próbkę zawierającą probówki na pięć minut. Następnie przenieś probówki na płytkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.

Ostrożnie wydalić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym i odczekaj kolejne 30 sekund w temperaturze pokojowej. Po 30 sekundach ostrożnie usunąć supernatant.

Pozostaw pokrywę tubki otwartą, aby wysuszyć koraliki na powietrzu przez pięć minut na stojaku magnetycznym. Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i wymyj DNA z kulek w 55 mikrolitrach 0,1X buforu Tris-EDTA. Dokładnie wymieszać DNA, powtarzając pipetowanie.

Następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponownie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór zklaruje się w ciągu około dwóch minut. Usunąć 52 mikrolitry supernatantu, a następnie przeprowadzić analizę ilościową DNA, jak opisano w protokole tekstowym.

Do 50 mikrolitrów oczyszczonego i ściętego DNA dodaj trzy mikrolitry endonukleazy, enzymów ogonowych fosforanów i siedem mikrolitrów buforu reakcyjnego. Dokładnie wymieszać DNA i inne składniki, pipetując w górę i w dół. Następnie obróć rurki, aby usunąć bąbelki.

Po odwirowaniu przenieś próbki do termocyklera i ustaw program. Rozcieńczyć łącznik od 25 do 50 razy, aby uzyskać stężenie robocze od 0,6 do 0,3 mikromola. W przypadku sekwencjonowania z krótkim odczytem o wysokiej przepustowości dodaj do probówek 30 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i 2,5 mikrolitra adaptera.

Dokładnie wymieszać zawartość probówek, pipetując w górę i w dół. Ponownie obróć rurki, aby usunąć wszelkie bąbelki. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Dodać trzy mikrolitry komercyjnej mieszaniny glikozylazy uracylo-DNA i endonukleazy glikozylazy DNA VIII do probówek. Dostosuj całkowitą objętość do 96,5 mikrolitra. Dokładnie wymieszaj składniki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w termocyklerze.

W probówce przygotuj mieszaninę reakcji łańcuchowej polimerazy, dodając wszystkie odczynniki do oczyszczonego, podwiązanego adaptorowo DNA. Następnie dobrze wymieszaj reakcję przez wirowanie. Po zakończeniu wiru umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij ustawienie amplifikacji termocyklera.

Dodać do próbki około 25 mikrolitrów kulek magnetycznych utrzymywanych w temperaturze pokojowej i wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Inkubować próbkę przez pięć minut. Następnie przenieś probówki na podstawkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.

Po pięciu minutach przenieść supernatant do nowego zestawu oznaczonych probówek. Następnie do supernatantu dodaj sześć mikrolitrów kulek SPRI utrzymywanych w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj. Po inkubacji próbek przez pięć minut, przenieś probówki na płytkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.

Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.

Po 30 sekundach ostrożnie usuń supernatant i susz kulki na powietrzu przez pięć minut przy otwartej pokrywie probówki, nadal na stojaku magnetycznym. Teraz wyjmij rurki z magnesu. Eluować docelowe DNA z kulek do 33 mikrolitrów 0,1X buforu Tris-EDTA i poddać dokładnemu wymieszaniu.

Po odpowiednim wymieszaniu inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś probówki na podstawkę magnetyczną i odczekaj około dwóch minut, aż roztwór stanie się klarowny. Odpipetować 30 mikrolitrów supernatantu do dwumililitrowych probówek do przechowywania.

Aby pokazać izolację DNA zielnika, przeprowadzono żel agarozowy z dwuniciowym DNA wyizolowanym z różnych próbek zielnikowych. Używając 10 miligramów tkanki liścia, prawie 3,56 do 2, 610 nanogramów dwuniciowego DNA wyizolowano na żel agarozowy. Żel pokazuje zdegradowane DNA zielnika w postaci rozmazu na wszystkich pasach.

Następnie, w celu wykazania odzyskania wysokiej jakości biblioteki sekwencjonowania z DNA wyizolowanego z 10 okazów zielnikowych, uruchomiono żel agarozowy. Przed załadowaniem na żel agarozowy około 1,26 do 464 nanogramów wyizolowanego DNA zielnika poddano enzymatycznemu ścinaniu i oczyszczaniu z 90% objętością kulek. Żel agarozowy wykazuje odzyskanie wysokiej jakości biblioteki sekwencjonowania z DNA 10 okazów zielnikowych.

Biblioteki sekwencjonowania końcowego pokazują pasmo pierwotne od 300 do 500 par zasad. Następnie, aby pokazać sekwencję shotgun DNA pochodzącego z zielnika, uzyskano okrągły wykres genomu chloroplastów TK 686. Sekwencja pokazuje całkowitą długość DNA, odwrócony region powtórzeń oraz obecność dużych i małych regionów pojedynczej kopii.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać na 24 próbkach w czasie krótszym niż 13 godzin, przy zaledwie około ośmiu godzinach aktywnego czasu praktycznego. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak przechwytywanie sekwencji, na powstałych bibliotekach w celu wygenerowania danych jądrowych do badań filogenetycznych.