Name: Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Naucz się solidnej izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania z okazów zielnikowych. Ta metoda umożliwia wykorzystanie historycznych kolekcji w badaniach filogenomicznych bez niszczenia cennych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Taylor AuBuchon-Elder, Jordanowi Teisherowi i Kristinie Zudock za pomoc w pobieraniu próbek zielników, a Ogrodowi Botanicznemu Missouri za dostęp do okazów zielnikowych w celu destrukcyjnego pobierania próbek. Prace te zostały wsparte grantem z National Science Foundation (DEB-1457748).

<ol><li>Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984634">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li>
<li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12509/abstract">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li>
<li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyly+of+Arundinoideae+%28Poaceae%29+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li>
<li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10592-006-9209-7">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li>
<li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+museum+specimens+in+population+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Tre+Eco+%26+Evo%22%5BJournal%5D)">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li>
<li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006320711002679">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li>
<li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed%2C+Phragmites+australis%2C+into+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li>
<li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+museums+to+genomics%3A+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li>
<li>Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+open+the+treasure+chest%3F+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).</li>
<li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00937835">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).</li>
<li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12642/abstract">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li>
<li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-294X.1997.00266.x/full">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li>
<li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+treasure+troves%3A+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).</li>
<li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/00837792.2017.1313383">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li>
<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.citeulike.org/user/echinotrix/article/678648">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406474">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li>
<li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Eco+Resour%22%5BJournal%5D)">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Bio%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MycoCosm+portal%3A+gearing+up+for+1000+fungal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+%28Asparagaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li>
<li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verdant%3A+automated+annotation%2C+alignment%2C+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li>
<li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome%3A+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li>
<li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repbase+Update%2C+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).</li>
<li>McKain, M. R. Transposons. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>Weiß, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).</li>
<li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Przedstawiony tutaj protokół jest kompleksową i solidną metodą izolacji DNA i przygotowania biblioteki sekwencjonowania z wysuszonych okazów roślin. Spójność metody i minimalna potrzeba jej zmiany w oparciu o jakość próbki sprawiają, że jest ona skalowalna w przypadku dużych projektów sekwencjonowania opartych na zielnikach. Włączenie opcjonalnego etapu reamplifikacji dla bibliotek o niskiej wydajności pozwala na włączenie próbek o niskiej jakości, małej ilości, rzadkich lub historycznie ważnych, które w przeciwnym razie...

Kolekcje zielników są potencjalnie cennym źródłem zarówno różnorodności gatunkowej, jak i genomowej dla badań, w tym filogenetyki1,2,3, genetyka populacji4,5, biologia konserwatorska6, biologia gatunków inwazyjnych7, oraz ewolucja cech8. Możliwość uzyskania bogatej różnorodności gatunków, populacji, lokalizacji geograficznych i punktów czasowych podkreśla "skrzynię skarbów"9, która jest zielnikiem. Historycznie rzecz biorąc, zdegradowany charakter DNA pochodzącego z zielnika utrudniał projekty oparte na PCR, często zmuszając badaczy do używania tylko markerów znalezionych w wysokiej kopii, takich jak regiony genomu chloroplastowego lub wewnętrzna transkrybowana ramka dystansowa (ITS) rybosomalnego RNA. Jakość próbek i DNA różni się znacznie w zależności od metod konserwacji9,10, przy czym najczęstszymi formami uszkodzeń są dwuniciowe pęknięcia i fragmentacja od ciepła używanego w procesie suszenia, tworzące tzw. 90% blokadę DNA, która obciążyła badania oparte na PCR11. Oprócz fragmentacji, drugim najczęstszym problemem w genomice zielnika jest zanieczyszczenie, takie jak to pochodzące od grzybów endofitycznych13 lub grzybów nabytych po pobraniu, ale przed zamontowaniem w zielniku12, chociaż ten problem można rozwiązać bioinformatycznie, korzystając z odpowiedniej bazy danych grzybów (patrz poniżej). Trzecim, rzadziej występującym problemem, jest modyfikacja sekwencji poprzez deaminację cytozyny (C/G→T/A)14, chociaż szacuje się, że jest ona niska (~0,03%) w próbkach zielnikowych11. Wraz z pojawieniem się sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (HTS), problem fragmentacji można przezwyciężyć za pomocą krótkich odczytów i głębokości sekwencjonowania12,15, co pozwala na pozyskiwanie danych na poziomie genomu z wielu próbek o niskiej jakości DNA, a czasami nawet pozwala na sekwencjonowanie całego genomu15.
Próbki z zielnika stają się coraz częściej używane i stanowią większy element projektów filogenetycznych16. Obecnym wyzwaniem związanym z wykorzystaniem próbek zielnikowych do HTS jest konsekwentne uzyskiwanie wystarczającej ilości dwuniciowego DNA, co jest niezbędnym warunkiem wstępnym dla protokołów sekwencjonowania, od wielu gatunków w odpowiednim czasie, bez konieczności optymalizacji metod dla poszczególnych okazów. W artykule przedstawiono protokół ekstrakcji DNA i przygotowania biblioteki próbek zielnikowych, który wykorzystuje istniejące metody i modyfikuje je, aby umożliwić szybkie i powtarzalne wyniki. Metoda ta pozwala na pełne przetworzenie od próbki do biblioteki 24 próbek w ciągu 13 godzin, przy 8 godzinach czasu pracy, lub 16 godzin, przy 9 godzinach czasu pracy, gdy wymagany jest opcjonalny etap reamplifikacji. Jednoczesne przetwarzanie większej liczby próbek jest osiągalne, chociaż czynnikiem ograniczającym jest wydajność wirówki i umiejętności techniczne. Protokół został zaprojektowany tak, aby wymagał tylko typowego sprzętu laboratoryjnego (termocykler, wirówka i stojaki magnetyczne) zamiast specjalistycznego sprzętu, takiego jak nebulizator lub sonikator, do ścinania DNA.
Jakość DNA, rozmiar fragmentu i ilość są czynnikami ograniczającymi wykorzystanie próbek zielnika w eksperymentach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Inne metody izolowania DNA zielnika i tworzenia wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania wykazały użyteczność użycia zaledwie 10 ng DNA16; wymagają jednak eksperymentalnego określenia optymalnej liczby cykli PCR wymaganych do przygotowania biblioteki. Staje się to niepraktyczne, gdy mamy do czynienia z niezwykle małymi ilościami żywotnego dwuniciowego DNA (dsDNA), ponieważ niektóre okazy zielnikowe wytwarzają tylko tyle DNA, ile można przygotować w jednej bibliotece. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje pojedynczą liczbę cykli niezależnie od jakości próbki, dzięki czemu żadne DNA nie jest tracone na etapach optymalizacji biblioteki. Zamiast tego krok reamplifikacji jest wywoływany, gdy biblioteki nie spełniają minimalnych ilości potrzebnych do sekwencjonowania. Wiele próbek zielnikowych jest rzadkich i zawiera niewiele materiału, co w wielu przypadkach utrudnia uzasadnienie destrukcyjnego pobierania próbek. Aby temu przeciwdziałać, zaprezentowany protokół pozwala na wprowadzenie danych wejściowych dsDNA o rozmiarach mniejszych niż 1,25 ng w procesie przygotowania biblioteki, rozszerzając zakres żywotnych próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i minimalizując potrzebę destrukcyjnego pobierania próbek próbek.
Poniższy protokół został zoptymalizowany dla traw i przetestowany na setkach różnych gatunków z próbek zielnika, chociaż spodziewamy się, że protokół może być zastosowany do wielu innych grup roślin. Obejmuje opcjonalny etap odzyskiwania, który można wykorzystać do uratowania rzadkich okazów o niskiej jakości i/lub rzadkich. Opierając się na ponad dwustu przetestowanych próbkach zielnikowych, protokół ten działa na okazach o niskim wkładzie tkankowym i jakości, pozwalając na zachowanie rzadkich okazów poprzez minimalne destrukcyjne pobieranie próbek. Tutaj pokazano, że protokół ten może zapewnić wysokiej jakości biblioteki, które można sekwencjonować dla projektów opartych na filogenomice.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 dobrze&nbsp;</td></tr><tr><td>System obrazowania żelowego</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy test porównawczy do suchej kąpieli</td><td>Naukowy</td><td></td> system do elektroforezy BSH1001 <td></td></tr><tr><td></td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Ultra czysta woda)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Rurka DNA LoBind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td> Moździerz <td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>tłuczek porcelanowy</td></tr><tr><td></td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>porcelana</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Probówka paskowa i nasadka do PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Krótkotrwałe przechowywanie</td> <td>ciekłego azotuNalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Stojak z pierścieniem magnetycznym&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 dobrze&nbsp;</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła z płytą grzejną</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x TE Bufor</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERKAPTOETANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodny octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agaroza</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder Gold</td><td>Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy dsDNA HS</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra czysty</td></tr><tr><td>barwnik ładujący żel fioletowy (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentaza</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos dla Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Zestaw podkładów dwuindeksowych 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór fenolu</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Piasek kwarcowy</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady wzmacniające</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>zobacz tekst</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

solidna izolacja dna i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Zioła są nieocenionym źródłem materiału roślinnego, który może być wykorzystany w różnych badaniach biologicznych. Korzystanie z okazów zielnikowych wiąże się z wieloma wyzwaniami, w tym jakością konserwacji próbek, zdegradowanym DNA i destrukcyjnym pobieraniem próbek rzadkich okazów. Aby efektywniej wykorzystać materiał zielnikowy w dużych projektach sekwencjonowania, potrzebna jest niezawodna i skalowalna metoda izolacji DNA i przygotowania biblioteki. W artykule przedstawiono solidny, kompleksowy protokół izolacji DNA i wysokoprzepustowej budowy biblioteki z okazów zielnikowych, który nie wymaga modyfikacji dla poszczególnych próbek. Protokół ten jest dostosowany do suszonego materiału roślinnego o niskiej jakości i wykorzystuje istniejące metody, optymalizując mielenie tkanek, modyfikując wybór rozmiaru biblioteki i wprowadzając opcjonalny krok reamplifikacji dla bibliotek o niskiej wydajności. Ponowna amplifikacja bibliotek DNA o niskiej wydajności może uratować próbki pochodzące z niezastąpionych i potencjalnie cennych okazów zielnikowych, negując potrzebę dodatkowego destrukcyjnego pobierania próbek i bez wprowadzania dostrzegalnego odchylenia sekwencjonowania dla powszechnych zastosowań filogenetycznych. Protokół został przetestowany na setkach gatunków traw, ale oczekuje się, że po weryfikacji będzie można go dostosować do stosowania w innych liniach roślin. Protokół ten może być ograniczony przez skrajnie zdegradowane DNA, w którym fragmenty nie występują w pożądanym zakresie wielkości, oraz przez metabolity wtórne obecne w niektórych materiałach roślinnych, które hamują izolację czystego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten wprowadza szybką i kompleksową metodę, która pozwala na izolację DNA i przygotowanie biblioteki 24 próbek w mniej niż 13 godzin, przy zaledwie 8 godzinach aktywnego czasu pracy przy minimalnych modyfikacjach.

Izolacja DNA i końcowy uzysk biblioteki 
W niniejszym badaniu wykazano skuteczność protokołu izolacji DNA z materiałów zielnikowych oraz odzyskiwania wysokiej jakości bibliotek sekwencyjnych, wykorzystując pięćdziesiąt różnych próbek, z których najstarsza pochodziła z 1920 roku, a najmłodsza z 2012 roku (Tabela 2). Do izolacji DNA z każdej próbki wykorzystano około 10 mg tkanki liściowej. W miarę możliwości preferowano tkankę liściową o bardziej zielon...

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zwiększenie ilości izolowanego dwuniciowego DNA i późniejszych wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania z okazów zielnikowych, maksymalizując ich użyteczność w badaniach filogenomicznych. Metoda ta uwalnia potencjał okazów zielnikowych, które w przeciwnym razie nie byłyby przydatne w projektach sekwencjonowania jako sekwencje genomowe ze względu na rozległą degradację próbki. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona na tyle wytrzymała, że rzadkie i historycznie znaczące okazy zielnikowe mogą być wykorzystywane bez konieczności przeprowadzania rozległych destrukcyjnych próbek.Technika ta rozszerza głębokość próbkowania taksonów w systematycznych projektach rozłożonych w czasie. Pozyskiwanie gatunków jest krokiem ograniczającym, ale dzięki temu protokołowi zbiory historyczne mogą być łatwo wykorzystane w tych badaniach. Dodaj ciekły azot i 30 do 50 miligramów wysterylizowanego piasku, aby zmielić jeden centymetr kwadratowy wstępnie wybranej tkanki zielnikowej na drobny proszek we wstępnie schłodzonym moździerzu i tłuczku.Odpowiednie mielenie jest niezbędne do pomyślnej izolacji DNA. Należy również zadbać o to, aby próbka została całkowicie sproszkowana. Następnie dodaj zamrożony proszek do dwóch dwumililitrowych probówek, wypełniając nie więcej niż połowę objętości tuby.Następnie dodaj 600 mikrolitrów ciepłego roztworu CTAB do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj proszek, odwracając i wirując. Następnie inkubować próbki w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną do 1,5 godziny.W międzyczasie wiruj co 15 minut. Następnie odwirować próbki o masie 10 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przenieść około 500 mikrolitrów supernatantu do nowego, świeżego zestawu znakowanych probówek.Do supernatantu dodaj cztery mikrolitry po 10 miligramów na mililitr RNazy A do każdej melodii. Następnie wymieszać zawartość probówki, odwracając ją lub pipetując. Próbki inkubować w bloku grzewczym lub łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Gdy probówki osiągną temperaturę pokojową, dodaj do próbek około 500 mikrolitrów mieszaniny fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego o proporcji 25:24:1. Następnie wymieszać zawartość probówek, odwracając lub powtarzając pipetowanie. Następnie odwirować próbki o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Przenieś górną warstwę wodną, która ma około 400 mikrolitrów, do świeżego zestawu oznakowanych probówek. Do warstwy wodnej w każdej probówce dodać około 400 mikrolitrów mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w proporcji 24:1. Dokładnie wymieszać próbkę przez wielokrotne pipetowanie lub odwrócenie.Następnie odwirować probówki o masie 12 000 g przez pięć minut i przenieść około 300 mikrolitrów górnej warstwy wodnej do wstępnie schłodzonych, oznakowanych probówek. Następnie dodaj 300 mikrolitrów wstępnie schłodzonego izopropanolu i 12 mikrolitrów 2,5-molowego octanu sodu. Następnie inkubować probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut.Po inkubacji wyjąć próbki z zamrażarki. Następnie odwirować próbki o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przemyć granulki około 300 do 500 mikrolitrami 70% etanolu.Ponownie odwirować probówki o masie 12 000 g przez 10 minut. Następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usuń supernatant. Następnie wysusz granulki na powietrzu i rozpuść DNA w 50 mikrolitrach buforu 1X Tris-EDTA.Dodaj jeden do 16 mikrolitrów wyizolowanego DNA i dwa mikrolitry buforu reakcji fragmentacji w 0,2-mililitrowej probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy. Dostosuj końcową objętość do 18 mikrolitrów wodą bez nukleaz. Następnie dodaj dwa mikrolitry dwuniciowego enzymu fragmentacji DNA i krótko wiruj mieszaninę przez kilka sekund drzewa.Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 8,5 minuty w termocyklerze. Po inkubacji dodać do probówek pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA. Dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby dostosować całkowitą objętość ściętego DNA do 50 mikrolitrów.Następnie dodaj 45 mikrolitrów kulek SPRI utrzymywanych w temperaturze pokojowej do 50 mikrolitrów ściętego DNA i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Pozostawić próbkę zawierającą probówki na pięć minut. Następnie przenieś probówki na płytkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.Ostrożnie wydalić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym i odczekaj kolejne 30 sekund w temperaturze pokojowej. Po 30 sekundach ostrożnie usunąć supernatant.Pozostaw pokrywę tubki otwartą, aby wysuszyć koraliki na powietrzu przez pięć minut na stojaku magnetycznym. Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i wymyj DNA z kulek w 55 mikrolitrach 0,1X buforu Tris-EDTA. Dokładnie wymieszać DNA, powtarzając pipetowanie.Następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponownie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór zklaruje się w ciągu około dwóch minut. Usunąć 52 mikrolitry supernatantu, a następnie przeprowadzić analizę ilościową DNA, jak opisano w protokole tekstowym.Do 50 mikrolitrów oczyszczonego i ściętego DNA dodaj trzy mikrolitry endonukleazy, enzymów ogonowych fosforanów i siedem mikrolitrów buforu reakcyjnego. Dokładnie wymieszać DNA i inne składniki, pipetując w górę i w dół. Następnie obróć rurki, aby usunąć bąbelki.Po odwirowaniu przenieś próbki do termocyklera i ustaw program. Rozcieńczyć łącznik od 25 do 50 razy, aby uzyskać stężenie robocze od 0,6 do 0,3 mikromola. W przypadku sekwencjonowania z krótkim odczytem o wysokiej przepustowości dodaj do probówek 30 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i 2,5 mikrolitra adaptera.Dokładnie wymieszać zawartość probówek, pipetując w górę i w dół. Ponownie obróć rurki, aby usunąć wszelkie bąbelki. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.Dodać trzy mikrolitry komercyjnej mieszaniny glikozylazy uracylo-DNA i endonukleazy glikozylazy DNA VIII do probówek. Dostosuj całkowitą objętość do 96,5 mikrolitra. Dokładnie wymieszaj składniki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w termocyklerze.W probówce przygotuj mieszaninę reakcji łańcuchowej polimerazy, dodając wszystkie odczynniki do oczyszczonego, podwiązanego adaptorowo DNA. Następnie dobrze wymieszaj reakcję przez wirowanie. Po zakończeniu wiru umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij ustawienie amplifikacji termocyklera.Dodać do próbki około 25 mikrolitrów kulek magnetycznych utrzymywanych w temperaturze pokojowej i wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Inkubować próbkę przez pięć minut. Następnie przenieś probówki na podstawkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.Po pięciu minutach przenieść supernatant do nowego zestawu oznaczonych probówek. Następnie do supernatantu dodaj sześć mikrolitrów kulek SPRI utrzymywanych w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj. Po inkubacji próbek przez pięć minut, przenieś probówki na płytkę magnetyczną i odczekaj kolejne pięć minut.Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.Po 30 sekundach ostrożnie usuń supernatant i susz kulki na powietrzu przez pięć minut przy otwartej pokrywie probówki, nadal na stojaku magnetycznym. Teraz wyjmij rurki z magnesu. Eluować docelowe DNA z kulek do 33 mikrolitrów 0,1X buforu Tris-EDTA i poddać dokładnemu wymieszaniu.Po odpowiednim wymieszaniu inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś probówki na podstawkę magnetyczną i odczekaj około dwóch minut, aż roztwór stanie się klarowny. Odpipetować 30 mikrolitrów supernatantu do dwumililitrowych probówek do przechowywania.Aby pokazać izolację DNA zielnika, przeprowadzono żel agarozowy z dwuniciowym DNA wyizolowanym z różnych próbek zielnikowych. Używając 10 miligramów tkanki liścia, prawie 3,56 do 2, 610 nanogramów dwuniciowego DNA wyizolowano na żel agarozowy. Żel pokazuje zdegradowane DNA zielnika w postaci rozmazu na wszystkich pasach.Następnie, w celu wykazania odzyskania wysokiej jakości biblioteki sekwencjonowania z DNA wyizolowanego z 10 okazów zielnikowych, uruchomiono żel agarozowy. Przed załadowaniem na żel agarozowy około 1,26 do 464 nanogramów wyizolowanego DNA zielnika poddano enzymatycznemu ścinaniu i oczyszczaniu z 90% objętością kulek. Żel agarozowy wykazuje odzyskanie wysokiej jakości biblioteki sekwencjonowania z DNA 10 okazów zielnikowych.Biblioteki sekwencjonowania końcowego pokazują pasmo pierwotne od 300 do 500 par zasad. Następnie, aby pokazać sekwencję shotgun DNA pochodzącego z zielnika, uzyskano okrągły wykres genomu chloroplastów TK 686. Sekwencja pokazuje całkowitą długość DNA, odwrócony region powtórzeń oraz obecność dużych i małych regionów pojedynczej kopii.Po opanowaniu technikę tę można wykonać na 24 próbkach w czasie krótszym niż 13 godzin, przy zaledwie około ośmiu godzinach aktywnego czasu praktycznego. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak przechwytywanie sekwencji, na powstałych bibliotekach w celu wygenerowania danych jądrowych do badań filogenetycznych.

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Niniejszy protokół opisuje użycie technologii kodów kreskowych DNA do uwierzytelniania materiałów leczniczych pochodzenia roślinnego, oraz rośliny leczniczej Angelica sinensis (Oliv.) Jako przykład wskazano Diels.

Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych

Naucz się solidnej izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania z okazów zielnikowych. Ta metoda umożliwia wykorzystanie historycznych kolekcji w badaniach filogenomicznych bez niszczenia cennych próbek.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Przeglądaj więcej filmów