Mapowanie metaboliczne: ilościowa cytochemia enzymatyczna i histochemia w celu określenia aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach

Ten film pokazuje, jak wykonać mapowanie metaboliczne. Procedura ilościowego określania aktywności określonych enzymów zwanych dehydrogenazami. Komórki przylegają do szkiełka mikroskopowego lub zamrożonej tkanki.

Kilkadziesiąt lat temu opracowaliśmy całą serię technik mapowania metabolicznego, zwanych wówczas enzymistochemią, do wykrywania aktywności w tkankach i komórkach pod mikroskopem. Jednak metabolizm stał się przestarzały podczas rewolucji genetycznej pod koniec ubiegłego wieku. Ale teraz metabolizm znów jest gorący

Spójrzmy na przykład na komórki rakowe. Metabolizm jest obecnie uważany za cel terapeutyczny, a zatem oznaczanie aktywności w komórkach i tkankach jest ponownie gorące. Kluczowym składnikiem buforu reakcyjnego jest alkohol poliwinylowy, czyli PVA.

Jest on rozpuszczony w buforze fosforanowym w stężeniu 18% PVA, jest pylisty i toksyczny w przypadku wdychania, dlatego należy zważyć PVA pod wyciągiem. Ze względu na wysokie stężenie PVA w buforze fosforanowym, podgrzej butelkę buforową do reakcji au bain-marie, mieszając. Pamiętaj, aby luźno zakręcić nakrętkę na butelce, w przeciwnym razie butelka może eksplodować.

Może upłynąć do 15 minut, zanim PVA całkowicie rozpuści się w buforze fosforanowym. Jeśli tak, roztwór powinien być przezroczysty z małymi pęcherzykami powietrza, które powstały w wyniku mieszania. Lepki roztwór PVA można pipetować do probówek buforowych reakcyjnych za pomocą szerokiej pipety.

Utrzymuj rurki w temperaturze co najmniej 40 stopni Celsjusza lub wyższej, aby zapobiec zestaleniu się PVA. Jeden mililitr roztworu PVA wystarcza na około cztery cytospiny, czyli dwa preparaty tkankowe. Dla pozostałych składników buforu reakcyjnego, żółty nitroniebieski chlorek tetrazolu zwany również nitroBT, rozpuszcza się w mieszaninie etanolu i dimetyloformamidu, ogrzewając go w szklanej fiolce w palniku Bunsena.

Roztwór nie powinien dojść do wrzenia, w przeciwnym razie objętość zbytnio się zmniejszy. Dlatego nie należy pozostawiać fiolki zbyt długo w płomieniu i regularnie wstrząsać. Po rozpuszczeniu trzymaj go na lodzie i szybko przejdź do następnego kroku, ponieważ rozpuszczony nitroBT szybko ginie.

NitroBT jest żółtym proszkiem, który będzie leżał na dnie szklanej fiolki zawierającej etanol i DMF, jeśli nie będzie utrzymywany w stanie rozpuszczonym. Możesz co kilka razy sprawdzać, czy nitroBT jest rozpuszczony. Roztwór będzie wtedy żółty przezroczysty.

Po rozpuszczeniu nitroBT można pipetować do fiolek zawierających roztwór PVA. Delikatnie wymieszaj cienką łyżką lub cienką szpatułką, aby wymieszać nitroBT i bufor. Zrób to krok po kroku dla wszystkich składników buforu reakcyjnego, które są wymienione w tabeli pierwszej pełnego tekstu.

Staraj się nie wytwarzać zbyt dużej ilości pęcherzyków powietrza podczas mieszania składników reakcji z roztworem PVA. Sztuczka polega na ciągłym mieszaniu, nie wyjmując łyżki ani szpatułki z roztworu. Nośnik elektronów, siarczan metylu metoksyfenazynu, należy chronić przed światłem i rozpuścić w buforze reakcyjnym na końcu.

Czerwony kolor MPMS jest wygodny do dwukrotnego sprawdzenia, czy wszystkie składniki są prawidłowo rozpuszczone. Przygotowując bufor reakcyjny i mieszając w nim składniki, podgrzewaj szkiełka przez 50 minut w inkubatorze zawierającym ciepłą wodę. Utrzymuj niski poziom wody w komorze inkubacyjnej.

Przy zamkniętej pokrywie utrzyma to wilgotne środowisko reakcji. Przy otwartej pokrywie woda utrzyma szkiełka w ciepłej temperaturze. Nanieść bufor reakcyjny na preparaty komórkowe lub tkankowe za pomocą szklanej pipety.

Nie martw się o małe pęcherzyki powietrza, ponieważ będą one spływać na powierzchnię i nie będą zakłócać reakcji w komórkach lub tkankach. W czasie inkubacji pokrywę komory inkubacyjnej należy trzymać zamkniętą. Dzięki temu reakcja zajdzie w wilgotnym środowisku, aby zapobiec wyschnięciu bufora PVA.

Większość reakcji dehydrogenazy w eksperymentach mapowania metabolicznego zachodzi w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubować szkiełka w buforze reakcyjnym przez określony czas, który można znaleźć w tabeli pierwszej artykułu z pełnym tekstem. Można łatwo zobaczyć, czy reakcja zadziałała, ponieważ komórki lub tkanki zmienią kolor na ciemnoniebieski lub fioletowy ze względu na aktywność dehydrogenaz.

Który ostatecznie zamienia się w bezbarwny, nierozpuszczalny nitroBT do ciemnoniebieskiego formazolu, który wytrąca się w miejscu aktywności dehydrogenazy. Reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana w trzech etapach. Najpierw nadmiar pożywki inkubacyjnej należy stuknąć na tkankę.

Po drugie, pożywkę inkubacyjną należy zmyć ze szkiełek mikroskopowych za pomocą mechanicznego przemywania w buforze fosforanowym o pH 5,3 w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po trzecie, szkiełka mikroskopowe należy pozostawić w świeżym buforze fosforanowym o pH 5,3 w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 20 minut. Po czwarte, bufor fosforanowy można spłukać za pomocą wody z kranu, a następnie destylowanej.

Można łatwo zauważyć, że bufor reakcyjny odpada. Niskie pH buforu zatrzymującego pomaga w zatrzymaniu reakcji dehydrogenazy wewnątrz komórek. Umieść szkiełka w buforze zatrzymującym świeżość raz lub dwa razy, w zależności od tego, ile szkiełek przetwarzasz na raz.

Opłucz również szkiełka wodą z kranu i zakończ wodą destylowaną. Teraz szkiełka można suszyć na podgrzewaczu do szkiełków i zamykać w środku. Ostrożnie osusz tylną stronę szkiełka, wycierając ją i umieść na szkiełku podgrzewacz nagrzanym do 50 do 60 stopni Celsjusza.

Gdy szkiełka wyschną, do zamknięcia i konserwacji szkiełek nakrywkowych można użyć roztworu gliceryny glicerolu i szkiełek nakrywkowych. Przechowuj slajdy w lodówce do czasu przystąpienia do akwizycji obrazu. Jest to kolorowa mikrofotografia reprezentatywnego przekroju tkanki na szklanym szkiełku, która została przetworzona w eksperymencie pokazanym na tym filmie.

Jest to wycinek glejaka, a badanym enzymem jest dehydrogenaza lepto. Każda dehydrogenaza wytwarza jednostkę PH, a każda cząsteczka PH jednostki przekształca jedną cząsteczkę nitroBT, żółtą sól tetrazolową, w jedną cząsteczkę formazolu, fioletowy osad pokazany na tym obrazie. Można zaobserwować wysoką aktywność dehydrogenazy mleczanowej wewnątrzkomórkowo w komórkach nowotworowych pokazanych jako ciemnofioletowe.

Naczynia krwionośne mają niższą aktywność i są białe. Jest to monochromatyczny obraz tego samego obszaru slajdu. Które można wykorzystać do ilościowego określenia aktywności enzymu zgodnie z opisem w protokole.

Im więcej formazanu jest produkowane, tym ciemniejszy piksel i tym wyższa absorbancja. Absorbancja może być następnie przekształcona w pikosole o ph jednostki, które zostały wygenerowane. Tak więc mapowanie metaboliczne jest łatwe do wykonania.

Jest bardzo szybki i tani. Więc wykorzystaj go w swoich badaniach.