Name: Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj strategię HMEJ do ukierunkowanej integracji DNA in vivo przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia wysokowydajne korygowanie mutacji genetycznych w organizmie żywym z potencjałem terapeutycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CAS Strategic Priority Research Program (XDB02050007, XDA01010409), National Hightech R&D Program (863 Program; 2015AA020307), National Natural Science Foundation of China (granty NSFC 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth Thousand Talents Program (do HY), projekt Przełom Chińskiej Akademii Nauk, projekt Komitetu Nauki i Technologii Miasta Szanghaju (16JC1420202 do HY), Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (MOST; 2016YFA0100500).

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych w Instytucie Nauk Biologicznych w Szanghaju (CAS).
1. Projektowanie plazmidów dawcy
<ol>
	<li>Wybór sgRNA
	<ol>
		<li>Korzystaj z internetowych narzędzi do projektowania CRISPR, aby przewidzieć sgRNA w regionie docelowym11,12,13,14,15. Dla locus Cdx2 zaprojektuj sześć różnych sgRNA (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) wokół kodonu stop o wyższej randze i niższym potencjale poza celami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 A)16.</li>
		<li>Linearyzować 2 μg wektorów ekspresyjnych Cas9-CMV-EGFP i sgRNA przez trawienie BbsI (1 μL BbsI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy końcowym stężeniu 1 U/μL w objętości 20 μL). Następnie oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania żelu z 1% żelem agarozowym w buforze 1× TAE.</li>
		<li>Wymieszać parę oligonukleotydów sgRNA w 10 μl 1× buforu ligazy DNA T4 do końcowego stężenia 50 μM. Inkubować roztwór oligonukleotydu stosując gradient temperatury od 95 °C do 25 °C z szybkością zmian temperatury 5 °C /5 min (95 °C przez 5 min, następnie 90 °C przez 5 minut, 85 °C przez 5 minut itd.), które będą wyżarzać oligonukleotydy.</li>
		<li>Wymieszaj 4 μl wyżarzonego produktu, 2 μl zlinearyzowanego wektora z 1 μl ligazy DNA T4 w 10 μl 1× buforu ligazy DNA T4, a następnie podwiązaj w temperaturze 22 °C przez 1-2 godziny (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test endonukleazy T7 sgRNA 
	UWAGA: Skuteczność celowania sgRNA użytego w eksperymencie knock-in jest oceniana za pomocą testu endonukleazy T7 (T7EI) 17. Wybierz sgRNA o wysokiej wydajności cięcia DNA i małej odległości między miejscem cięcia sgRNA a kodonem stop.
	<ol>
		<li>Transfekcyjne wektory ekspresji Cas9-sgRNA-EGFP do linii komórkowych N2a hodowanych w DMEM, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% PSG i 1% aminokwasem endogennym za pomocą zestawu do transfekcji (patrz tabela materiałów). Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Po 48 godzinach inkubacji zbierz 5 000 transfekowanych komórek (GFP+) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu komórek nietransfekowanych jako kontroli.</li>
		<li>Zebrane komórki trawić w 2-5 μl buforu do lizy (0,1% Triton X-100, 0,1% Tween 20 i 100 μg/ml Proteinazy K) w temperaturze 56 °C przez 30 min, a następnie podgrzewać inaktywację proteinazy K w temperaturze 95 °C przez 10 min.</li>
		<li>Amplifikować próbkę za pomocą zagnieżdżonej metody PCR (Tabela 1) przy użyciu protokołu producenta. Wielkość produktów PCR jest ustawiona na 300-500 pz.
		<ol>
			<li>Wymieszać 1 μl produktu lizy z polimerazą DNA i parą zewnętrznych starterów rozpoznających sekwencję wokół miejsca docelowego sgRNA (0,1 μM, stężenie końcowe) (Tabela 1) i przeprowadzić pierwszorzędową reakcję PCR w objętości 20 μl.</li>
			<li>Aktywować polimerazę DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut i przeprowadzić pierwotną reakcję PCR przez 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 24 s (1 min/1 kb), z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 min.</li>
			<li>Wykonaj wtórny PCR, używając 1 μl pierwotnego produktu PCR i pary zagnieżdżonych wewnętrznych starterów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Denaturacja i ponowne wyżarzanie 300-600 ng oczyszczonego produktu PCR w 20 μl 1× buforu reakcyjnego T7EI (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7,9) przy użyciu gradientu temperatury od 95 °C do 25 °C z szybkością 5 °C /5 min.</li>
		<li>Dodać 1 μl enzymu T7EI do wyżarzonych produktów PCR i trawić w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Następnie uruchomić produkt wytrawiający na 2% żelu agarozowym w buforze 1×TAE pod napięciem 120 V przez 40 minut, aż do rozdzielenia fragmentów (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Użyj ImageJ, aby określić intensywność pasm naciętego i nieprzeciętego DNA. Oblicz częstość indel, korzystając z metod, jak opisano wcześniej9 (Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa wektora dawcy 
	UWAGA: Aby wygenerować wektory dawcy HMEJ dla genu Cdx2, skonstruuj DNA dawcy (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) otoczone 23 nt Cdx2-sgRNA sekwencją celującą na obu końcach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D i <silna klasa = "xfig"> Rysunek 1E). PAM sekwencji docelowej przylegał do końca ramienia homologicznego. Montaż Gibsona jest zalecany do klonowania dawcy HMEJ.
	<ol>
		<li>Amplifikować lewe ramię homologii 800 pz (HAL) za pomocą przedniego startera-1F (zawierającego 15-20 nt nakładającej się sekwencji z wektora, sekwencję celującą 23 nt Cdx2-sgRNA i około 20 nt sekwencję z HAL) i odwrócony starter-1R (zawierający 15-20 pz nakładającej się sekwencji z p2A-mCherry i około 20 nt sekwencji z HAL) przy końcowym stężeniu 0,1 μM przy użyciu mysiego genomowego DNA przy 200 ng / μL (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, Tabela 1).</li>
		<li>Amplifikować fragment insercji p2A-mCherry za pomocą startera do przodu-2F (zawierającego 15-20 nt sekwencji nakładającej się z HAL i około 20 nt sekwencji z fragmentu insercji) i odwrotnego startera-2R (zawierającego 15-20 nt sekwencji nakładającej się z HAR i około 20 nt sekwencji z fragmentu insercji) przy końcowym stężeniu 0,1 μM przy użyciu genomowego DNA lub plazmidu z sekwencjami reporterowymi przy 100 ng / μL lub 30 ng / μL (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D, Tabela 1).</li>
		<li>Amplifikuj ramię prawej homologii 800 pz (HAR) za pomocą przedniego startera-3F (zawierającego 15-20 nt sekwencji nakładania się wektora, 23 nt sekwencji celującej Cdx2-sgRNA i około 20 nt sekwencji z HAR) i odwróconego startera-3R (zawierającego 15-20 nt nakładającej się sekwencji z p2A-mCherry i około 20 nt sekwencji z HAR) przy końcowym stężeniu 0,1 μM przy użyciu mysiego genomowego DNA przy 200 ng / μL (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, Tabela 1).</li>
		<li>Uruchomić wszystkie produkty PCR na 1% żelu agarozowym w buforze 1×TAE i oczyścić produkty PCR o oczekiwanej wielkości za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 1).</li>
		<li>Przetraw 50-100 ng wektora konstrukcyjnego za pomocą KpnI i XbaI. Wymieszaj 2 μL zlinearyzowanego wektora przy 30-40 ng/μL z trzema amplifikowanymi fragmentami PCR (1 μL na każdy, 100-200 ng/μL) w 2x mieszance Gibsona. DodaćH2O, aby dostosować końcową objętość do 10 μl. Inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 60 minut.</li>
		<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli za pomocą całego zmontowanego produktu i wyekstrahuj konstrukty plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj dawcę HMEJ za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Edycja genomu w embrionach myszy przy użyciu metody opartej na HMEJ
<ol>
	<li>Produkcja mRNA Cas9
	<ol>
		<li>W przypadku przygotowania mRNA Cas9 dodaj sekwencję promotora T7 do regionu kodującego Cas9 przez amplifikację PCR przy użyciu odpowiedniej pary starterów wymienionej w tabeli 1. Dodać starter Cas9 F / R o końcowym stężeniu 0,1 μM i 20 ng wektora wyrażającego Cas9 do 1× mieszaniny polimerazy DNA o wysokiej wierności. Dostosować końcową objętość do 50 μl za pomocąH2O.</li>
		<li>Aktywować polimerazę DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut i przeprowadzić PCR przez 36 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 68 °C przez 4 minuty (1 min/1 kb), z końcowym przedłużeniem w temperaturze 68 °C przez 10 min.</li>
		<li>Produkt T7-Cas9 PCR należy oczyścić do transkrypcji in vitro (IVT), a następnie dokonać transkrypcji 0,5-1 μg DNA za pomocą zestawu do transkrypcji mRNA w temperaturze 37 °C przez 8 godzin w całkowitej objętości 20 μL, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać 1 μl DNazy do mieszaniny w celu usunięcia matrycy DNA w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodać ogon poli-A na 45 minut w temperaturze 37 °C i odzyskać mRNA Cas9 za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja sgRNA
	<ol>
		<li>Wygeneruj matrycę sgRNA napędzaną przez promotor T7 z polimerazą DNA o wysokiej wierności, jak powyżej. Jako szablon wybierz rusztowanie zawierające wektor sgRNA. Zastosowane startery są wymienione w tabeli 1.</li>
		<li>Oczyścić produkt T7-sgRNA PCR i użyć 0,5-1 μg DNA jako matrycy do transkrypcji sgRNA in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji krótkiego RNA w temperaturze 37 °C przez 6 godzin w całkowitej objętości 20 μl, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać 1 μl DNazy do mieszaniny i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu usunięcia matrycy DNA. Oczyść sgRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, jak powyżej (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Rozcieńczyć sgRNA do 500 ng/μl w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy. 
		UWAGA: Rybonukleoproteiny CRISPR (RNP) są alternatywnym substytutem o lepszej wydajności cięcia18,19,20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie zarodków, mikroiniekcja i hodowla in vitro 
	<ol>
		<li>U samic myszy B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) (w wieku 7-8 tygodni) superowulacji przez ciężarną gonadotropinę surowicy klaczy (PMSG), a następnie ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) 48 godzin później. Po wstrzyknięciu hCG należy na noc umieścić samice z samcami B6D2F1.</li>
		<li>Ofiarować samice w znieczuleniu CO2 , 24 godziny po wstrzyknięciu hCG. Zebrać zapłodnione zarodki z ich jajowodów (po 30 - 50 zarodków na każdą samicę) w pożywce M2.</li>
		<li>Zapłodnione zarodki (około 300 komórek jajowych do jednodniowego wstrzykiwania) umieścić w pożywce KSOM (5,55 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/L glukozy, 1,12 g/L mleczan sodu, 2,1 g/L NaHCO3, 0,02 g/L pirogronian sodu, 0,25 g/l CaCl2•2H2O, 0,004 g/l EDTA, 0,146 g/l L-glutaminy i 1 g/l albuminy surowicy bydlęcej) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Wymieszaj mRNA Cas9 (100 ng/μl), sgRNA (50 ng/μL) i wektor donorowy HMEJ (100 ng/μL) i dodajH2O, aby dostosować końcową objętość do 10 μL. Umieść mieszaninę na lodzie.</li>
		<li>Wyciągnąć igły kapilarne (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm z filamentem) za pomocą ściągacza do mikropipet (parametry: ciepło, 74; ciągnięcie, 60; prędkość, 80; czas/opóźnienie, 200; ciśnienie, 300. Zobacz tabelę materiałów). Igły komercyjne byłyby alternatywnym substytutem mikroiniekcji.</li>
		<li>Wstrzyknąć prawdopodobną objętość mieszaniny do cytoplazmy zygot z dobrze zaznaczonymi przedjądrzami w kropli pożywki HEPES-CZB zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B za pomocą mikroiniektora o stałych ustawieniach przepływu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) (patrz tabela materiałów)21. 
UWAGA: Każdą grupę zygot należy wstrzyknąć w ciągu 20-30 minut. Cytochalazyna B może zwiększyć żywotność mysiej zygoty po wstrzyknięciu. Alternatywnie, mikroiniekcja może być obsługiwana za pomocą systemu piezoelektrycznego, jak opisano wcześniej22.</li>
		<li>Hodowla wstrzykniętych zygot w pożywce KSOM w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 do stadium blastocysty po 3,5 dniu w celu obserwacji fluorescencji (ryc. 2B i 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer zarodków i rozmnażanie myszy
	<ol>
		<li>Kojarzenie samic myszy ICR z samcami myszy ICR poddanych wazektomii ICR w tym samym dniu co wstrzyknięcie.</li>
		<li>Hodowlę wstrzykniętych zygot do stadium 2-komórkowego w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i przeniesienie 25-30 zarodków dwukomórkowych do jajowodów kobiet ICR w ciąży rzekomej w ciągu 0,5 dnia po stosunku (dpc). Matki biorczyczki rodzą młode w temperaturze 19,5 dpc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotypowanie myszy
	<ol>
		<li>Ekstrakcję genomowego DNA myszy z próbek palców u nóg lub ogona za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zidentyfikuj połączenie 5' i 3' zdarzeń knock-in za pomocą 200-400 ng genomowego DNA mierzonego za pomocą spektrometrii UV/vis jako matrycy do przeprowadzenia amplifikacji PCR.
		<ol>
			<li>Aktywować polimerazę DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut i przeprowadzić PCR przez 38 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę (1 min/1 kb), z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 10 min. W przypadku skrzyżowania 5' użyj przedniego startera w górnej części HAL, z odwrotnym na fragmencie knock-in (p2A-mCherry). Jeśli chodzi o skrzyżowanie 3', użyj przedniego startera na fragmencie knock-in (p2A-mCherry), z odwrotnym na dole HAR (Tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść 6 μl produktu PCR na 1% żelu agarozowym w buforze 1×TAE i sprawdź oczekiwany rozmiar fragmentu. Następnie zweryfikuj je za pomocą sekwencjonowania DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Edycja genomu in vivo w hepatocytach oparta na HMEJ
<ol>
	<li>Umieść mysz odbiorczą C57BL/6J (8 tygodni) w urządzeniu krępującym i przełóż ogon przez szczelinę.</li>
	<li>Wymieszaj wektory donorowe HMEJ (30 μg) i wektory ekspresyjne spCas9 (30 μg) w 2 ml roztworu soli fizjologicznej. W eksperymencie kontrolnym zawiesić wektory dawcy HMEJ (30 μg) w 2 ml roztworu soli fizjologicznej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Wyczyść ogon myszy 70% etanolem. Włóż igłę do żyły ogonowej i wstrzyknij roztwór plazmidowego DNA w ciągu 5-7 sekund. Wyjmij igłę i odłącz mysz od urządzenia krępującego.</li>
	<li>Ofiarować myszy w znieczuleniu CO2 po 5-9 dniach po wstrzyknięciu. Perfuzję myszy przeszyderczo z 0,9% solą fizjologiczną, a następnie 4% paraformaldehydem za pomocą pompy perystaltycznej i utrwalić wątrobę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwodnić tkankę za pomocą 30% sacharozy przez noc, aż opadnie na dno tubki.</li>
	<li>W przypadku próbek wątroby należy podzielić zamrożoną tkankę na grubość 10 μm.</li>
	<li>Przepłukać skrawki trzykrotnie w 0,1 M buforowanym fosforanem (PB) i inkubować je z pierwszorzędowym przeciwciałem: króliczym anty-mCherry (rozcieńczonym w 5% NGS) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć skrawki trzykrotnie w PB, a następnie inkubować je z przeciwciałem drugorzędowym: Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Przeciwbarwij sekcje DAPI przez 20 minut i zamontuj gliceryną na szkiełkach w celu dalszej obserwacji fluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR%2FCas-Mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560(2014).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841(2015).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li>
<li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+ligation-gated+recombination+%28ObLiGaRe%29%3A+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li>
<li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li>
<li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li>
<li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology%3A+Transgenic+primate+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92(2017).</li>
<li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR%2FCas+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li>
<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszymi etapami budowy plazmidów dawcy HMEJ są: (1) wybór sgRNA o wysokiej wydajności cięcia DNA i małej odległości między miejscem cięcia sgRNA a kodonem stop oraz (2) prawidłowa budowa dawcy HMEJ. Rozszczepienie za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zarówno na wektorze dawcy transgenu (zawierającym miejsca docelowe sgRNA i ramiona homologii ~800 bp), jak i na docelowym genomie jest niezbędne do wydajnej i precyzyjnej ukierunkowanej integracji in vivo. Najbardziej krytycznymi etapami generowania myszy knock-in p...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Precyzyjna, ukierunkowana edycja genomu jest często wymagana do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych i terapii klinicznych. Wiele wysiłku włożono w opracowanie różnych strategii skutecznej ukierunkowanej edycji genomu, takich jak nukleaza palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) oraz systemy CRISPR/Cas9. Strategie te tworzą ukierunkowane pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) w genomie i wykorzystują wewnętrzne systemy naprawy DNA, takie jak rekombinacja homologiczna (HR)1,2, łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ)3,4,5 i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ)6,7,8, aby wywołać ukierunkowaną integrację transgenów1,9. Strategia oparta na HR jest obecnie najczęściej stosowanym podejściem do edycji genomu, które jest bardzo skuteczne w liniach komórkowych, ale nie jest łatwo dostępne dla komórek niedzielących się ze względu na ograniczone występowanie w późnej fazie S/G2. W związku z tym strategia oparta na HR nie ma zastosowania do edycji genomu in vivo. Niedawno opracowano strategię opartą na NHEJ w celu skutecznego wszczepienia genów w tkankach myszy8. Niemniej jednak metoda oparta na NHEJ zwykle wprowadza indele na skrzyżowaniach, co utrudnia generowanie precyzyjnej edycji genomu, zwłaszcza gdy próbuje się skonstruować geny fuzyjne w ramce8. Ukierunkowana integracja oparta na MMEJ jest zdolna do precyzyjnej edycji genomu. Jednak tylko nieznacznie zwiększa to docelową efektywność integracji w poprzednich raportach5. W związku z tym pilnie potrzebna jest poprawa efektywności precyzyjnej ukierunkowanej integracji in vivo dla szerokich zastosowań terapeutycznych3.
W niedawno opublikowanej pracy zademonstrowaliśmy strategię opartą na homologii i łączeniu końcowym (HMEJ), która wykazała najwyższą skuteczność ukierunkowanej integracji we wszystkich raportowanych strategiach, zarówno in vitro, jak i in vivo10. W tym miejscu opisujemy protokół ustanowienia systemu HMEJ, a także konstrukcję wektorów RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania oraz wektory dawcy zawierające miejsca docelowe sgRNA i ~800 pz ramion homologii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W tym protokole opisujemy również szczegółowe etapy generowania myszy knock-in DNA oraz krótkie kroki ukierunkowanej integracji w tkankach in vivo. Co więcej, badanie potwierdzające słuszność koncepcji strategii opartej na HMEJ wykazało jej zdolność do korygowania mutacji Fah i ratowania myszy z niewydolnością wątroby Fah-/-, co jeszcze bardziej ujawniło jej potencjał terapeutyczny.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>pAAV wektor</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>Wektor AAV do kodowania SpCas9 zoptymalizowanego pod kątem ludzkiego kodonu sterowanego przez promotor EF</td></tr><tr><td>AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>Addgene</td><td>97308</td><td>Dawca HMEJ za fuzję reportera p2A-mCherry z myszą Actb. EGFP napędzany przez promotor EF1a i sgRNA sterowany przez U6 ukierunkowany na Actb. Kręgosłup AAV.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 Dawca HMEJ</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>Dawca HMEJ za fuzję reportera p2A-mCherry z myszą Cdx2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Technologia życia</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia wodnego bez nukleaz</td><td></td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza I</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>&nbsp; Ściągacz do mikropipet (parametry: ciepło, 74; ciągnięcie, 60; prędkość, 80; czas/opóźnienie, 200; ciśnienie, 300)</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td> typ <td>kapilar (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm z filamentem)&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania</td><td>Leica</td><td>CM1950-Grubość kriostatu</td><td>&nbsp; z&nbsp; 40&nbsp; &mu; m&nbsp; dla&nbsp; mózg,&nbsp; 10 &mu; m&nbsp; dla&nbsp; wątroba</td></tr><tr><td>Królik anty-mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td> NEAA Gibco 11140050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen, Strep, Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Medycyna</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Medycyna</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA z D-glukozą i fenolem Czerwony</td><td>milipor</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium z Fenolem</td><td>Czerwony Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem crispr/cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Jako obiecująca platforma do edycji genomu, system CRISPR/Cas9 ma ogromny potencjał do efektywnej manipulacji genetycznej, szczególnie do ukierunkowanej integracji transgenów. Jednak ze względu na niską skuteczność rekombinacji homologicznej (HR) i różne mutacje indel strategii opartych na niehomologicznym łączeniu końców (NHEJ) w komórkach niedzielących się, edycja genomu in vivo pozostaje dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy oparty na homologii system łączenia końcówek (HMEJ) oparty na CRISPR/Cas9 do wydajnej, precyzyjnej, ukierunkowanej integracji in vivo. W tym systemie docelowy genom i wektor dawcy zawierający ramiona homologiczne (~ 800 pz) otoczone sekwencjami docelowymi z pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA) są rozszczepiane przez CRISPR/Cas9. Ta strategia oparta na HMEJ zapewnia efektywną integrację transgenów w zygotach myszy, a także w hepatocytach in vivo. Co więcej, strategia oparta na HMEJ oferuje skuteczne podejście do korekcji mutacji hydrolazy fumaryloacetooctanu (Fah) w hepatocytach i ratuje myszy z niewydolnością wątroby wywołaną niedoborem Fah. Podsumowując, koncentrując się na ukierunkowanej integracji, ta oparta na HMEJ strategia stanowi obiecujące narzędzie do różnych zastosowań, w tym generowania genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych i celowanych terapii genowych.

Edycja genomu w embrionach myszy z wykorzystaniem HMEJ: Aby określić wydajność nok-inu w metodzie opartej na HMEJ w zygotach myszy, wprowadzono mRNA Cas9 oraz sgRNA celujące w Cdx2 gen oraz donor HMEJ do zygot myszy, zaprojektowany w celu połączenia genu reporterowego p2A-mCherry z ostatnim kodonem Cdx2 gen (Rycina 2A). Wstrzyknięte zygoty rozwinęły się w kulturze do stadium blastocysty. Aby ocenić wydajność...

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Ogólnym celem tej strategii HMEJ jest dostarczenie obiecującego narzędzia genetycznego do różnych zastosowań, w tym do generowania genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych i celowanych terapii genowych. Ten HMEJ przeszedł środek. Może mieć również kluczowe pytania w dziedzinie genetycznej i neurologicznej.Na przykład, jak poprawić skuteczność precyzyjnej ukierunkowanej integracji transgenów in vivo. Główną zaletą tej strategii opartej na HMEJ jest możliwość korygowania mutacji genów z wysoką skutecznością in vivo. Który wynika z tego, ma potencjał terapeutyczny.Procedurę zademonstruje Xing Wang, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć protokół, zbierz 5000 komórek N2a, wcześniej transfekowanych wektorami ekspresyjnymi Cas9 sgRNA EGFP przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub FACS, używając komórek nietransfekowanych jako kontroli. Zebrane komórki trawić w 2 do 5 mikrolitrach buforu do lizy w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie podgrzej i aktywuj proteinazę K w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Amplifikować próbkę przez zagnieżdżony PCR przy użyciu protokołu producenta. Wymieszaj jeden mikrolitr produktu lizy z polimerazą DNA i parą zewnętrznych starterów, rozpoznając sekwencję wokół miejsca docelowego sgRNA i wykonaj pierwotny PCR w łącznej objętości 20 mikrolitrów.Następnie aktywuj polimerazę DNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut, a następnie wykonaj podstawowy PCR z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez 5 minut. Wykonaj wtórny PCR, używając jednego mikrolitra pierwotnego produktu PCR i pary zagnieżdżonych wewnętrznych starterów. Denaturacja i ponowne wyżarzanie 300-600 nanogramów oczyszczonego produktu PCR w 20 mikrolitrach 1x buforu reakcyjnego TC7EI.Dodaj jeden mikrolitr enzymu T7EI do wyżarzonych produktów PCR i traw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie uruchomić produkt wytrawiający na 2% żelu agarozowym i 1x buforze TAE o napięciu 120 woltów przez 40 minut, aż fragmenty zostaną oddzielone. Użyj ImageJ, aby określić intensywność pasm ciętego i nieprzeciętego DNA oraz obliczyć częstotliwość indel.W celu przygotowania mRNA Cas9 dodaj sekwencję promotora T7 do regionu kodującego Cas9 przez amplifikację PCR. Następnie dodaj starter Cas9 FR o końcowym stężeniu 0,1 mikromola i 20 nanogramów wektora eksprymującego Cas9 do 1x mieszanki polimerazy DNA o wysokiej wierności. Dostosuj końcową objętość do 50 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz.Aktywuj polimerazę DNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut i wykonaj PCR. Oczyść T7 Cas9 i produkt PCR do transkrypcji in vitro lub IVT. Następnie transkrybuj od 0,5 do 1 mikrograma DNA, używając zestawu do transkrypcji mRNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 8 godzin w całkowitej objętości 20 mikrolitrów.Dodaj 1 mikrolitr DNazy do mieszaniny, aby usunąć matrycę DNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po dodaniu ogona poli(A) przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odzyskaj mRNA Cas9 za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Wygeneruj matrycę sgRNA sterowaną przez promotor T7 z polimerazą DNA o wysokiej wierności, jak wykonano w poprzedniej sekcji, i wybierz rusztowanie sgRNA zawierające wektor jako matrycę.Po oczyszczeniu produktu T7 sgRNA PCR należy użyć 0,5 do 1 mikrograma DNA jako matrycy do transkrypcji sgRNA in vitro za pomocą krótkiego zestawu do transkrypcji RNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 6 godzin, w łącznej objętości 20 mikrolitrów. Po 6 godzinach inkubacji dodaj 1 mikrolitr DNazy do mieszaniny i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć matrycę DNA. Ponownie oczyść sgRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.Rozcieńczyć sgRNA do 500 nanogramów na mikrolitr w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy. Wysoka jakość mRNA i sgRNA Cas9 bez degeneracji oraz prawidłowa linia parametrów dawcy HMEJ to najważniejsze etapy w generowaniu myszy knock-in. Zapłodnione zarodki umieścić na pożywce KSOM w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Wymieszaj 100 nanogramów na mikrolitr mRNA Cas9, 50 nanogramów na mikrolitr sgRNA i 100 nanogramów na mikrolitr wektora dawcy HMEJ i dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 10 mikrolitrów. Odpipetuj mieszaninę w górę i w dół i umieść ją na lodzie. Następnie wyciągnij igły kapilarne za pomocą ściągacza do mikropipet.Wstrzyknąć prawdopodobną objętość mieszaniny do cytoplazmy zygot z dobrze zaznaczonymi przedjądrzami w kropli pożywki HEPES-CZB zawierającej 5 mikrogramów na mililitr cytochalazyny B za pomocą mikroiniektora o stałych ustawieniach przepływu. Na koniec hoduj wstrzyknięte zygoty w pożywce KSOM w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla do stadium blastocysty po 3 1/2 dniach w celu obserwacji fluorescencji. Po 3 dniach iniekcji 12,9% blastocyst otrzymujących dawców HMEJ było dodatnich na obecność mCherry, który był ściśle wyrażony w trofektodermie.Poprzez sekwencjonowanie myszy z dodatnim wynikiem PCR, wszystkie badane zdarzenia integracyjne były precyzyjnymi integracjami w ramce zarówno na 5 połączeniach głównych, jak i 3 pierwszych. Po 7 dniach od wstrzyknięć obrazy immunofluorescencyjne ujawniły, że prawie połowa transfekowanych hepatocytów wyrażała mCherry jako wybarwione na odcinkach wątroby. Po wycofaniu NTBC, immunohistochemiczne barwienie wątroby skorygowanych hepatocytów myszy Fah z ujemnym wynikiem Fah otrzymujących konstrukty Fah HMEJ i Cas9 wykazało bardziej skuteczną proliferację niż metoda oparta na MMEJ.Strategia oparta na HMEJ może być idealną platformą do zastąpienia zmutowanej sekwencji, takiej jak część mutacji, właściwą. Co nie ma zastosowania do metody opartej na HHEJ. Po tym eksperymencie terapia ta toruje drogę naukowcom w dziedzinę, w której precyzyjna integracja celów może badać szerokie zastosowania terapeutyczne.

crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy edycję genomu opartą na CRISPR-Cas9 w hodowanych komórkach, gdzie Cas9 i sgRNA są dostarczane jako pojedynczy konstrukt plazmidowy do komórek. System CRISPR-Cas9 i pożądany gen, który ma zostać wstawiony, został wprowadzony do komórek za pomocą techniki elektroporacji, aby ułatwić pomyślną edycję genów.

Kompleksowa edycja genomu CRISPR: metoda homologii sterowanej naprawą genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj strategię HMEJ do ukierunkowanej integracji DNA in vivo przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia wysokowydajne korygowanie mutacji genetycznych w organizmie żywym z potencjałem terapeutycznym.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii (Wideo) | JoVE Journal

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Przeglądaj więcej filmów