Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA jest scharakteryzowanie globalnego składu mikrobiomu, zaczynając od próbek kału. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące globalnego składu mikrobiologicznego związanego z wieloma obszarami zainteresowań, takimi jak metabolizm, trawienie oraz jelita i ogólnoustrojowe stany zapalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona spis społeczności drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych obecnych w próbce kału, w tym bakterii trudnych do hodowli.

Metoda ta może jednocześnie obsługiwać dużą liczbę próbek kału dzięki szybkiej linii pomp przetwarzających bez okrężnicy, co zaowocowało solidnym i powtarzalnym sekwencjonowaniem 16S rRNA-Amplicon. W tym protokole należy zamrożone próbki kału, które są mniej więcej wielkości gumki do ołówka. Próbki należy przechowywać w dwumililitrowych probówkach z odciętą końcówką wacika do pobierania próbek.

Obejmują kontrole ujemne składające się z wymazów bez kału i wewnętrznych duplikatów kontrolnych oraz duplikaty próbek z oryginalnego kału próbki, które służą jako kontrola wewnętrzna. Rozpocząć od rozmrożenia roztworów do ekstrakcji i rozcieńczania w temperaturze pokojowej wraz z próbkami kału i próbkami kontrolnymi. Po rozmrożeniu dodaj 250 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki z próbką i wymieszaj kał z roztworem za pomocą wiru.

W tym momencie należy wprowadzić kontrole ujemne oparte wyłącznie na buforze. Następnie podgrzewać próbki przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po inkubacji we wrzącej wodzie dodać 250 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego do każdej próbki i wymieszać próbki.

Następnie przechowuj probówki z próbkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia PCR. Skonfiguruj PCR na stacji roboczej przed PCR, która została oczyszczona z potencjalnych zanieczyszczeń DNA, takich jak matryce i amplikony. Oznacz startery zgodnie z ich kodem kreskowym i rozcieńcz je w wodzie podwójnie destylowanej do stężenia 50 mikromolów.

Przechowuj zapasy rozcieńczonego podkładu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i całkowicie je rozmrozić przed użyciem. Dla każdej próbki należy przygotować 96-dołkową płytkę do 32 reakcji w trzech powtórzeniach. Po podgrzaniu do temperatury pokojowej rozcieńczyć porcje startera do przodu i 32 starterów wstecznych do pięciu mikromolów dla PCR.

Następnie przygotuj wystarczającą ilość mieszanki bazowej PCR na 100 reakcji. Połącz 100 mikrolitrów pięciomikromolowego startera do przodu z jednym mililitrem mieszanki głównej 2X PCR i 400 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Wiruj tę mieszaninę, a następnie załaduj 15 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej z 96 studzienek.

Następnie załaduj zestawy trzech studzienek każdy jednym mikrolitrem pięciomikromolowego startera wstecznego. W ten sposób załaduj wszystkie 32 różne indeksy odwrotne do płyty. Następnie do każdej płytki dołka dodać cztery mikrolitry wyekstrahowanej próbki DNA.

Odbywa się to na czystej ławce. Teraz uruchom PCR z trzyminutową początkową denaturacją, a następnie 35 cyklami z jedną minutą denaturacji i klęczeniem w temperaturze 55 stopni Celsjusza i jedną minutą przedłużenia. Zakończ 10-minutowym końcowym przedłużeniem.

Po zakończeniu reakcji pracuj na dedykowanym stole warsztatowym po PCR. Tam połącz każdy zestaw potrójnych produktów PCR w jednej probówce, aby uzyskać 60 mikrolitrów na próbkę. Następnie uruchom cztery mikrolitry każdej próbki na bromku etydyny barwionym 1% żelem agarozowym.

Dodatnie amplikony pojawią się między 375 a 425 parami zasad. Kontrole ujemne są pokazane i przetworzone wraz z dodatnimi w badaniu amplikonami. Określić ilościowo stężenia DNA w produktach pozytywnej reakcji zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie połącz 500 nanogramów DNA z każdego z produktów w jedną probówkę. Zmieszaj tę mieszaninę, a następnie wylej 200 mikrolitrów na 1% żelu, jak poprzednio. Teraz wyekstrahuj prążki z żelu między 375 a 425 parami zasad.

Następnie przygotuj bibliotekę do sekwencjonowania. Zmierz stężenie za pomocą bardzo czułego dwuniciowego zestawu do wykrywania DNA zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie użyj bardzo czułego zestawu do separacji i analizy. Następnie rozcieńczyć bibliotekę do siedmiu pikomolarów i połączyć ją cztery do jednego z biblioteką kontrolną.

Teraz, gdy próbka jest gotowa do sekwencjonowania, przenieś ją do maszyny do sekwencjonowania. Opisaną metodę przygotowania biblioteki z próbek kału wykorzystano do analizy mikrobiomu hospitalizowanych pacjentów z podejrzeniem biegunki infekcyjnej. Równolegle próbki kału poddano tradycyjnemu hodowli w laboratorium mikrobiologicznym.

Próbki kału od zdrowych osób dorosłych zostały zsekwencjonowane w celu porównania. Uwzględniono kilka ujemnych próbek kontrolnych, PCR bez matrycy, PCR na czystych i sterylnych wacikach w roztworze do ekstrakcji i rozcieńczania oraz PCR na mieszanych roztworach do ekstrakcji i rozcieńczania. Każdy z nich miał mniej niż 118 odczytów, które dotyczyły głównie taksonów Mycoplasm.

Próbki standardowe średnio większe niż 10 000 odczytów bez identyfikacji Mycoplasma po kontroli jakości. Konsystencję i zmienność próbek mierzono przy użyciu 16 próbek kału przygotowanych z dwoma różnymi starterami z kodami kreskowymi, aby w ten sposób skonstruować dwie różne biblioteki z każdej próbki. Połowa próbek była dodatnia na obecność Campylobacter salmonella lub Shigella w tradycyjnej technice hodowli.

Korzystając z wyników sekwencjonowania 16S, wykres obszarowy na poziomie filologii pokazuje spójność między bibliotekami wykonanymi z tych samych próbek, niezależnie od tradycyjnych wyników hodowli. Z tej puli 16 sparowanych próbek analiza głównych współrzędnych wykazała, że pary próbek są ściśle wyrównane i że dodatnie próbki hodowli miały znacznie różną wartość PC1 od ujemnych próbek hodowli. Dalsza analiza próbek wykazała, że wysoki poziom Proteobacteria stwierdzono tylko u hospitalizowanych pacjentów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie przetwarzać dużą liczbę próbek kału za pomocą ekstrakcji DNA bez okrężnicy i PCR w celu wygenerowania bibliotek sekwencjonowania z kodami kreskowymi regionu zmiennej drobnoustrojów V4. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pracy w zorganizowanym i czystym środowisku, zwłaszcza podczas przygotowywania bibliotek. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkiego kału jest niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.