Name: Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA do charakterystyki mikrobiomu kałowego. Protokół umożliwia analizę dużej liczby próbek z identyfikacją bakterii tlenowych i beztlenowych, w tym trudnych do hodowli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez program I-CORE (granty nr 41/11), Izraelską Fundację Naukową (grant nr 908/15) oraz Europejską Organizację ds. Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (ECCO).

Etyczna zgoda na badanie została udzielona przez Lokalną Komisję Etyki Badań Sheba, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Protokół otrzymał wyjątek od zgody pacjenta od lokalnej Komisji ds. Oceny Etycznej, ponieważ materiał kałowy, który został użyty, został już przesłany do rdzenia mikrobiologicznego w ramach badań klinicznych i bez możliwych do zidentyfikowania informacji o pacjencie innych niż wiek, płeć i wyniki mikrobiologiczne. Uzyskano pisemną, świadomą zgodę od zdrowych ochotników, a Instytucjonalna Komisja Rewizyjna zatwierdziła badanie. Niektóre z tych próbek zostały już uwzględnione w poprzedniej analizie1.
1. Postępowanie z próbkami
<ol>
	<li>Pobrać rozmaz o wielkości około 5mm2 (mniej więcej wielkości gumki do ołówka) ze świeżej próbki kału za pomocą sterylnego wacika w probówce (patrz Tabela materiałów). Wszystkie waciki zawierające próbki kału należy przechowywać w temperaturze -80 °C w ciągu 24 godzin. Wymazy z kału mogą tam pozostać do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Rozmrozić roztwory do ekstrakcji i rozcieńczania w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieś wymazówkę kałową do pustej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów). Dostosuj rozmiar patyczka do wacika, przecinając go czystymi nożyczkami, aby umożliwić zamknięcie probówki przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym. Dodaj 250 μl roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki zbiorczej zawierającej wymaz kałowy i wymieszaj wirowo.</li>
	<li>Podgrzewać próbki przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej (95–100 °C). Dodać 250 μl roztworu rozcieńczającego do każdej próbki i wymieszać.</li>
	<li>Przechowywać probówki o pojemności 2 ml zawierające wyekstrahowane DNA i wacik w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. PCR i przygotowanie biblioteki
Dla kroków 3.1 i 3.2, pracuj na stacji roboczej PCR, która zapewnia czyste, wolne od szablonów i amplikonów środowisko.
<ol>
	<li>Oznacz startery (Tabela 1) zgodnie z ich kodem kreskowym. Rozcieńczyć każdy podkład w wodzie podwójnie destylowanej (DDW) do stężenia 50 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Do reakcji PCR należy używać płytki 96-dołkowej. Każda płytka może zawierać 32 różne próbki, które są oznaczone 32 różnymi starterami indeksującymi. Rozmrozić starter do przodu i 32 startery odwrotne w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć je do 5 μM.</li>
	<li>Przygotuj mieszaniny reakcyjne PCR na 100 reakcji (końcowa objętość w każdym dołku wyniesie 20 μl), mieszając 100 μl 5 μM startera Forward, 1 ml mieszanki 2X PCR Master i 400 μL DDW. Umieść 15 μl tej mieszanki PCR w każdym dołku (łącznie 96 dołków). Dodaj 1 μl każdego 5 μM odwróconego indeksowanego startera do 3 różnych dołków (32 różne startery w trzech egzemplarzach dają w sumie 96 dołków).</li>
	<li>W strefie dedykowanej do pre-PCR, czyli czystej ławce, która jest wolna od matryc i amplikonów, dodaj 4 μl każdej wyekstrahowanej próbki DNA do mieszanin reakcyjnych (każda wyekstrahowana próbka DNA jest amplifikowana w trzech egzemplarzach — 32 próbki na płytkę 96-dołkową).</li>
	<li>Uruchomić PCR z następującymi ustawieniami: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Na innej ławce, która zostanie zdefiniowana jako dedykowana strefa po PCR, połącz każdą potrójną reakcję PCR w jednej probówce objętościowej (60 μl na próbkę).</li>
	<li>Aby ocenić jakość amplikonów PCR, należy przeprowadzić 4 μl każdej połączonej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Przy długości fali UV 260 nm dodatnie amplikony pojawią się w oczekiwanym paśmie 375–425 pz. Tylko te amplikony zostaną uwzględnione w kolejnych krokach. 
	UWAGA: Każda próbka jest amplifikowana w trzech egzemplarzach, co oznacza, że każda próbka jest amplifikowana w 3 różnych reakcjach PCR. Nie skaluj w górę.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja i czyszczenie biblioteki
<ol>
	<li>Aby uzyskać pulę stężeń równomolowych wszystkich próbek PCR, należy określić ilościowo każdy amplikon za pomocą dwuniciowego DNA (odczynnik dsDNA kwantyfikuje) fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów), odpowiedniego do jednoczesnej kwantyfikacji dużej ilości próbek. 
	UWAGA: Ponieważ zakres rozmiarów amplikonu jest niejednoznaczny, rzeczywista ilość w nanogramach jest używana do obciążenia stężenia równomolowego.</li>
	<li>Połączyć 500 ng każdej próbki w jednej, sterylnej probówce. Wirować do mieszania.</li>
	<li>Uruchom 200 μl wspólnej biblioteki na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wyekstrahować pasma 375–425 pz z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów) i wymyć zbiorczą bibliotekę w 80 μl DDW. 
	UWAGA: Biblioteka w puli powinna mieć tak dobrany rozmiar, aby zredukować niespecyficzne produkty amplifikacji z DNA gospodarza.</li>
	<li>Zmierz końcowe stężenie w bibliotece za pomocą bardzo czułego zestawu do wykrywania dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Zmierz dokładny rozmiar biblioteki za pomocą bardzo czułego zestawu do separacji i analizy bibliotek DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Rozcieńczyć bibliotekę puli do godziny 7 pM z dodaniem 20% biblioteki kontrolnej (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem maszyny sekwencjonującej.</li>
	<li>Do sekwencjonowania należy używać specjalnie zaprojektowanych starterów do odczytu, które są komplementarne do starterów wzmacniających V4 (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Użyj trzeciego, specjalnie zaprojektowanego startera sekwencjonowania, który odczytuje kod kreskowy w dodatkowym cyklu (patrz tabela 1) i generuje odczyty sparowanych końców o długości 175 zasad w każdym kierunku, zgodnie ze specyfikacjami producenta.</li>
	<li>Uruchom maszynę sekwencjonującą i uzyskaj pliki FASTQ zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Zszyj ze sobą i przetwórz nakładające się na siebie sparowane pliki FASTQ w potoku selekcji danych zaimplementowanym w QIIME 2 w wersji 2017.7.017. Demultipleksuj odczyty zgodnie z kodami kreskowymi specyficznymi dla próbki.</li>
	<li>Użyj DADA218 do kontroli jakości i wykrywania wariantów sekwencji (SVs). Truncate odczytuje na 13 bazach od końca 3' i 15 bazach od końca 5', odrzucanie odczytuje z więcej niż 2 oczekiwanymi błędami. Zidentyfikuj i usuń chimery za pomocą metody konsensusu - chimery są wykrywane w próbkach pojedynczo, a sekwencje uznane za chimeryczne w wystarczającej części próbek są usuwane.</li>
	<li>Wykonaj klasyfikację taksonomiczną SVs przy użyciu naiwnego klasyfikatora dopasowanego Bayesa, wytrenowanego w bazie danych Greengenes 99% tożsamości z sierpnia 2013 r6, dla 175 długich odczytów i zestawu starterów do przodu/do tyłu.</li>
	<li>Rozrzedzić wszystkie próbki do głębokości 2 146 sekwencji.</li>
	<li>Użyj nieważonego UniFrac do pomiaru różnorodności β (między różnorodnością próby19,20) na rozrzedzonych próbkach, aby uniknąć wpływu wielkości próby.</li>
	<li>Wynikowa macierz odległości służy do przeprowadzenia analizy współrzędnych głównych (PCoA). 
	UWAGA: Skrypt przetwarzania danych i pliki mapowania są dostarczane jako materiał uzupełniający (Materiał uzupełniający 1 i 2).</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sekwencjonowanie 16S rRNA-amplicon i metagenomika zyskały popularność w zastosowaniach mikrobiologii klinicznej 21,22,23. Techniki te są korzystne ze względu na ich zwiększoną zdolność do wychwytywania taksonów nadających się do hodowli i niehodowlanych, dostarczając danych na temat względnej liczebności patogennego inokulum oraz ich zdolności do dokładniejszej identyfikacji wielodrobnoustrojowego zakaźnego odcisku palca<sup cla...

Podjęto skoncentrowane wysiłki, aby lepiej zrozumieć różnorodność i obfitość mikrobiomu, co jest kolejnym aspektem uchwycenia różnic i podobieństw między osobami w zdrowych i patologicznych warunkach. Wiek2,3, geografia4, lifestyle5,6, oraz choroba5 okazały się być związane ze składem mikrobiomu jelitowego, ale wiele schorzeń i populacji nie zostało jeszcze w pełni scharakteryzowanych. Ostatnio doniesiono, że mikrobiom może być modyfikowany do zastosowań terapeutycznych7,8,9. Dlatego dodatkowy wgląd w związek między różnymi warunkami fizjologicznymi a składem mikrobiologicznym jest pierwszym krokiem w kierunku optymalizacji potencjalnych przyszłych modyfikacji.
Tradycyjne metody hodowli mikrobiologicznej są ograniczone przez niskie plony10,11, i są konceptualizowane jako stan binarny, w którym bakteria jest albo obecna w jelitach, albo nie. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie oparte na DNA zrewolucjonizowało ekologię drobnoustrojów, umożliwiając schwytanie wszystkich członków społeczności mikrobiologicznej. Jednak długość i jakość odczytu sekwencji pozostają istotnymi barierami dla dokładnego przypisania taksonomii12. Co więcej, eksperymenty oparte na wysokiej przepustowości mogą ucierpieć z powodu efektów wsadowych, w których na pomiary mają wpływ zmienne niebiologiczne lub nienaukowe13. W ostatnich latach powstało kilka programów mających na celu badanie ludzkiego mikrobiomu, w tym American Gut project, United States (US) Human Microbiome Project i United Kingdom (UK) MetaHIT. Inicjatywy te wygenerowały ogromne ilości danych, które nie są łatwe do porównania ze względu na brak spójności w ich podejściu. Różne międzynarodowe projekty, takie jak Międzynarodowe Konsorcjum Mikrobiomu Człowieka, projekt Międzynarodowe Standardy Mikrobiomu Człowieka oraz Narodowy Instytut Standardów i Technologii (NIST) próbowały rozwiązać niektóre z tych problemów14 i opracowały standardy pomiarów mikrobiomu, które powinny umożliwić osiągnięcie wiarygodnych wyników reprodukcyjnych. Opisany tutaj jest zintegrowany protokół kilku szeroko stosowanych metod15,16 dla wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA (16S-seq), zaczynając od pobierania próbek kału poprzez analizy danych. Protokół opisuje podejście PCR bez kolumn, pierwotnie zaprojektowane do bezpośredniej ekstrakcji DNA roślinnego16, aby umożliwić jednoczesną obsługę dużej liczby próbek kału w stosunkowo krótkim czasie z wysokiej jakości amplifikowanym DNA do ukierunkowanego sekwencjonowania zmiennego mikrobiologicznego regionu V4 na wspólnej platformie sekwencjonowania. Protokół ten ma na celu poprowadzenie naukowców zainteresowanych zainicjowaniem stosowania sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA w solidny, reprodukcyjny, łatwy w użyciu i szczegółowy sposób, przy użyciu ważnych elementów kontrolnych. Posiadanie szczegółowego i szczegółowego protokołu krok po kroku może zminimalizować efekt wsadowy, a tym samym umożliwi bardziej porównywalne wyniki sekwencjonowania między laboratoriami.

<table><tbody><tr><td>Startery</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ekstrakcyjny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do rozcieńczania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do PCR Kapa HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Master mix</td></tr><tr><td>Quant-iT Zestaw odczynników PicoGreen dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA odczynnik do oznaczania ilościowego</td></tr><tr><td>MinElute Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda Bez dnazy i rnaz</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS</td><td>Sondy molekularne</td><td>Zestaw do wykrywania dsDNA</td><td>Q32854</td></tr><tr><td>Wysoka czułość D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Taśma sitowa 5067-5582</td><td>separacja i analiza</td></tr><tr><td>Test taśmy ekranowej</td><td>Odczynniki Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>do bibliotek DNA</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Biblioteka kontrolna Illumina</td><td>15017666</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (cykl 500)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL kolekcja probówki</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Probówki zbiorcze Safe Seal</td></tr><tr><td>Plastikowy wacik w patyczku w probówce PP</td><td>STERYLNE</td><td>WNĘTRZE 23117</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720 Termocykler</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do sekwencjonowania</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza PCR</td><td>Biosan</td><td></td> Nożyczki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do czyszczenia UV <tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16s rrna

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Mikrobiom jelitowy człowieka odgrywa kluczową rolę w ochronie komórek przed urazami, w przetwarzaniu energii i składników odżywczych oraz w promowaniu odporności. Odchylenia od tego, co uważa się za zdrowy skład mikrobioty (dysbioza), mogą upośledzać funkcje życiowe, prowadząc do stanów patologicznych. Ostatnie i trwające wysiłki badawcze są ukierunkowane na scharakteryzowanie powiązań między składem mikrobiologicznym a zdrowiem i chorobą człowieka.
Postępy w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości umożliwiają scharakteryzowanie składu mikrobiologicznego jelit. Metody te obejmują sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA i sekwencjonowanie typu shotgun. Sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA służy do profilowania składu taksonomicznego, podczas gdy sekwencjonowanie typu shotgun dostarcza dodatkowych informacji na temat przewidywań genów i adnotacji funkcjonalnej. Zaletą stosowania metody sekwencjonowania celowanego regionu zmiennego genu 16S rRNA jest jej znacznie niższy koszt w porównaniu z sekwencjonowaniem typu shotgun. Różnice w sekwencji w genie 16S rRNA są wykorzystywane jako mikrobiologiczny odcisk palca do identyfikacji i ilościowego określenia różnych taksonów w pojedynczej próbce.
Główne międzynarodowe wysiłki wprowadziły standardy sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Jednak kilka badań wskazuje na powszechne źródło zmienności spowodowanej efektem partii. Aby zminimalizować ten efekt, należy wdrożyć ujednolicone protokoły pobierania, przetwarzania i sekwencjonowania próbek. Protokół ten proponuje integrację szeroko stosowanych protokołów, począwszy od pobierania próbek kału po analizę danych. Protokół ten obejmuje bezkolumnowe, bezpośrednie podejście PCR, które umożliwia jednoczesną obsługę i ekstrakcję DNA dużej liczby próbek kału, wraz z amplifikacją PCR regionu V4. Ponadto protokół opisuje potok analizy i udostępnia skrypt korzystający z najnowszej wersji QIIME (QIIME 2 wersja 2017.7.0 i DADA2). Ten protokół krok po kroku ma na celu poprowadzenie osób zainteresowanych rozpoczęciem stosowania sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA w solidny, reprodukcyjny, łatwy w użyciu i szczegółowy sposób.

Schematyczny rysunek protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
Prospektywnie zebrano próbki kału od pacjentów hospitalizowanych z podejrzeniem infekcyjnej biegunki. Próbki te zostały przekazane do Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej w Sheba Medical Center między lutym a majem 2015 roku, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Próbki kału poddano równolegle konwencjonalnej hodowli mikr...

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA jest scharakteryzowanie globalnego składu mikrobiomu, zaczynając od próbek kału. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące globalnego składu mikrobiologicznego związanego z wieloma obszarami zainteresowań, takimi jak metabolizm, trawienie oraz jelita i ogólnoustrojowe stany zapalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona spis społeczności drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych obecnych w próbce kału, w tym bakterii trudnych do hodowli.Metoda ta może jednocześnie obsługiwać dużą liczbę próbek kału dzięki szybkiej linii pomp przetwarzających bez okrężnicy, co zaowocowało solidnym i powtarzalnym sekwencjonowaniem 16S rRNA-Amplicon. W tym protokole należy zamrożone próbki kału, które są mniej więcej wielkości gumki do ołówka. Próbki należy przechowywać w dwumililitrowych probówkach z odciętą końcówką wacika do pobierania próbek.Obejmują kontrole ujemne składające się z wymazów bez kału i wewnętrznych duplikatów kontrolnych oraz duplikaty próbek z oryginalnego kału próbki, które służą jako kontrola wewnętrzna. Rozpocząć od rozmrożenia roztworów do ekstrakcji i rozcieńczania w temperaturze pokojowej wraz z próbkami kału i próbkami kontrolnymi. Po rozmrożeniu dodaj 250 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki z próbką i wymieszaj kał z roztworem za pomocą wiru.W tym momencie należy wprowadzić kontrole ujemne oparte wyłącznie na buforze. Następnie podgrzewać próbki przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po inkubacji we wrzącej wodzie dodać 250 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego do każdej próbki i wymieszać próbki.Następnie przechowuj probówki z próbkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia PCR. Skonfiguruj PCR na stacji roboczej przed PCR, która została oczyszczona z potencjalnych zanieczyszczeń DNA, takich jak matryce i amplikony. Oznacz startery zgodnie z ich kodem kreskowym i rozcieńcz je w wodzie podwójnie destylowanej do stężenia 50 mikromolów.Przechowuj zapasy rozcieńczonego podkładu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i całkowicie je rozmrozić przed użyciem. Dla każdej próbki należy przygotować 96-dołkową płytkę do 32 reakcji w trzech powtórzeniach. Po podgrzaniu do temperatury pokojowej rozcieńczyć porcje startera do przodu i 32 starterów wstecznych do pięciu mikromolów dla PCR.Następnie przygotuj wystarczającą ilość mieszanki bazowej PCR na 100 reakcji. Połącz 100 mikrolitrów pięciomikromolowego startera do przodu z jednym mililitrem mieszanki głównej 2X PCR i 400 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Wiruj tę mieszaninę, a następnie załaduj 15 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej z 96 studzienek.Następnie załaduj zestawy trzech studzienek każdy jednym mikrolitrem pięciomikromolowego startera wstecznego. W ten sposób załaduj wszystkie 32 różne indeksy odwrotne do płyty. Następnie do każdej płytki dołka dodać cztery mikrolitry wyekstrahowanej próbki DNA.Odbywa się to na czystej ławce. Teraz uruchom PCR z trzyminutową początkową denaturacją, a następnie 35 cyklami z jedną minutą denaturacji i klęczeniem w temperaturze 55 stopni Celsjusza i jedną minutą przedłużenia. Zakończ 10-minutowym końcowym przedłużeniem.Po zakończeniu reakcji pracuj na dedykowanym stole warsztatowym po PCR. Tam połącz każdy zestaw potrójnych produktów PCR w jednej probówce, aby uzyskać 60 mikrolitrów na próbkę. Następnie uruchom cztery mikrolitry każdej próbki na bromku etydyny barwionym 1% żelem agarozowym.Dodatnie amplikony pojawią się między 375 a 425 parami zasad. Kontrole ujemne są pokazane i przetworzone wraz z dodatnimi w badaniu amplikonami. Określić ilościowo stężenia DNA w produktach pozytywnej reakcji zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie połącz 500 nanogramów DNA z każdego z produktów w jedną probówkę. Zmieszaj tę mieszaninę, a następnie wylej 200 mikrolitrów na 1% żelu, jak poprzednio. Teraz wyekstrahuj prążki z żelu między 375 a 425 parami zasad.Następnie przygotuj bibliotekę do sekwencjonowania. Zmierz stężenie za pomocą bardzo czułego dwuniciowego zestawu do wykrywania DNA zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie użyj bardzo czułego zestawu do separacji i analizy. Następnie rozcieńczyć bibliotekę do siedmiu pikomolarów i połączyć ją cztery do jednego z biblioteką kontrolną.Teraz, gdy próbka jest gotowa do sekwencjonowania, przenieś ją do maszyny do sekwencjonowania. Opisaną metodę przygotowania biblioteki z próbek kału wykorzystano do analizy mikrobiomu hospitalizowanych pacjentów z podejrzeniem biegunki infekcyjnej. Równolegle próbki kału poddano tradycyjnemu hodowli w laboratorium mikrobiologicznym.Próbki kału od zdrowych osób dorosłych zostały zsekwencjonowane w celu porównania. Uwzględniono kilka ujemnych próbek kontrolnych, PCR bez matrycy, PCR na czystych i sterylnych wacikach w roztworze do ekstrakcji i rozcieńczania oraz PCR na mieszanych roztworach do ekstrakcji i rozcieńczania. Każdy z nich miał mniej niż 118 odczytów, które dotyczyły głównie taksonów Mycoplasm.Próbki standardowe średnio większe niż 10 000 odczytów bez identyfikacji Mycoplasma po kontroli jakości. Konsystencję i zmienność próbek mierzono przy użyciu 16 próbek kału przygotowanych z dwoma różnymi starterami z kodami kreskowymi, aby w ten sposób skonstruować dwie różne biblioteki z każdej próbki. Połowa próbek była dodatnia na obecność Campylobacter salmonella lub Shigella w tradycyjnej technice hodowli.Korzystając z wyników sekwencjonowania 16S, wykres obszarowy na poziomie filologii pokazuje spójność między bibliotekami wykonanymi z tych samych próbek, niezależnie od tradycyjnych wyników hodowli. Z tej puli 16 sparowanych próbek analiza głównych współrzędnych wykazała, że pary próbek są ściśle wyrównane i że dodatnie próbki hodowli miały znacznie różną wartość PC1 od ujemnych próbek hodowli. Dalsza analiza próbek wykazała, że wysoki poziom Proteobacteria stwierdzono tylko u hospitalizowanych pacjentów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie przetwarzać dużą liczbę próbek kału za pomocą ekstrakcji DNA bez okrężnicy i PCR w celu wygenerowania bibliotek sekwencjonowania z kodami kreskowymi regionu zmiennej drobnoustrojów V4. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pracy w zorganizowanym i czystym środowisku, zwłaszcza podczas przygotowywania bibliotek. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkiego kału jest niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.

guided-protocol-for-fecal-microbial-characterization-16s-rrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje protokół izolacji DNA z próbek kału myszy z guzem jelita grubego. Wyekstrahowane DNA jest amplifikowane za pomocą PCR, a produkt jest dalej czyszczony przy użyciu podejścia opartego na kulkach magnetycznych. Metodę tę można wykorzystać do określenia wpływu wzbogacenia środowiska na mikrobiotę jelita grubego i śmiertelność zwierząt.

Izolacja DNA drobnoustrojów kału: badanie wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność mikrobiomu w mysim modelu guza

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być używane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów drobnoustrojów, pirosekwencjonowania amplikonów i analizy sekwencji DNA.

Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Poznaj metodę sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA do charakterystyki mikrobiomu kałowego. Protokół umożliwia analizę dużej liczby próbek z identyfikacją bakterii tlenowych i beztlenowych, w tym trudnych do hodowli.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Przeglądaj więcej filmów