Name: Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół Western blotting dla małej liczby komórek hematopoetycznych. Ta metoda umożliwia analizę zaledwie 500 komórek macierzystych, redukując liczbę zwierząt potrzebnych w badaniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant R01 CA149976 (N.A.S) z National Institutes of Health wsparł tę pracę.

Wszystkie procedury muszą być wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. Procedura została opracowana do analizy mysich krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych (HSC i HP), ale może być dostosowana do analizy innych populacji komórek.
1. Izolacja mysich HSC i HP metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pobieranie mysich komórek szpiku kostnego zgodnie z opisem w literaturze6. 
	UWAGA: W danych przedstawionych w Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2, szpik kostny został pobrany od myszy C57BL/6J.</li>
	<li>Wykonaj zubożenie linii komórek szpiku kostnego za pomocą zestawu do zmniejszania linii myszy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubuj komórki z przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki będącym przedmiotem zainteresowania, zgodnie z opisem7. W eksperymentach pokazanych na Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2, zastosowano przeciwciała przeciwko markerom Sca-1, Kit, Flt3 i linii (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 i Ter119.</li>
	<li>Sortuj 2 000 - 20 000 komórek Lin-Sca1+Kit+ Flt3- komórek (HSC) lub komórek Lin-Sca1-Kit+ (HPs) do 1,5 ml probówek Eppendorfa zawierających 0,1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS). 
	UWAGA: W przypadku danych pokazanych na Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2, komórki zostały posortowane za pomocą cytometru przepływowego z dyszą 70 μM. Maksymalna objętość kolekcji wynosi 1,4 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
UWAGA: Ten krok jest krytyczny. Próbkę należy przetworzyć bardzo ostrożnie. Podczas usuwania supernatantu należy bardzo uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
<ol>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające posortowane komórki w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut. Bardzo delikatnie usunąć całość z wyjątkiem około 100 μl supernatantu z osadu komórkowego za pomocą pipety i końcówki do pipety o pojemności 20 μl. Nie naruszaj pelletu.
	<ol>
		<li>Jeśli próbka zawiera mniej niż 5,000 komórek, a całkowita objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 0,2 ml, przed odwirowaniem należy najpierw przenieść komórki do probówek PCR o niskim poziomie wiązania 0,2 ml.</li>
		<li>Jeśli próbka zawiera mniej niż 5 000 komórek, a objętość jest większa niż 0,2 ml, należy odwirować komórki za pomocą wirówki w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut i usunąć wszystkie oprócz 200 μl supernatantu. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pozostałych 200 μl supernatantu, a następnie przenieść komórki do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i ponownie odwirować. Usuń wszystkie oprócz 20 - 30 μl z osadu po drugim wirowaniu i ponownie zawieś ogniwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić komórki w supernatancie pozostawionym w probówce. W razie potrzeby dodaj dodatkowy PBS w 2% FBS/PBS (można również użyć 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS lub samego PBS), aby uzyskać stężenie 5 x104 do 5 x 105 komórek/ml. 
	UWAGA: Użyj liczby komórek zebranych za pomocą cytometrii, aby oszacować objętość użytą do zawieszenia komórek.</li>
	<li>Użyj 2 - 5 μl ponownie zawieszonych komórek, aby określić dokładne stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (zgodnie z instrukcjami producenta) lub hemocytometru9.</li>
	<li>Przenieść objętość ponownie zawieszonych komórek zawierających żądaną liczbę komórek do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Na potrzeby eksperymentu w <silna klasa="xfig">Rysunek 1, przeniesiono 2 000, 1 000 lub 500 HSC lub HP. Pożądana liczba komórek zależy od siły sygnału uzyskanego przez Western blot i jest określana empirycznie. Wykonaj transfer za pomocą końcówki do pipety Eppendorf o pojemności 20 μl lub 100 μl.</li>
	<li>Odwirować komórki w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut.</li>
	<li>Aby wygenerować 100x roztwory podstawowe, rozpuść inhibitory proteasomu i fosfatazy w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotować 2 do próbek Laemmli, rozcieńczając 4 razy bufor do próbek Laemmli dostarczony przez producenta równoważną ilością wody destylowanej. Dodać odpowiednią ilość 100x zapasu inhibitorów proteasomów i fosfataz, aby uzyskać końcowe stężenie 2x inhibitorów w 2x buforze próbki Laemmli. 
	UWAGA: Bufor do próbek 2x Laemmli można wykonać z wyprzedzeniem, ale inhibitory proteasomu i fosfatazy należy dodać bezpośrednio przed dodaniem buforu próbki 2x Laemmli (plus inhibitory) do osadu komórkowego w celu lizy komórek, jak opisano w następnym kroku.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć część supernatantu z osadu komórkowego i do supernatantu pozostałego w probówce z osadem komórkowym dodać równą objętość 2x buforu próbki Laemmli oraz inhibitorów proteasomu i fosfatazy, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 komórek/μl w 1x buforze próbki Laemmli. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli przeniesiesz 2 000 komórek o łącznej objętości 20 μl do probówki w kroku 2.5, po odwirowaniu komórek (krok 2.6) powinieneś usunąć 18 μl supernatantu z osadu, a do pozostałych 2 μl supernatantu dodać równą objętość (2 μl) 2x buforu próbki Laemmli, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 komórek/μl w 1x Bufor do pobierania próbek Laemmli.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad, aby jak najszybciej wytworzyć lizat. W tym momencie próbki mogą być natychmiast elektroforezowane za pomocą żeli SDS-PAGE lub mogą być zatrzaskowo zamrożone w cieczyN2 i przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Elektroforeza
<ol>
	<li>Podgrzewać lizaty w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C lub we wrzącej wodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Elektroforeza 1 - 40 μL lizatów (zawierających od 500 do 20 000 odpowiedników komórek) przez żele SDS-PAGE przy napięciu 100 V przy użyciu standardowych protokołów10. 
	UWAGA: Objętość lizatu załadowanego do żelu zależy od liczby komórek potrzebnych do wygenerowania pożądanego sygnału i będzie zależeć od obfitości interesującego białka i jakości przeciwciała. Dane w <silnej klasy="xfig">Rysunek 1 uzyskano z 2 000, 1 000 i 500 odpowiedników komórek lizatu. Szerokość studni powinna mieścić się w zakresie od 3 mm do 1,5 mm. Zęby 1,5 mm można wyciąć z dostępnego w handlu grzebienia z szerszymi zębami za pomocą nożyczek.</li>
</ol>
4. Transfer i blokada
UWAGA: Wykonaj Western blot zgodnie ze standardowymi protokołami11. Kroki są pokrótce opisane tutaj:
<ol>
	<li>Membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) należy wstępnie potraktować metanolem przez 10 s, a następnie krótko umyć membranę wodą destylowaną.</li>
	<li>Przenieść białko z żelu SDS-PAGE do błony zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji dostarczonej przez producenta aparatu transferowego.</li>
	<li>Po przeniesieniu zablokuj błonę 2 ml 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBST (PBS z 0,1% Tween) przez noc w temperaturze 4 °C zgodnie ze standardowymi protokołami11.</li>
</ol>
5. Oznaczanie przeciwciał
<ol>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałami na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C, stosując rozcieńczenia przeciwciał zalecane przez dostawcę. 
	UWAGA: W Tabeli materiałów pokazane są przeciwciała, które zwalidowaliśmy dla HSC i HP oraz odpowiadające im rozcieńczenia przeciwciał. Wykonaj znakowanie przeciwciał przy użyciu standardowych procedur8.</li>
</ol>
6. Wykrywanie
<ol>
	<li>Umyj membranę 3 razy po 5 minut na każde pranie w PBST w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z 2 ml wzmocnionego buforu chemiluminescencyjnego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Sygnały można wykryć za pomocą systemu obrazowania zgodnego z instrukcjami producenta lub filmu autoradiograficznego i procesora filmu.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Western Blotting jest powszechną techniką wykrywania określonych białek i aktywacji szlaków sygnałowych w tkankach lub komórkach. Wprowadzając niewielkie poprawki do powszechnie stosowanej procedury, byliśmy w stanie rutynowo wykryć 15 różnych białek (Tabela Materiałów) w 15 000 HSC, a w niektórych przypadkach nawet w 500 HSC. Najbardziej krytycznymi krokami w tym protokole są: 1) dokładne zliczanie komórek, 2) minimalizacja liczby transferów między probówkami oraz 3) liza komórek bezpośrednio za pomocą ...

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to samoodnawiające się komórki, które mogą dać początek wszystkim liniom krwi. Są to stosunkowo rzadkie komórki w szpiku kostnym, co utrudnia analizy biochemiczne. Podejścia odpowiednie do analizy rzadkich komórek, takie jak cytometria przepływowa, okazały się niezwykle przydatne do ilościowego określania względnych ilości markerów powierzchniowych komórek i białek wewnątrzkomórkowych. Jednak analiza białek wewnątrzkomórkowych wymaga zastosowania procedur przenikania komórek, aby umożliwić dostęp przeciwciał, a nie wszystkie epitopy na powierzchni komórki przeżywają te procedury1,2. Ponadto przeciwciała, które rozróżniają różne izoformy białek lub produkty rozszczepienia, nie są często dostępne dla cytometrii przepływowej, dlatego badacze nadal polegają na Western blot w niektórych rodzajach analiz.
Analiza Western blot lizatów komórkowych jest rutynową procedurą w większości laboratoriów. Komórki mogą być oczyszczane w natywnych warunkach, które zachowują epitopy cząsteczek powierzchniowych komórek, a następnie lizaty komórkowe mogą być przygotowywane i analizowane. Jednak analiza białek w rzadkich pierwotnych populacjach komórek za pomocą Western blot może wymagać eutanazji dużej liczby zwierząt w celu uzyskania wystarczającej liczby komórek. Dokonując niewielkich korekt w kilku etapach, konwencjonalny protokół Western blotting był w stanie wykryć białka w stosunkowo niewielkiej liczbie HSC (500 - 15 000, w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania). Regulacje obejmują dokładne zliczanie komórek, ostrożne obchodzenie się z osadem komórkowym, zmniejszanie transferów komórek między probówkami w celu zminimalizowania utraty komórek oraz lizę określonej liczby komórek za pomocą skoncentrowanego buforu ładującego zawierającego inhibitory proteasomu i fosfatazy. Wiele opublikowanych raportów zawiera Western blot uzyskane z 20 000 lub więcej HSCs3,4,5,6,7; Ta prosta procedura zmniejszy liczbę komórek i zwierząt doświadczalnych potrzebnych do uzyskania równoważnych danych od 4 do 40 razy. Protokół ma na celu normalizację wyników na podstawie każdej komórki, a nie kontroli wewnętrznej. Umożliwia to wykrycie ogólnych spadków poziomu białka, które można przeoczyć, jeśli dane są znormalizowane do kontroli wewnętrznej. Znaczenie normalizacji na podstawie komórki zostało opisane w analizie danych dotyczących ekspresji genów8, a ta sama zasada dotyczy ilościowego oznaczania białek za pomocą Western blot. Ten zoptymalizowany protokół powinien być przydatny dla każdego, kto musi analizować niewielką liczbę komórek.

<table><tbody><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl pH8,8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,0 M Tris-HCl pH 6,8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS PAGE</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>MINI-PROTEAN 3 grzebień</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td> System transferu <td>SDS-Page</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>transfer</td></tr><tr><td>Zasilacz PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>elektroforeza</td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>detekcja sygnału</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Bufor</td> do <td>elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Zestaw transferowy dla 40 osób bloty</td><td>Transfer 1704272 Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy Przygotowanie</td><td>próbki</td><td>11697498001 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Koktajle inhibitorów fosfatazy Złota</td><td>biotechnologia</td><td>GB-450-1</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 2469</td><td>WB, zwalidowane w 1000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): Ryc. 2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 4858</td><td>WB, zwalidowane na 1000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): Fig2</td></tr><tr><td>aktyna (sprzężona z HRP)</td> <td>abcam</td><td>ab49900</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane w 500 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 5000 odniesienie (rysunek): Rys. 1, Rys. 2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane na 15000 komórek stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 5)</td></tr> <tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td> WB przeciwciało<td>, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc.</td></tr> 4<tr><td>) Przeciwciało EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)</td></tr> <tr><td>p-4EBP1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 2855</td><td>WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)</td></tr> <tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>TSC2</td> Przeciwciało <td>4308</td><td>WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)</td></tr> <tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>HSP90</td><td>Przeciwciało 4877</td><td>WB, zwalidowane na 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 5)</td></tr> <tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>PTEN</td><td>Przeciwciało 9188</td><td>WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1</td></tr>) <tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>mTOR</td><td>2983</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane na 15000 komórek stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1</td></tr>) <tr><td>p-mTOR</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5536</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1</td></tr>) <tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach Stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (FigS1)</td></tr> <tr><td>p-AMPKa</td><td>Przeciwciało sygnalizujące komórki</td><td>2535</td><td>WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1: 1000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. S1)</td></tr> <tr><td>aktyna</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach stężenie przeciwciał: 1:3000 odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)</td></tr> <tr><td>zestaw do zubożenia linii (mysz)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td> oczyszczanie <td>hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych</td></tr><tr><td>kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>oczyszczanie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>stymulacja fosforylacji</td></tr><tr><td>APC-Cy7 przeciwciało c-kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>anty-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>anty-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>anty-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>anty-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>anty-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>sortowanie komórek</td></tr><tr><td>Płytki dystansowe ze zintegrowanym 1,0 mm Przekładki</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td> surowica <td>blokująca błonę</td></tr><tr><td></td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>średni suplement</td></tr><tr><td>licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td> hemocytometr <td>zliczający komórki</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td>zliczanie komórek</td></tr><tr><td>flim</td><td>Detekcja sygnału</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td></tr> procesor <tr><td>filmów medycznych</td><td>Detekcja sygnału</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto Maksymalna czułość Podłoże</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>Detekcja sygnału</td></tr><tr><td>Allegra X-15R (Rotor SX4750A)</td><td>Próbka Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td> przygotowanie</td></tr><tr><td>BLUEstain drabinka białkowa</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>sorter komórek do elektroforezy</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>elektroforeza</td></tr></tbody></table>

protokół western blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są rzadkimi komórkami, a szpik kostny myszy zawiera tylko ~25 000 fenotypowych długoterminowych komórek macierzystych (HSC). Protokół Western blotting został zoptymalizowany i nadaje się do analizy niewielkiej liczby HSC (500 - 15 000 komórek). Fenotypowe HSC oczyszczono, dokładnie zliczono i poddano bezpośredniej lizie w buforze próbki Laemmli. Lizaty zawierające równą liczbę komórek analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a blot przygotowano i przetworzono zgodnie ze standardowymi protokołami Western blot. Korzystając z tego protokołu, można rutynowo analizować od 2 000 do 5 000 komórek HSC, a w niektórych przypadkach dane można uzyskać z zaledwie 500 komórek, w porównaniu do 20 000 do 40 000 komórek podawanych w większości publikacji. Protokół ten powinien być ogólnie stosowany do innych komórek krwiotwórczych i umożliwia rutynową analizę niewielkiej liczby komórek przy użyciu standardowych procedur laboratoryjnych.

Reprezentatywne wyniki uzyskane z 500 - 2 000 oczyszczonych HSC i HP przedstawiono na Ryc. 1 oraz Ryc. 2. Sygnał β-aktyny na Ryc. 1 można wykryć już przy 500 HSC i HP oczyszczonych z szpiku kostnego jednej myszy. Należy zauważyć, że nałożenie lizatów do dołków o średnicy 1,5 mm spowodowało znacznie silniejszy sygnał z 500 HP niż nałożenie ich do dołków o średnicy 3,0 mm. Ryc. 2</...

Standardowy protokół Western blotting został zoptymalizowany do analizy zaledwie 500 hematopoetycznych komórek macierzystych lub progenitorowych. Optymalizacja polega na ostrożnym obchodzeniu się z próbką komórki, ograniczaniu transferów między probówkami i bezpośredniej lizie komórek w buforze próbki Laemmli.

Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Nadrzędnym celem tego protokołu western blot jest wykonanie western blot na małej liczbie komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoetycznych komórek macierzystych, takie jak obecność lub obfitość określonych białek lub aktywacja szlaków sygnałowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga mniej niż 20 000 komórek, dlatego do analizy rzadkich populacji komórek pierwotnych potrzeba mniej zwierząt.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć sposoby na zmniejszenie liczby myszy, które musieliśmy wykorzystać do analiz hematopoetycznych komórek macierzystych. Procedurę zademonstruje Xiongwei Cai, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Użyj wahadłowego wirnika kubełkowego, aby odwirować 1,5-mililitrowe probówki zawierające posortowane hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Po zakończeniu wirowania wyrzuć wszystkie oprócz 100 mikrolitrów supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego. Jeśli jest mniej niż 5 000 komórek, a objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 0,2 mililitra, najpierw przenieś komórki do probówek PCR o niskim stopniu wiązania 0,2 mililitra przed odwirowaniem. Jeśli jednak jest mniej niż 5 000 komórek, ale objętość posortowanej próbki jest większa niż 0,2 mililitra, należy odwirować komórki pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu wyrzucić wszystkie oprócz 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie ponownie zawiesić osad i pozostałe 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 0,2 mililitrowych probówek PCR i ponownie odwiruj.Następnie ponownie zawiesić osad w 20 do 30 mikrolitrach supernatantu i wyrzucić resztę. Jeśli to konieczne, dodać buforowaną fosforanami sól fizjologiczną do 2% płodowej surowicy bydlęcej lub 2% albuminy surowicy bydlęcej do ponownie zawieszonych komórek. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby określić stężenie komórkowe za pomocą dwóch do pięciu mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek.Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 20 lub 100 mikrolitrów, aby przenieść objętość 500, 1 000 i 2 000 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Użyj wahliwego wirnika kubełkowego, aby odwirować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby rozpuścić inhibitor fosfatazy i proteasomu oraz DMSO, aby przygotować 100-krotny roztwór podstawowy.Następnie rozcieńczyć czterokrotny bufor do próbek Laemmliego równoważnymi objętościami wody destylowanej, aby uzyskać dwukrotny bufor do próbek Laemmli. Następnie dodać odpowiednie ilości 100-krotnego roztworu podstawowego fosfatazy i inhibitora proteasomu, aby dostosować końcowe stężenie do dwukrotnego buforu próbki Laemmliego i dwukrotnego buforu próbki Laemmli. Dostosuj objętość resztkowego supernatantu w probówce tak, aby dodanie równych objętości dwukrotnego buforu Laemmli wraz z inhibitorem fosfatazy i proteasomu dało końcowe stężenie 500 komórek na mikrolitr i jednokrotny bufor Laemmli.A następnie ponownie zawiesić, aby utworzyć lizat. Przed załadowaniem żelu podgrzej próbkę lizatów w temperaturze 95 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez pięć minut. Korzystając ze standardowych protokołów, elektroforeza od jednego do 40 mikrolitrów lizatu, co odpowiada 500 do 20 000 komórek przez stronę SDS przy napięciu 100 woltów.Po potraktowaniu membrany z poliwinylidenu metanolem przez kilka sekund, krótko umyj membranę wodą destylowaną. Następnie przenieś białko z żelu na błonę zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta aparatu transferowego. Po przeniesieniu zablokuj błonę dwoma mililitrami 2% albuminy surowicy bydlęcej i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami 0,1% Tween przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza zgodnie ze standardowymi protokołami.Po zablokowaniu błony inkubuj ją z rozcieńczonymi przeciwciałami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj membranę trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z dodatkiem 0,1% Tween 20 przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować membranę z dwoma mililitrami wzmocnionego buforu chemiluminescencyjnego przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Wykrywaj sygnały za pomocą systemu obrazowania. Aby porównać sygnały beta aktyny, przygotowano lizaty z moczu, krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych i poddano analizie wykresu zachodniego. Z amino blot jasno wynika, że następuje spadek sygnału beta aktyny z lizatów przygotowanych z 2 000 do 500 hematopoetycznych komórek progenitorowych i macierzystych załadowanych do 1,5 milimetrowych studzienek na 12% żelu stronicowym SDS.Ponadto, aby porównać sygnały beta aktyny uzyskane z różnych rozmiarów studni rzucanych na żel. Lizaty załadowano do studzienek o średnicy 1,5 i 3 milimetrów na żel, a następnie poddano analizie western blot. Blot pokazuje, że sygnał beta aktyny uzyskany z lizatu przygotowanego z 500 hematopoetycznych komórek progenitorowych załadowanych do studzienki o średnicy 1,5 milimetra jest znacznie silniejszy niż po załadowaniu do studzienki o średnicy trzech milimetrów.Następnie, aby porównać sygnały dla eukariotycznego czynnika inicjacji 4G, aktyny i fosforylacji białka rybosomalnego S6 w odpowiedzi na stymulację czynnika cytokin komórek macierzystych, uzyskane lizaty analizowano za pomocą amino blot. Blot wskazuje na obecność silniejszych intensywności sygnału dla wszystkich trzech białek w genitorach krwiotwórczych ze stymulacją czynnika cytokinowych komórek macierzystych. W porównaniu z kontrolą in vitro jasne jest również, że istnieje i rośnie intensywność sygnału dla wszystkich trzech białek z różnych objętości krwiotwórczych komórek macierzystych.Po opanowaniu tego technicznie można to zrobić w ciągu 48 godzin. Jeśli podejdzie się do niego prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym zliczeniu komórek i skierowaniu komórek lizatu za pomocą bufora ładującego.Po tym rozwoju jest technicznie granulowany dla naukowców zajmujących się badaniami nad komórkami macierzystymi w celu zbadania szlaków sygnałowych w niewielkiej liczbie komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać zachodnie kreślenie za pomocą niewielkiej liczby elementów adresowych. Uważaj na regiony, których używasz na stronie SDS.Dziękuję za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Wzorce mutacji somatycznych w komórkach odzwierciedlają wcześniejszą ekspozycję mutagenną i mogą ujawnić pokrewieństwo linii rozwojowej. Przedstawiono metodologię katalogowania i analizy mutacji somatycznych w poszczególnych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych.

Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj zoptymalizowany protokół Western blotting dla małej liczby komórek hematopoetycznych. Ta metoda umożliwia analizę zaledwie 500 komórek macierzystych, redukując liczbę zwierząt potrzebnych w badaniach.

Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów