Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

Nadrzędnym celem tego protokołu western blot jest wykonanie western blot na małej liczbie komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoetycznych komórek macierzystych, takie jak obecność lub obfitość określonych białek lub aktywacja szlaków sygnałowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga mniej niż 20 000 komórek, dlatego do analizy rzadkich populacji komórek pierwotnych potrzeba mniej zwierząt.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy znaleźć sposoby na zmniejszenie liczby myszy, które musieliśmy wykorzystać do analiz hematopoetycznych komórek macierzystych. Procedurę zademonstruje Xiongwei Cai, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Użyj wahadłowego wirnika kubełkowego, aby odwirować 1,5-mililitrowe probówki zawierające posortowane hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania wyrzuć wszystkie oprócz 100 mikrolitrów supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego. Jeśli jest mniej niż 5 000 komórek, a objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 0,2 mililitra, najpierw przenieś komórki do probówek PCR o niskim stopniu wiązania 0,2 mililitra przed odwirowaniem. Jeśli jednak jest mniej niż 5 000 komórek, ale objętość posortowanej próbki jest większa niż 0,2 mililitra, należy odwirować komórki pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu wyrzucić wszystkie oprócz 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie ponownie zawiesić osad i pozostałe 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 0,2 mililitrowych probówek PCR i ponownie odwiruj.

Następnie ponownie zawiesić osad w 20 do 30 mikrolitrach supernatantu i wyrzucić resztę. Jeśli to konieczne, dodać buforowaną fosforanami sól fizjologiczną do 2% płodowej surowicy bydlęcej lub 2% albuminy surowicy bydlęcej do ponownie zawieszonych komórek. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby określić stężenie komórkowe za pomocą dwóch do pięciu mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek.

Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 20 lub 100 mikrolitrów, aby przenieść objętość 500, 1 000 i 2 000 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Użyj wahliwego wirnika kubełkowego, aby odwirować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby rozpuścić inhibitor fosfatazy i proteasomu oraz DMSO, aby przygotować 100-krotny roztwór podstawowy.

Następnie rozcieńczyć czterokrotny bufor do próbek Laemmliego równoważnymi objętościami wody destylowanej, aby uzyskać dwukrotny bufor do próbek Laemmli. Następnie dodać odpowiednie ilości 100-krotnego roztworu podstawowego fosfatazy i inhibitora proteasomu, aby dostosować końcowe stężenie do dwukrotnego buforu próbki Laemmliego i dwukrotnego buforu próbki Laemmli. Dostosuj objętość resztkowego supernatantu w probówce tak, aby dodanie równych objętości dwukrotnego buforu Laemmli wraz z inhibitorem fosfatazy i proteasomu dało końcowe stężenie 500 komórek na mikrolitr i jednokrotny bufor Laemmli.

A następnie ponownie zawiesić, aby utworzyć lizat. Przed załadowaniem żelu podgrzej próbkę lizatów w temperaturze 95 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez pięć minut. Korzystając ze standardowych protokołów, elektroforeza od jednego do 40 mikrolitrów lizatu, co odpowiada 500 do 20 000 komórek przez stronę SDS przy napięciu 100 woltów.

Po potraktowaniu membrany z poliwinylidenu metanolem przez kilka sekund, krótko umyj membranę wodą destylowaną. Następnie przenieś białko z żelu na błonę zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta aparatu transferowego. Po przeniesieniu zablokuj błonę dwoma mililitrami 2% albuminy surowicy bydlęcej i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami 0,1% Tween przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza zgodnie ze standardowymi protokołami.

Po zablokowaniu błony inkubuj ją z rozcieńczonymi przeciwciałami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj membranę trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z dodatkiem 0,1% Tween 20 przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować membranę z dwoma mililitrami wzmocnionego buforu chemiluminescencyjnego przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Wykrywaj sygnały za pomocą systemu obrazowania. Aby porównać sygnały beta aktyny, przygotowano lizaty z moczu, krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych i poddano analizie wykresu zachodniego. Z amino blot jasno wynika, że następuje spadek sygnału beta aktyny z lizatów przygotowanych z 2 000 do 500 hematopoetycznych komórek progenitorowych i macierzystych załadowanych do 1,5 milimetrowych studzienek na 12% żelu stronicowym SDS.

Ponadto, aby porównać sygnały beta aktyny uzyskane z różnych rozmiarów studni rzucanych na żel. Lizaty załadowano do studzienek o średnicy 1,5 i 3 milimetrów na żel, a następnie poddano analizie western blot. Blot pokazuje, że sygnał beta aktyny uzyskany z lizatu przygotowanego z 500 hematopoetycznych komórek progenitorowych załadowanych do studzienki o średnicy 1,5 milimetra jest znacznie silniejszy niż po załadowaniu do studzienki o średnicy trzech milimetrów.

Następnie, aby porównać sygnały dla eukariotycznego czynnika inicjacji 4G, aktyny i fosforylacji białka rybosomalnego S6 w odpowiedzi na stymulację czynnika cytokin komórek macierzystych, uzyskane lizaty analizowano za pomocą amino blot. Blot wskazuje na obecność silniejszych intensywności sygnału dla wszystkich trzech białek w genitorach krwiotwórczych ze stymulacją czynnika cytokinowych komórek macierzystych. W porównaniu z kontrolą in vitro jasne jest również, że istnieje i rośnie intensywność sygnału dla wszystkich trzech białek z różnych objętości krwiotwórczych komórek macierzystych.

Po opanowaniu tego technicznie można to zrobić w ciągu 48 godzin. Jeśli podejdzie się do niego prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym zliczeniu komórek i skierowaniu komórek lizatu za pomocą bufora ładującego.

Po tym rozwoju jest technicznie granulowany dla naukowców zajmujących się badaniami nad komórkami macierzystymi w celu zbadania szlaków sygnałowych w niewielkiej liczbie komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać zachodnie kreślenie za pomocą niewielkiej liczby elementów adresowych. Uważaj na regiony, których używasz na stronie SDS.

Dziękuję za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.