Name: Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę CiDER do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej w komórkach ssaków. Technika umożliwia czasową kontrolę modyfikacji epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od grantu National Institutes of Health (R01GM112003 dla YZ), Fundacji Welch (BE-1913 dla YZ), American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE dla YZ), Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR140053 dla YH, RP170660 dla YZ), American Heart Association (16IRG27250155 dla YH) oraz John S. Dunn Foundation Collaborative Research Award Program.

1. Hodowla komórkowa, transfekcja plazmidu i indukcja chemiczna
<ol>
	<li>Hodowla przylegającej linii komórkowej (np. ludzkiej embrionalnej komórki nerki HEK293T) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Transfekcja komórek plazmidem CiDER.
	<ol>
		<li>Co najmniej 18 godzin przed transfekcją wysiać 0,3 x 106 komórek w 2,5 ml odpowiedniego DMEM na studzienkę na 6-dołkowej płytce i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc, aby osiągnąć 60-80% zlewności.</li>
		<li>Przed użyciem podgrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Umieścić 250 μl podłoża bez surowicy w sterylnej probówce. 
		UWAGA: Ta ilość jest dostosowana do płytki 6-dołkowej z 80% konfluencją. W razie potrzeby proporcjonalnie dostosuj ilości podłoża zgodnie z rozmiarami płytek lub numerami komórek.</li>
		<li>Dodać 2,5 μg plazmidu kodującego CiDER18 lub domenę katalityczną TET2 (TET2CD jako kontrola pozytywna)12,13 do podłoża bez surowicy i delikatnie wymieszać pipetując.</li>
		<li>Dodać 7,5 μl odczynnika do transfekcji do rozcieńczonej mieszaniny DNA i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.</li>
		<li>Zmień wstępnie podgrzane podłoże i dodaj mieszaninę kroplami do studzienek, a następnie delikatnie potrząśnij płytką do hodowli komórkowej, aby równomiernie rozprowadzić odczynnik do transfekcji i mieszaninę DNA.</li>
		<li>Inkubować komórki i mieszaninę przez noc, a następnie zastąpić odczynnik do transfekcji zawierający pożywkę 2 ml świeżego kompletnego DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja chemiczna
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 2 mM surowej rapamycyny (rozpuszczonej w DMSO) do stężenia 20 μM w odpowiednim kompletnym podłożu.</li>
		<li>Dodać 20 μl rozcieńczonej rapamycyny do transfekowanych komórek utrzymywanych w pożywce o pojemności 2 ml, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 nM. 
		UWAGA: Po inkubacji przez 48 godzin, komórki są gotowe do oznaczania ilościowego wytwarzania 5hmC lub innych dalszych zastosowań. W razie potrzeby wydajność indukcji można monitorować, wyjmując ogniwa co 3 godziny w celu dalszej kwantyfikacji 5hmC, jak opisano poniżej i pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1.</li>
		<li>Aby uzyskać lepszą ocenę ilościową wydajności indukcji 5hmC, należy wysiewać oddzielne dołki w celu monitorowania komórek co 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja produkcji 5hmC indukowanej przez rapamycynę za pomocą barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne 5hmC 
	UWAGA: Dodać wystarczającą ilość roztworu utrwalającego, składającego się z 4% paraformaldehydu, 0,2% środka powierzchniowo czynnego (takiego jak Triton X-100) w PBS z 3 N HCl, aby pokryć wszystkie komórki na płytce. Na przykład 500 μl roztworu wystarczyłoby na studzienkę w płytce 6-dołkowej. Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Aby naprawić komórki, dodaj 4% paraformaldehydu w PBS do komórek potraktowanych rapamycyną przez 15 minut w temperaturze otoczenia. W grupie kontrolnej należy użyć komórek wykazujących ekspresję mCherry-CiDER bez leczenia rapamycyną. Nie mieszać. 
		Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić odpowiednią ochronę.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór utrwalający. Inkubować utrwalone komórki z 0,2% środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez 30 minut, aby przeniknąć błonę komórkową.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór przepuszczalny. Dodaj 3 N HCl do permeabilizowanych komórek i inkubuj przez 15 minut, aby zdenaturować DNA.</li>
		<li>Odrzuć HCl. Dodaj 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0) do komórek na 10 minut w celu neutralizacji pH.</li>
		<li>Wyrzuć cały roztwór. Dokładnie umyj komórki PBS 3-5 razy. Dokładnie usuń PBS. 
		UWAGA: Dodaj wystarczającą ilość PBS na każdy etap prania. Na przykład 1 ml PBS wystarczy na płytkę 6-dołkową.</li>
		<li>Blokuj komórki, dodając bufor blokujący składający się z 1% BSA i 0,05% środka powierzchniowo czynnego (takiego jak Tween 20) w PBS przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór blokujący. Dodać rozcieńczone przeciwciało 5hmC (1:200) do komórek i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj komórki PBS trzy razy przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (FITC) (1:200) do komórek i inkubować przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie intensywnie PBS, aby usunąć resztki przeciwciał.</li>
		<li>Dodać 250 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wybarwić jądro przez 5 minut. Usunąć roztwór barwiący.</li>
		<li>Zamontuj szkiełko lub naczynie hodowlane ze szklanym dnem z komórkami wybarwionymi immunologicznie do obrazowania konfokalnego. Reprezentatywny wynik został pokazany w Rysunek 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa 
	UWAGA: Użyj 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej do następującej procedury barwienia. Zwykle na każdą studzienkę wystarcza 150 μl odczynników.
	<ol>
		<li>Zawiesić transfekowane i indukowane rapamycyną komórki w buforze FACS (PBS z 1% BSA, 2 mM EDTA). W grupie kontrolnej należy użyć komórek wykazujących ekspresję CiDER bez leczenia rapamycyną.</li>
		<li>Napraw i przepuszczalność komórek zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
		<li>Dodaj 2 N HCl do komórek, aby zdenaturować DNA przez 10 minut.</li>
		<li>Odrzuć HCl. Zneutralizuj i zablokuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
		<li>Dodać rozcieńczone przeciwciało anty-5hmC (1:200) do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie buforem FACS. Dokładnie usuń bufor FACS.</li>
		<li>Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (FITC) (1:400) do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie buforem FACS.</li>
		<li>Próbki są gotowe do analizy FACS. Reprezentatywny wynik został pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test punktowy do ilościowego oznaczania ilości 5hmC i 5-metylocytozyny (5mC)
<ol>
	<li>Wyizoluj genomowe DNA z komórek transfekowanych i indukowanych rapamycyną za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. W grupie kontrolnej należy użyć komórek transfekowanych CiDER bez leczenia rapamycyną.</li>
	<li>Podgrzać piec próżniowy do temperatury 80 °C i wstępnie namoczyć membranę nitrocelulozową w podwójnie destylowanymH2O, a następnie w 6-krotnym buforze soli fizjologicznej i cytrynianu sodu (SSC) przez 10 minut.</li>
	<li>Załaduj 60 μl równych ilości DNA (łącznie 2 μg w buforze TE) na 96-dołkową płytkę PCR. Dodać 30 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) do pozostałych studzienek.</li>
	<li>Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia pionowo na płytce 96-dołkowej, przenosząc 30 μl roztworu z rzędu 1 do tej samej pozycji kolumny w rzędzie 2. Wymieszać ponownie i przenieść 30 μl roztworu do studzienek w następnym rzędzie, aż do osiągnięcia granicy. Usuń ostatnie 30 μl.</li>
	<li>Dodać 20 μl 1 M NaOH i 10 mM EDTA do każdego dołka, uszczelnić płytkę i podgrzewać mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 95 °C w celu całkowitej denaturacji dupleksu DNA.</li>
	<li>Natychmiast schłodzić próbki na lodzie i dodać 50 μl lodowatego octanu amonu o stężeniu 2 M (pH 7,0) i inkubować na lodzie przez 10 minut 
	UWAGA: Kroki 3.7-3.10 obejmują użycie próżni.</li>
	<li>Zmontuj aparat do igrania w kropki z wstępnie nasączoną membraną i usuń resztki buforu przy użyciu pełnej próżni.</li>
	<li>Przemyć membranę, dodając 200 μl buforu TE do każdego dołka aparatu do igłówek. Włącz próżnię, aby usunąć bufor TE.</li>
	<li>Załadować zdenaturowane DNA (przygotowane w poprzednich krokach 3.1-3.6) do każdego dołka aparatu do igrania w kropki. Włącz próżnię, aby usunąć roztwór.</li>
	<li>Umyj membranę, dodając 200 μl 2x SSC i całkowicie usuń resztki roztworów za pomocą próżni.</li>
	<li>Zdemontuj aparat do igrania w kropki, wyjmij membranę i przepłucz całą membranę 20 ml 2x SSC.</li>
	<li>Suszyć membranę na powietrzu przez 20 minut.</li>
	<li>Piec błonę w temperaturze 80 °C w próżni przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodać roztwór blokujący (5% odtłuszczonego mleka w TBST) do membrany i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór blokujący. Dodać rozcieńczone przeciwciała 5hmC (1:5 000) lub 5 mC (1:1 000) do błony i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć membranę TBST trzy razy przez 10 minut, aby usunąć resztki przeciwciał. Dokładnie usuń TBST.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP (1:10 000 dla HRP przeciwko królikowi (5hmC) lub 1:3 000 dla HRP przeciwko myszom (5mC)) do membrany i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę TBST trzykrotnie przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać substrat ECL western blot do membrany w celu wizualizacji sygnałów 5hmC za pomocą detektora chemiluminescencji. Reprezentatywny wynik został pokazany w Rysunek 1E.</li>
</ol>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj zilustrowaliśmy zastosowanie zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 w celu osiągnięcia czasowej kontroli hydroksymetylacji DNA. Po odkryciu rodziny TET dioksygenazy 5-metylocytozyny przeprowadzono wiele badań w celu rozszyfrowania funkcji biologicznych białek TET i ich głównego produktu katalitycznego 5hmC 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 <sup cla...

Metylacja DNA, głównie odnosi się do dodawania grupy metylowej do pozycji węgla 5 cytozyny w celu utworzenia 5-metylocytozyny (5mC), jest katalizowana przez metylotransferazy DNA (DNMT). 5mC działa jako główny znacznik epigenetyczny w genomie ssaków, który często sygnalizuje represję transkrypcji, inaktywację chromosomu X i wyciszenie transpozonów1. W odwróceniu metylacji DNA pośredniczy rodzina białek translokacji dziesięciu elfów (TET). Enzymy TET należą do dioksygenaz zależnych od żelaza (II) i 2-oksoglutaranów, które katalizują sukcesywne utlenianie 5mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksycytozyny (5caC). Utlenianie 5mC za pośrednictwem TET nakłada dodatkową warstwę kontroli epigenetycznej nad genomem ssaków. Odkrycie TET wywołało intensywne zainteresowanie w dziedzinie epigenetyki w celu odkrycia biologicznych funkcji białek TET i ich głównego produktu katalitycznego 5hmC. 5hmC jest nie tylko produktem pośrednim podczas aktywnej demetylacji DNA za pośrednictwem TET2,3,4, ale działa również jako stabilny znacznik epigenetyczny5,6,7,8. Chociaż hydroksymetylacja DNA jest silnie skorelowana z ekspresją genów, a nieprawidłowe zmiany w hydroksymetylacji DNA są związane z niektórymi zaburzeniami u ludzi9,10,11, związki przyczynowe między epigenetycznymi modyfikacjami DNA a fenotypami często pozostają trudne do ustalenia, co można częściowo przypisać brakowi niezawodnego narzędzia do dokładnego dodawania lub usuwania modyfikacji DNA w genom w określonej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.
Tutaj informujemy o użyciu chemicznie indukowanego narzędzia do przebudowy epigenomu (CiDER) w celu pokonania przeszkód napotykanych w badaniach nad związkiami przyczynowymi między hydroksymetylacją DNA a transkrypcją genów. Projekt opiera się na założeniu, że domena katalityczna TET2 (TET2CD) może zostać podzielona na dwa nieaktywne fragmenty, gdy ulega ekspresji w komórkach ssaków, a jej funkcja enzymatyczna może zostać przywrócona poprzez przyjęcie chemicznie indukowanego podejścia do dimeryzacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Aby ustalić system split-TET2CD, wybraliśmy sześć miejsc w TET2CD, składających się z regionu bogatego w Cys i dwuniciowego fałdu β-helisy (DSBH), na podstawie zgłoszonej struktury krystalicznej kompleksu TET2-DNA, który nie ma regionu o niskiej złożoności12. Syntetyczny gen kodujący induplikowany rapamycyną moduł dimeryzacji FK506 wiążący białko 12 (FKBP12) i domenę wiążącą rapamycynę FKBP (FRB) ssaczego celu rapamycyny14,15, wraz z sekwencją polipeptydową samorozszczepiającego peptydu T2A16,17, został indywidualnie wstawiony do wybranych podzielonych miejsc w TET2CD. Wybór TET2 jako naszego celu inżynieryjnego opiera się na następujących względach. Po pierwsze, mutacje somatyczne w TET2 z jednoczesnym zmniejszeniem hydroksymetylacji DNA są często obserwowane w zaburzeniach u ludzi, w tym w zaburzeniach szpikowych i raku10, co dostarcza przydatnych informacji na temat wrażliwych miejsc, których należy unikać przy wprowadzaniu. Po drugie, duża część domeny katalitycznej TET2, szczególnie obszar o niskiej złożoności, jest zbędna dla funkcji enzymatycznej12, co umożliwia nam stworzenie zminimalizowanego podziału TET2 dla indukowalnych modyfikacji epigenetycznych. Po przebadaniu ponad 15 konstruktów, wybrano konstrukt, który wykazywał najwyższe indukowane rapamycyną przywrócenie swojej aktywności enzymatycznej w systemie ssaków i oznaczono go jako CiDER18. Opisujemy tutaj zastosowanie CiDER znakowanego mCherry w celu uzyskania indukowalnej hydroksymetylacji DNA i epigenetycznej przebudowy za pomocą rapamycyny oraz przedstawiamy trzy metody walidacji produkcji 5hmC za pośrednictwem CiDER w modelowym systemie komórkowym HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% roztwór</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, Bydło</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC) (pAb)</td><td>Motyw aktywny</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenylolindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Ekonomiczny piekarnik próżniowy, 0,6 stopy sześciennej (17 l)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-5-metylocytozyny (5mC), klon 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciała sprzężonego z HRP</td><td></td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw królikowi, </td><td>Technologia sygnalizacji komórek</td> przeciwciał sprzężona z HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany enzym split-tet2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji dna i przebudowy epigenetycznej

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Metylacja DNA jest stabilną i dziedziczną modyfikacją epigenetyczną w genomie ssaków i bierze udział w regulacji ekspresji genów w celu kontrolowania funkcji komórkowych. Odwrócenie metylacji DNA lub demetylacji DNA odbywa się za pośrednictwem rodziny dioksygenaz translokacji dziesięciu jedenastu (TET) białek. Chociaż powszechnie donoszono, że nieprawidłowa metylacja i demetylacja DNA są związane z wadami rozwojowymi i rakiem, to, w jaki sposób te zmiany epigenetyczne bezpośrednio przyczyniają się do późniejszej zmiany ekspresji genów lub progresji choroby, pozostaje niejasne, głównie z powodu braku niezawodnych narzędzi do dokładnego dodawania lub usuwania modyfikacji DNA w genomie w określonej rozdzielczości czasowej i przestrzennej. Aby pokonać tę przeszkodę, zaprojektowaliśmy enzym rozszczepiony TET2, aby umożliwić czasową kontrolę utleniania 5-metylocytozyny (5mC), a następnie przebudowę stanów epigenetycznych w komórkach ssaków poprzez proste dodanie substancji chemicznych. W tym miejscu opisujemy metody wprowadzania indukowanego chemicznie narzędzia do przebudowy epigenomu (CiDER), opartego na zmodyfikowanym enzymie rozszczepionym TET2, do komórek ssaków i ilościowego określania chemicznie indukowanej produkcji 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) za pomocą barwienia immunologicznego, cytometrii przepływowej lub testu kropkowego. To indukowane chemicznie narzędzie do przebudowy epigenomu znajdzie szerokie zastosowanie w badaniu systemów komórkowych bez zmiany kodu genetycznego, a także w badaniu relacji epigenotyp – fenotyp w różnych systemach biologicznych.

Chemicznie indukowalna konwersja 5mC do 5hmC może zostać zwalidowana za pomocą immunobarwienia na poziomie pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej populacji komórek przetransfekowanych (mCherry-dodatnich) lub bardziej ilościowego testu dot-blot, jak przedstawiono na Rysunku 1. Domena katalityczna TET2, lub TET2CD, była stosowana w całym badaniu jako kontrola pozytywna. Szczegóły dotyczące mapowania zmian w 5hmC i dostępności chromatyny indukowan...

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Ogólnym celem tej serii eksperymentów jest wprowadzenie zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 o nazwie CiDER do komórek ssaków w celu indukowalnej modyfikacji DNA, takiej jak hydroksymetylacja, a także przebudowa epigenetyczna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak: Główną zaletą tej techniki jest to, że zmodyfikowany enzym rozszczepiony TET2 umożliwia czasową kontrolę utleniania 5-metylocytozyny, a następnie przebudowę stanów epigenetycznych w komórkach ssaków za pomocą dodatków chemicznych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować przylegającą linię komórkową w DMEM uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS, a także 100 jednostek na mililitr penicyliny i streptomycyny.Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Transfekować komórki plazmidem CiDER zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia należy wymienić pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji na świeży, kompletny DMEM. Aby chemicznie indukować komórki, dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonej rapamycyny do transfekowanych komórek utrzymywanych w dwóch mililitrach pożywki, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 nanomolowców. Aby wykonać cytometrię przepływową, należy ponownie zawiesić transfekowane i indukowane rapamycyną komórki w buforze FACS.W grupie kontrolnej należy użyć komórek wykazujących ekspresję CiDER bez leczenia rapamycyną. Napraw i przepuszczalność komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj dwa normalne kwasy solne do komórek, aby denaturować DNA przez 10 minut.Po zneutralizowaniu i zablokowaniu komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj rozcieńczone przeciwciało anty-5hmC do komórek. Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie buforem FACS.Dokładnie usuń bufor FACS. Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem do analizy FACS i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie umyj komórki buforem FACS.Po umyciu próbki są gotowe do analizy FACS. Wyizoluj genomowe DNA z komórek transfekowanych i indukowanych rapamycyną za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. W grupie kontrolnej należy zastosować transfekowane komórki CiDER bez leczenia rapamycyną.Podgrzej piekarnik próżniowy do 80 stopni Celsjusza. Wstępnie namocz membranę nitrocelulozową w podwójnie destylowanej wodzie, a następnie w buforze 6X SSC na 10 minut. Następnie załaduj 60 mikrolitrów równych ilości DNA na 96-dołkową płytkę PCR.Dodaj 30 mikrolitrów buforu TE do pozostałych studzienek. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia pionowo na 96-dołkowej płytce, przenosząc 30 mikrolitrów roztworu w pierwszym rzędzie do tej samej pozycji kolumny w drugim rzędzie. Wymieszaj ponownie i przenieś 30 mikrolitrów roztworu do studzienek w kolejnym rzędzie, aż do osiągnięcia granicy.Następnie usuń ostatnie 30 mikrolitrów ze studzienki. Następnie dodaj 20 mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku sodu i 10 milimolowych EDTA do każdej studzienki. Zamknij płytkę i podgrzewaj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby całkowicie zdenaturować dupleks DNA.Próbki należy natychmiast schłodzić na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów lodowatego octanu amonu dwumolowego do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. W międzyczasie zmontuj aparat dot-blot ze wstępnie nasączoną membraną.Usuń pozostały bufor przy użyciu pełnego podciśnienia. Przemyć membranę, dodając 200 mikrolitrów buforu TE do każdej studzienki aparatu dot-blot. Włącz próżnię, aby usunąć bufor TE.Następnie załaduj zdenaturowane DNA do każdej studzienki aparatu dot-blot. Włącz odkurzacz, aby usunąć roztwór. Umyj membranę, dodając 200 mikrolitrów 2X SSC i całkowicie usuń resztki roztworów za pomocą próżni.Zdemontuj aparat dot-blot. Następnie wyjmij membranę i przepłucz całą membranę 20 mililitrami 2X SSC. Suszyć membranę na powietrzu przez 20 minut.Aby dodatkowo wysuszyć membranę, piecz ją w 80 stopniach w próżni przez dwie godziny. Dodaj roztwór blokujący do membrany i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu roztworu blokującego dodać rozcieńczone przeciwciała 5-hmC lub 5-mC do membrany i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przemyj membranę TBST trzy razy przez 10 minut, aby usunąć resztki przeciwciał. Po dokładnym usunięciu TBST dodaj do błony przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP. Inkubować membranę przez godzinę w temperaturze pokojowej.Umyj membranę TBST trzy razy przez 10 minut. Na koniec dodaj do membrany substrat ECL western blotting w celu wizualizacji sygnałów 5-hmC za pomocą detektora chemiluminescencji. Reprezentatywny wynik kwantyfikacji produkcji 5-hmC za pośrednictwem CiDER za pomocą cytometrii przepływowej przedstawiono tutaj.Tylko komórki wykazujące ekspresję CiDER w warunkach leczenia rapamycyną wykazują znaczny wzrost poziomu 5-hmC. Reprezentatywny wynik globalnej zmiany poziomu 5-hmC w całej populacji komórek za pomocą testu dot-blot przedstawiono tutaj. Kontrola obciążenia jest wizualizowana przez barwienie błękitem etylenowym całkowitych ilości wejściowego DNA.Wyniki pokazują, że leczenie rapamycyną indukuje silną produkcję 5-hmC w komórkach HEK293T eksprymujących CiDER o znikomej aktywności tła. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką do badania funkcji komórkowych bez zmiany kodu genetycznego oraz do badania relacji między epigenotypem a fenotypem w różnych systemach biologicznych.

an-engineered-split-tet2-enzyme-for-chemical-inducible-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

W tym miejscu przedstawiamy protokół redukcji modyfikacji DNA w bakteriofagach za pomocą enzymu NgRET, umożliwiający skuteczną i pozbawioną blizn mutagenezę CRISPR-Cas. Metoda ta ułatwia inżynierię genetyczną fagów do zastosowań w biotechnologii i terapii fagowej.

Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Protokół ten opisuje nieintegracyjny, episomalny system oparty na CRISPR/dCas9 do celowanej edycji epigenetycznej w komórkach K562, łączący efektory dCas9-DNMT3A i dCas9-HDAC1 ze specyficznymi sgRNA, aby precyzyjnie indukować metylację DNA specyficzną dla locus, z ograniczoną efektem pozacelową.

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

Poznaj metodę CiDER do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej w komórkach ssaków. Technika umożliwia czasową kontrolę modyfikacji epigenetycznych.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Przeglądaj więcej filmów