Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Ogólnym celem tej serii eksperymentów jest wprowadzenie zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 o nazwie CiDER do komórek ssaków w celu indukowalnej modyfikacji DNA, takiej jak hydroksymetylacja, a także przebudowa epigenetyczna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak: Główną zaletą tej techniki jest to, że zmodyfikowany enzym rozszczepiony TET2 umożliwia czasową kontrolę utleniania 5-metylocytozyny, a następnie przebudowę stanów epigenetycznych w komórkach ssaków za pomocą dodatków chemicznych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować przylegającą linię komórkową w DMEM uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS, a także 100 jednostek na mililitr penicyliny i streptomycyny.

Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Transfekować komórki plazmidem CiDER zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy wymienić pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji na świeży, kompletny DMEM. Aby chemicznie indukować komórki, dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonej rapamycyny do transfekowanych komórek utrzymywanych w dwóch mililitrach pożywki, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 nanomolowców. Aby wykonać cytometrię przepływową, należy ponownie zawiesić transfekowane i indukowane rapamycyną komórki w buforze FACS.

W grupie kontrolnej należy użyć komórek wykazujących ekspresję CiDER bez leczenia rapamycyną. Napraw i przepuszczalność komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj dwa normalne kwasy solne do komórek, aby denaturować DNA przez 10 minut.

Po zneutralizowaniu i zablokowaniu komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj rozcieńczone przeciwciało anty-5hmC do komórek. Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie buforem FACS.

Dokładnie usuń bufor FACS. Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem do analizy FACS i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie umyj komórki buforem FACS.

Po umyciu próbki są gotowe do analizy FACS. Wyizoluj genomowe DNA z komórek transfekowanych i indukowanych rapamycyną za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. W grupie kontrolnej należy zastosować transfekowane komórki CiDER bez leczenia rapamycyną.

Podgrzej piekarnik próżniowy do 80 stopni Celsjusza. Wstępnie namocz membranę nitrocelulozową w podwójnie destylowanej wodzie, a następnie w buforze 6X SSC na 10 minut. Następnie załaduj 60 mikrolitrów równych ilości DNA na 96-dołkową płytkę PCR.

Dodaj 30 mikrolitrów buforu TE do pozostałych studzienek. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia pionowo na 96-dołkowej płytce, przenosząc 30 mikrolitrów roztworu w pierwszym rzędzie do tej samej pozycji kolumny w drugim rzędzie. Wymieszaj ponownie i przenieś 30 mikrolitrów roztworu do studzienek w kolejnym rzędzie, aż do osiągnięcia granicy.

Następnie usuń ostatnie 30 mikrolitrów ze studzienki. Następnie dodaj 20 mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku sodu i 10 milimolowych EDTA do każdej studzienki. Zamknij płytkę i podgrzewaj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby całkowicie zdenaturować dupleks DNA.

Próbki należy natychmiast schłodzić na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów lodowatego octanu amonu dwumolowego do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. W międzyczasie zmontuj aparat dot-blot ze wstępnie nasączoną membraną.

Usuń pozostały bufor przy użyciu pełnego podciśnienia. Przemyć membranę, dodając 200 mikrolitrów buforu TE do każdej studzienki aparatu dot-blot. Włącz próżnię, aby usunąć bufor TE.

Następnie załaduj zdenaturowane DNA do każdej studzienki aparatu dot-blot. Włącz odkurzacz, aby usunąć roztwór. Umyj membranę, dodając 200 mikrolitrów 2X SSC i całkowicie usuń resztki roztworów za pomocą próżni

Zdemontuj aparat dot-blot. Następnie wyjmij membranę i przepłucz całą membranę 20 mililitrami 2X SSC. Suszyć membranę na powietrzu przez 20 minut.

Aby dodatkowo wysuszyć membranę, piecz ją w 80 stopniach w próżni przez dwie godziny. Dodaj roztwór blokujący do membrany i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu roztworu blokującego dodać rozcieńczone przeciwciała 5-hmC lub 5-mC do membrany i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przemyj membranę TBST trzy razy przez 10 minut, aby usunąć resztki przeciwciał. Po dokładnym usunięciu TBST dodaj do błony przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP. Inkubować membranę przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Umyj membranę TBST trzy razy przez 10 minut. Na koniec dodaj do membrany substrat ECL western blotting w celu wizualizacji sygnałów 5-hmC za pomocą detektora chemiluminescencji. Reprezentatywny wynik kwantyfikacji produkcji 5-hmC za pośrednictwem CiDER za pomocą cytometrii przepływowej przedstawiono tutaj.

Tylko komórki wykazujące ekspresję CiDER w warunkach leczenia rapamycyną wykazują znaczny wzrost poziomu 5-hmC. Reprezentatywny wynik globalnej zmiany poziomu 5-hmC w całej populacji komórek za pomocą testu dot-blot przedstawiono tutaj. Kontrola obciążenia jest wizualizowana przez barwienie błękitem etylenowym całkowitych ilości wejściowego DNA.

Wyniki pokazują, że leczenie rapamycyną indukuje silną produkcję 5-hmC w komórkach HEK293T eksprymujących CiDER o znikomej aktywności tła. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką do badania funkcji komórkowych bez zmiany kodu genetycznego oraz do badania relacji między epigenotypem a fenotypem w różnych systemach biologicznych.