Name: Wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej do badania fuzji makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji szkła pokrywowego w powierzchnię fuzjogenną do badania fuzji makrofagów. Technika umożliwia obrazowanie na żywo i superrozdzielczą mikroskopię fluorescencyjną komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować członkom laboratorium Ugarova i badaczom z Centrum Biologii Metabolicznej i Naczyniowej za pomocną dyskusję na temat tej pracy. James Faust pragnie wyrazić swoją wdzięczność instruktorom na kursie mikroskopii super rozdzielczej w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w 2015 roku. Pragniemy podziękować Satya Khuon z Janelia za pomoc w przygotowaniu próbki do LLSM. Podczas recenzji i kręcenia części filmowej James Faust był wspierany przez stypendium T32 Fellowship (5T32DK007569-28). Komponent Lattice Light Sheet tej pracy był wspierany przez HHMI oraz Fundację Betty i Gordona Moore'ów. T.U. jest finansowany z grantu NIH HL63199.

Procedury wykorzystujące zwierzęta zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Klinice Mayo, Kampusie Badawczym Janelia i Uniwersytecie Stanowym Arizony.
1. Przygotowanie szkła nakrywkowego oczyszczonego kwasem
UWAGA: Szkło nakrywkowe zakupione od wielu producentów może nie być tak czyste, jak oczekiwano. Rozważ rutynowe czyszczenie partii szkła nakrywkowego przed każdym zabiegiem, w którym w grę wchodzi mikroskopia.
<ol>
	<li>Kup szkło nakrywkowe o wysokiej rygorystyczności. Zwróć szczególną uwagę, aby wybrać odpowiednią grubość (0,15 lub 0,17 mm). 
	UWAGA: Wybór grubości szkła nakrywkowego zależy od obiektywu mikroskopu i jest podany bezpośrednio na tubusie obiektywu.</li>
	<li>Inkubować szkło nakrywkowe w 12 M kwasie solnym w dobrze wentylowanym dygestoriach chemicznych przez 1 godzinę z sonikacją (42 kHz, 70 W). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy ze świeżym 12 M HCl.</li>
	<li>Napełnij osobną zlewkę ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Sonikuj szkło nakrywkowe przez 5 - 10 minut w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym. Powtórz ten krok dziesięć razy.</li>
	<li>Inkubować szkło nakrywkowe w czystym acetonie w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym przez 30 minut z sonikacją. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Napełnij oddzielną zlewkę sterylną ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Sonikuj szkło nakrywkowe przez 5 - 10 minut w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym. Powtórz ten krok dziesięć razy.</li>
	<li>Inkubować szkło nakrywkowe w 100% alkoholu etylowym w kapturze chemicznym przez 30 minut z sonikacją. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. 
	UWAGA: Ważna jest czystość alkoholu etylowego. Zanieczyszczenia w postaci rozpuszczonych ciał stałych wysychają na szkle i mogą sprzyjać fuzji makrofagów.</li>
	<li>W celu długotrwałego przechowywania wyczyść kwasem szkło nakrywkowe w pojemniku wypełnionym czystym alkoholem etylowym. Alternatywnie osuszyć szkło nakrywkowe azotem gazowym i przechowywać w eksykatorze próżniowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fusogenicznych powierzchni o jakości optycznej
<ol>
	<li>Wysokotopliwy wosk parafinowy o niskiej temperaturze topnienia rozpuść w ultraczystym toluenie. 
	UWAGA: Stężenia podstawowe przyjmuje się na poziomie 10 mg/ml i rozcieńcza się w stosunku 1:9 w ultraczystym toluenie, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml. 
	Uwaga: Z toluenem należy obchodzić się ostrożnie jako z teratogenem. Toluen należy utylizować zgodnie z instytucjonalnym planem higieny chemicznej.</li>
	<li>Nanieść roztwór roboczy parafiny na suchą, oczyszczoną kwasem szklaną pokrywę w objętości, która równomiernie pokrywa powierzchnię szkła. Zdekantować nadmiar roztworu i osuszyć szkło nakrywkowe azotem lub powietrzem. Do przygotowania luzem użyj słoika Coplin zaprojektowanego tak, aby pomieścić szkło nakrywkowe.</li>
	<li>Wypoleruj szkło nakrywkowe 3 pociągnięciami w osi x, a następnie 3 pociągnięciami w osi y niestrzępiącą się ściereczką (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Bezpośrednio przed przeprowadzeniem eksperymentu umyj szkło nakrywkowe sterylną ultraczystą wodą, a następnie sterylizuj przez 15 - 30 minut światłem ultrafioletowym w biologicznym kapturze ochronnym. Alternatywnie można wysterylizować szkło nakrywkowe za pomocą tlenku etylenu lub promieniowania gamma.</li>
</ol>
3. Mikrowzorcowanie związków zawierających węglowodory w celu ograniczenia fuzji do określonych regionów
<ol>
	<li>Osusz oczyszczoną kwasem szklankę nakrywkową i unieruchom szybę na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie zanurz siatkę szukacza do skanowania mikroskopii elektronowej ze złotą transmisyjną transmisyjną w roztworze roboczym związku (związków) węglowodorowego. Wybierz związek węglowodorowy, który spełnia cel końcowy eksperymentu (patrz Tabela 1). Odchować nadmiar roztworu, delikatnie stukając w kratkę o bibułę filtracyjną i natychmiast umieścić siatkę na środku szkła nakrywkowego. Pozostaw toluen do wyschnięcia na 2 minuty przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Upewnij się, że kratka jest przyklejona do szkła, delikatnie odwracając szkło. Jeśli kratka się odczepi, powtórz krok 3.2, używając nowej szklanki osłonowej. 
	UWAGA: Jeśli myjka plazmowa nie jest dostępna, pomiń krok 3.4.</li>
	<li>Szkło nakrywkowe należy oczyścić plazmowo poprzez obróbkę plazmą gazową próżniową. 
	UWAGA: Siatka szukacza działa jak maska chroniąca znajdującą się pod spodem powierzchnię zaadsorbowaną przez węglowodory o długich łańcuchach z plazmy. Obszary, które nie są chronione przez siatkę, stają się niefusogenne przez wystawienie na działanie plazmy. Czas, przez jaki szkło nakrywkowe jest wystawione na działanie plazmy, należy określić empirycznie.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie zdejmij siatkę z powierzchni szkła, aby odsłonić mikrowzór.</li>
</ol>
4. Produkcja naczyń ze szklanym dnem
<ol>
	<li>Wywierć okrągły otwór o średnicy 6 - 10 mm w dnie plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą wiertła stopniowego. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć wiertła stopniowego, aby uzyskać gładkie krawędzie. Jeśli krawędzie są zbyt szorstkie, szkło nakrywkowe nie przylgnie płasko do dna naczynia. Nieidealnie płaskie powierzchnie utrudniają mikroskopię.</li>
	<li>Ostrożnie wymieszać i odgazować elastomer silikonowy zgodnie z instrukcjami producenta (tj. polidimetylosiloksan; PDMS).</li>
	<li>Nałożyć cienką warstwę elastomeru tuż obok krawędzi otworu (tj. opisującej) go. 
	UWAGA: Elastomer powinien wyglądać jak ciągła, choć cienka wstęga otaczająca otwór.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć na naczynie fuzogeniczne szkło nakrywkowe (opisane w sekcji 2) lub suche, oczyszczone kwasem szkło nakrywkowe (opisane w sekcji 1) w celu zakrycia otworu otoczonego elastomerem. Upewnij się, że szkło nakrywkowe wydaje się zlicować z dnem naczynia i wystaje poza średnicę otworu, tak aby znaczna część szkła stykała się z plastikiem. Utwardzać elastomer przez pieczenie w temperaturze 50 °C przez 2 - 3 godziny.</li>
	<li>Jeśli preferowane jest szkło fuzogeniczne, naczynie i komórki hodowlane należy sterylizować promieniami UV zgodnie ze standardowymi protokołami. Jeśli jednak preferowany jest mikrowzór, przejdź do kroku 3.2 w celu przygotowania mikrowzoru (plazma gazowa używana podczas mikrowzoru sterylizuje naczynie i silnie sprzęga PDMS ze szkłem).</li>
</ol>
5. Zbieranie makrofagów wywołanych tioglikolanem
<ol>
	<li>Wstrzyknij 8-tygodniowym myszom C57BL/6 0,5 ml sterylnego roztworu 4% tioglikolanu browarnianego, jak opisano wcześniej3,4,6.</li>
	<li>Siedemdziesiąt dwie godziny później poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji i użytkowania zwierząt, a następnie zbierz makrofagi przez płukanie otrzewnowe lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami uzupełnionym 5 mM etylenodiaminotetraoctanu.</li>
	<li>Odwirować makrofagi przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w 1 ml DMEM:F12 uzupełnionym 15 mM HEPES, 10% FBS i 1% antybiotykami (pożywka hodowlana). 
	UWAGA: Komórki są następnie zliczane za pomocą hemocytometru Neubauera. Makrofagi rozcieńcza się do odpowiedniego stężenia i nakłada na powierzchnie. Liczba komórek, które należy zastosować na danej powierzchni, powinna być dokładnie rozważona przez badacza na potrzeby pytania doświadczalnego. Zapoznaj się ze znanymi normami w literaturze podstawowej.</li>
	<li>Po 30 minutach umyj powierzchnie HBSS uzupełnionym 0,1% BSA w celu usunięcia nieprzylegających komórek i zastąp je świeżą pożywką hodowlaną. Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C).</li>
	<li>2 godziny później odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką hodowlaną uzupełnioną 10 ng/ml IL-4. Zobrazuj komórki zgodnie z opisem w innym miejscu4.</li>
</ol>

<ol><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes%2Fmacrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).</li>
<li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mediators+of+macrophage+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li>
<li>Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4973655/">The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion.</a> Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).</li>
<li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion%3A+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylsilane-modified+surfaces%3A+Inhibition+of+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation.</a> J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).</li>
<li>Vignery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+fuse+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Fusion%3A+Overviews+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to fuse macrophages in vitro.</a> Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign-body+giant+cells+and+polyurethane+biostability%3A+In+vivo+correlation+of+cell+adhesion+and+surface+cracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking.</a> J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).</li>
<li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+reaction+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-coupled+polyethylene+oxide+on+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).</li>
<li>DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+and+surface+chemistry+control+of+monocyte%2Fmacrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+by+photochemically+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces.</a> J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).</li>
<li>Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocyte%2Fmacrophage+adhesion%2C+macrophage+motility%2C+and+IL-4-induced+foreign+body+giant+cell+formation+on+silane-modified+surfaces+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Fölling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+method+for+molecular+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Proposed method for molecular optical imaging.</a> Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Potrzeba zidentyfikowania, a następnie opracowania powierzchni szklanych o jakości optycznej, które sprzyjają fuzji makrofagów, wynikała z faktu, że do niedawna żadne opublikowane badanie nie wizualizowało bezpośrednio fuzji makrofagów w kontekście żywych okazów 3,4. Wynika to z faktu, że powszechnie stosowane fuzogeniczne powierzchnie z tworzywa sztucznego wymagają obiektywów LWD i są w dużej mierze ograniczone do optyki z kontrastem fazowym. Bariery te zostały ...

Powstawanie MGC towarzyszy wielu stanom patologicznym w ludzkim ciele wyróżniającym się przewlekłym stanem zapalnym1. Pomimo zgody co do tego, że makrofagi monojądrowe łączą się, tworząc MGCs2, zaskakująco niewiele badań wykazało fuzję w kontekście z żywymi okazami3,4. Dzieje się tak, ponieważ czyste szklane powierzchnie, które są wymagane w większości technik obrazowania, nie sprzyjają fuzji makrofagów, gdy są indukowane przez cytokiny zapalne5. Rzeczywiście, jeśli czyste szkło jest używane jako podłoże do fuzji makrofagów, wówczas obiektywy o małym lub średnim powiększeniu (tj. 10-20X) i ponad 15 godzin ciągłego obrazowania są często wymagane do zaobserwowania pojedynczego zdarzenia fuzji.
Z drugiej strony, fuzogeniczne powierzchnie z tworzywa sztucznego (np. permanox) lub plastik klasy bakteriologicznej sprzyjają fuzji2. Jednak obrazowanie przez plastik jest problematyczne, ponieważ podłoże jest grube i rozprasza światło. Komplikuje to obrazowanie, ponieważ wymagane są obiektywy o dużej odległości roboczej (LWD). Jednak obiektywy LWD mają zwykle słabą zdolność zbierania światła w porównaniu z ich odpowiednikami z korekcją nakrywkową. Co więcej, techniki wykorzystujące zmiany polaryzacji światła przechodzącego przez próbkę, takie jak różnicowy kontrast interferencyjny, są niemożliwe, ponieważ plastik jest dwójłomny. Bariery związane z użyciem tworzyw sztucznych są dodatkowo podkreślone przez fakt, że nie można przewidzieć, gdzie na powierzchni nastąpi fuzja makrofagów/MGC. Łącznie ograniczenia te ograniczają wizualizację fuzji makrofagów do optyki z kontrastem fazowym, wydłużonego całkowitego czasu obrazowania (>15 godzin ciągłej) i niskiej rozdzielczości.
Niedawno zidentyfikowaliśmy wysoce fuzogeniczną powierzchnię szkła podczas przeprowadzania mikroskopii superrozdzielczej pojedynczych cząsteczek z ustalonymi makrofagami/MGCs4. Obserwacja ta była zaskakująca, ponieważ czyste szklane powierzchnie sprzyjają fuzji z bardzo niską szybkością ~ 5% po 24 godzinach w obecności interleukiny-4 (IL-4), jak określono za pomocą wskaźnika fuzji4. Odkryliśmy, że zdolność do promowania fuzji była spowodowana zanieczyszczeniem oleamidem. Adsorpcja oleamidu lub innych związków, które podobnie zawierały węglowodory długołańcuchowe, sprawiła, że szkło stało się fuzogenne. Najbardziej fuzogenny związek (wosk parafinowy) był mikrowzorowany i zapewniał wysoki stopień czasoprzestrzennej kontroli nad fuzją makrofagów oraz 2-krotny wzrost liczby zdarzeń fuzji obserwowanych w tym samym czasie w porównaniu z permanoksem. Te powierzchnie o jakości optycznej dały pierwszy wgląd w cechy morfologiczne i kinetykę, które rządzą powstawaniem MGC u żywych okazów.
W tym protokole opisujemy wytwarzanie różnych powierzchni szklanych, które mogą być używane do monitorowania powstawania MGC z żywych okazów. Ponadto pokazujemy, że powierzchnie te są podatne na techniki superrozdzielczości dalekiego pola. Wytwarzanie powierzchni zależy od celu eksperymentu, a każda powierzchnia jest opisana wraz z powiązanymi przykładami w tekście poprzedzającym.

<table><tbody><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PCD-32G</td><td></td></tr><tr><td>Siatka szukacza</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>G400F1-Au</td><td>każda złota siatka TEM będzie działać</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe (22x22 mm)</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>używaj tylko szkła nakrywkowego o wysokiej rygorystyczności</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17310</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16415</td><td>musi być wolny od alfa-tokoferolu, jeśli jest podstawiony</td></tr><tr><td>Oleamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O2136</td><td>przygotować świeży</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR International</td><td>BDH1101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>15050</td><td>używać nisko rozpuszczonego ciała stałe etanol</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212</td><td>stosować do mycia kwasem szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>Slyguard 184</td><td>VWR International</td><td>102092-312</td><td>mieszać w stosunku 1:10 i utwardzać w temperaturze 50 &; C na</td></tr><tr><td>szalkę Petriego 4 h 35 mm</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-351864</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont nr 5</td><td>Mikroskopia elektronowa sciences</td><td>72705</td><td>idealna do usuwania siatki TEM w sekcji 3.5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Corning</td><td>10-092</td><td>zawiera 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576</td><td>stosować w stężeniu 0,1% w HBSS do przemywania nieprzylegających makrofagów</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Genscript</td><td>Z02996</td><td>podwielokrotność przy 10 &mu; g/ml i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>do stosowania do utrwalonych próbek lub technik, które nie wymagają środków kontrastowych</td></tr><tr><td>Myszy eGFP-LifeAct</td><td>nie</td><td></td> dotyczy <td>nie dotyczy zastosowanie do obrazowania fluorescencyjnego na żywo</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark&nbsp;</td><td>34155</td><td>Służy do polerowania powierzchni zaadsorbowanych przez węglowodory</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej do badania fuzji makrofagów

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Wizualizacja powstawania wielojądrowych komórek olbrzymich (MGC) z żywych okazów była wyzwaniem ze względu na fakt, że większość technik obrazowania na żywo wymaga rozchodzenia się światła przez szkło, ale na szkle fuzja makrofagów jest rzadkim zjawiskiem. Protokół ten przedstawia wytwarzanie kilku powierzchni szklanych o jakości optycznej, w których adsorpcja związków zawierających węglowodory długołańcuchowe przekształca szkło w powierzchnię fuzogeniczną. W pierwszej kolejności opisano przygotowanie czystych powierzchni szklanych jako materiału wyjściowego do modyfikacji powierzchni. Po drugie, opracowano metodę adsorpcji związków zawierających węglowodory o długich łańcuchach w celu przekształcenia szkła niefuzogennego w podłoże fuzogeniczne. Po trzecie, protokół ten opisuje wytwarzanie mikrowzorów powierzchniowych, które promują wysoki stopień czasoprzestrzennej kontroli nad powstawaniem MGC. Na koniec opisano wytwarzanie naczyń ze szklanym dnem. Przedstawiono przykłady wykorzystania tego systemu komórkowego in vitro jako modelu do badania fuzji makrofagów i powstawania MGC.

Parametry fizykochemiczne materiałów mają ogromny wpływ na stopień fuzji makrofagów7,8,9,10. Ponadto wiadomo, że zanieczyszczenia powierzchniowe promują fuzję makrofagów11. Dlatego ważne jest, aby zacząć od czystego szkiełka podstawowego jako kontroli negatywnej dla fuzji makrofagów. Po oczyszczeniu zgodnie z opisem w protokole 1, szkiełk...

Ten protokół opisuje wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej, zaadsorbowanych związkami zawierającymi długołańcuchowe węglowodory, które mogą być używane do monitorowania fuzji makrofagów żywych próbek i umożliwiają super-rozdzielczość mikroskopii utrwalonych próbek.

Wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej do badania fuzji makrofagów

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Ogólnym celem tego protokołu jest przekształcenie niefuzogennego szkła nakrywkowego w fuzogeniczną powierzchnię, którą można wykorzystać do badania fuzji makrofagów przy użyciu dowolnej formy mikroskopii optycznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na fundamentalne pytania związane z molekularnym mechanizmem fuzji makrofagów. Główną zaletą tej procedury jest to, że każda technika mikroskopowa, w szczególności obrazowanie na żywo, może być wykorzystana do badania fuzji makrofagów.Procedurę zademonstrują James Faust, trzeci stypendysta, i Arnat Balabiyev, doktorant z mojego laboratorium. Na początek w dobrze wentylowanym dygestorium chemicznym inkubować szkło nakrywkowe o wysokiej surowości w 12-molowym kwasie solnym z sonikacją przez godzinę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy ze świeżym 12-trzonowym HCL.Napełnij osobną zlewkę ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Następnie sonikować szkło nakrywkowe przez pięć do 10 minut. Następnie inkubować szkło nakrywkowe w czystym acetonie przez 30 minut z sonikacją.Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Następnie napełnij oddzielną zlewkę sterylną ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Sonikuj szkło nakrywkowe przez pięć do 10 minut.Inkubować szkło nakrywkowe w 100% alkoholu etylowym przez 30 minut z sonikacją. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. W celu długotrwałego przechowywania wyczyść kwasem szkło nakrywkowe w pojemniku z czystym alkoholem etylowym.Alternatywnie osuszyć szkło nakrywkowe azotem gazowym i przechowywać w eksykatorze próżniowym. Rozpuść wosk parafinowy o wysokiej temperaturze topnienia bez DMSO w ultraczystym toluenie. Za pomocą szklanej pipety nałóż wystarczającą ilość roztworu roboczego parafiny na suchą, oczyszczoną kwasem szklaną szklaną szklaną szklankę, aby równomiernie pokryć jej powierzchnię.Zdekantować nadmiar roztworu i za pomocą azotu lub powietrza osuszyć szkło nakrywkowe. Za pomocą niestrzępiącej się chusteczki wypoleruj szkło nakrywkowe, wykonując trzy pociągnięcia wzdłuż osi X, a następnie trzy pociągnięcia wzdłuż osi Y. Bezpośrednio przed przeprowadzeniem eksperymentu należy umyć szkło nakrywkowe sterylną wodą ultraczystą, a następnie wysterylizować je światłem ultrafioletowym w biologicznym kapturze ochronnym przez 15 do 30 minut.Osusz szkło nakrywkowe oczyszczone kwasem i unieruchamij szkło na płaskiej powierzchni. Za pomocą kleszczy ostrożnie zanurz siatkę szukacza do skanowania złotej transmisyjnej mikroskopii elektronowej w roztworze roboczym związku węglowodorowego. Odchować nadmiar roztworu, delikatnie stukając w kratkę o bibułę filtracyjną, a następnie natychmiast umieścić siatkę na środku szkła nakrywkowego.Pozostaw toluen do wyschnięcia na dwie minuty. Upewnij się, że kratka jest przyklejona do szkła, delikatnie odwracając szkło. Jeśli kratka się odczepi, powtórz klejenie, używając nowego szkła nakrywkowego umytego kwasem.Po wyjęciu siatki TEM należy zbadać ciągłość mikrowzoru w małym powiększeniu. Mikrowzór powinien wydawać się ciągły, ale materiał nie powinien wystawać poza marginesy wzoru. Następnie użyj myjki plazmowej z plazmą próżniowo-gazową, aby wyczyścić szkło nakrywkowe zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie, za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, ostrożnie zdejmij siatkę z powierzchni szkła, aby odsłonić mikrowzór. Za pomocą wiertła stopniowego wywierć okrągły otwór o średnicy od sześciu do 10 milimetrów z gładkimi krawędziami w dnie 35-milimetrowej plastikowej szalki Petriego. Ostrożnie wymieszaj i odgazuj elastomer silikonowy zgodnie z instrukcjami producenta.Nałóż cienką warstwę elastomeru tuż obok krawędzi otworu w szalce Petriego. Elastomer powinien wyglądać jak ciągły cienki pasek otaczający otwór. Delikatnie nałóż na naczynie fuzogeniczną lub suchą, oczyszczoną kwasem szklankę nakrywkową, aby zakryć otwór otoczony elastomerem.Upewnij się, że szkło nakrywkowe wydaje się zlicować z dnem naczynia i wystaje poza średnicę otworu, tak aby znaczna część szkła stykała się z plastikiem. Utwardź elastomer, piecząc go w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Wstrzyknąć ośmiotygodniowym czarnym myszom C57 6 0,5 mililitra sterylnego roztworu 4% tioglikolanu piwowarskiego, jak opisano w protokole tekstowym.72 godziny później, po eutanazji zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji i stosowania zwierząt, należy pobrać makrofagi przez płukanie międzyotrzewnowe za pomocą lodowatego PBS uzupełnionego pięciomilimolowym EDTA. Odwiruj makrofagi w temperaturze 300 razy G przez trzy minuty i ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze DMEM / F-12 uzupełnionym 15 milimolowymi hałdami 10% FBS i 1% antybiotykami. Po zliczeniu i rozcieńczeniu komórek i nałożeniu ich na powierzchnie przez 30 minut, użyj HBSS 0,1%BSA do umycia powierzchni i wymiany pożywki hodowlanej.Następnie zwróć kultury do inkubatora. Dwie godziny później odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką hodowlaną uzupełnioną 10 nanogramami na mililitr IL4 przed obrazowaniem komórek. Po czyszczeniu zgodnie z opisem w tym filmie szkło nakrywkowe jest wyjątkowo płaskie i nie ma widocznych cech powierzchni; podczas gdy absorpcja długołańcuchowych węglowodorów, po której następuje polerowanie powierzchni, tworzy widoczny tutaj stopień nanotopografii.Na czystych powierzchniach ze szkła nakrywkowego makrofagi topią się bardzo szybko. Natomiast po 24 godzinach w obecności IL4 makrofagi naniesione na powierzchnie zaadsorbowane związkami zawierającymi węglowodory długołańcuchowe ulegają silnej fuzji. Co więcej, sama absorpcja rozpuszczalnika nie sprawia, że szkło staje się powierzchnią fuzogeniczną.W tym przypadku do ilościowej oceny potencjalnych różnic w rozdzielczości wykorzystuje się pełną szerokość przy połowie maksimum lub FWHM struktur mniejszych niż granica dyfrakcji mikroskopu świetlnego. Co ważne, nie ma widocznej różnicy w FWHM 100-nanometrowych kulek fluorescencyjnych między różnymi powierzchniami, co sugeruje, że właściwości szkła wymagane do obrazowania fluorescencyjnego zostały wystarczająco zachowane. W tym eksperymencie makrofagi naniesiono na powierzchnie zawierające węglowodory długołańcuchowe.Następnie przeprowadzono formę mikroskopii superrozdzielczej zwaną 3D Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Filmy te pokazują, że różne techniki obrazowania na żywo są wykonalne, gdy makrofagi są nakładane na powierzchnie. Po opanowaniu modyfikację szkła, aby powierzchnia była fuzogenna, można wykonać w ciągu pół godziny, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o jej dokładnym przestrzeganiu. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, w celu uzyskania widoków fuzji z kontrastem specyficznym dla cząsteczki. Umożliwi to przeprowadzenie eksperymentów mających na celu identyfikację białek bezpośrednio zaangażowanych w fuzję.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała badaczom drogę do uzyskania rozdzielczych w czasie widoków fuzji makrofagów. W przyszłości pomoże nam to lepiej zrozumieć mechanizm fuzji makrofagów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie zmodyfikować szkło nakrywkowe, aby zbadać fuzję makrofagów.Nie zapominaj, że praca z kwasem i toluenem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze używać środków ochrony osobistej i odpowiedniej wentylacji.

fabricating-optical-quality-glass-surfaces-to-study-macrophage-fusion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę przez liczne grupy badawcze na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę konstruowania filtrów z wełny szklanej i wykazujemy, że są one również skuteczne w zagęszczaniu wodnych patogenów wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych.

Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Poznaj metodę modyfikacji szkła pokrywowego w powierzchnię fuzjogenną do badania fuzji makrofagów. Technika umożliwia obrazowanie na żywo i superrozdzielczą mikroskopię fluorescencyjną komórek.

Wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej do badania fuzji makrofagów

Przeglądaj więcej filmów