Identyfikacja OTX1 i OTX2 jako dwóch możliwych markerów molekularnych raka zatok przynosowych i nerwiaków zarodkowych węchu

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie użytecznych markerów molekularnych dla raka zatok przynosowych i nerwiaków węchowych w prosty i skuteczny sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerwiaka węchowego i raka zatok przynosowych, takie jak identyfikacja markerów molekularnych do rozróżniania podtypu nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać wynik w czasie krótszym niż sześć godzin, czyli w ciągu jednego dnia w przypadku raportu ze szpitala.

Procedurę ekstrakcji RNA i PCR w czasie rzeczywistym zademonstruje dr Giorgia Millefanti, doktorantka z mojego laboratorium. A procedurę immunohistochemii zademonstruje Giovanni Micheloni, również doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy zebrać i podzielić wszystkie ludzkie próbki FFPE na różne podgrupy, zgodnie z klasyfikacją nowotworów głowy i szyi WHO.

Podgrzewać szkiełka podstawowe w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ponownie nawodnij trzy sekcje FFPE o grubości trzech mikrometrów, myjąc je krótko w ksylenie przez 10 minut. Następnie myj szkiełka w 100%95%85% i 75% alkoholu seryjnie przez pięć minut każdego mycia.

Płucz szkiełka przez pięć minut w wodzie destylowanej. Następnie zablokuj aktywność endogenną, umieszczając szkiełka w 3% wodnym roztworze nadtlenku wodoru na 12 minut. Następnie wykonaj pobieranie antygenu, traktując szkiełka 10-milimolowym buforem cytrynianowym i podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 10 minut.

Po 10 minutach umyj sekcje w buforze TBS. Następnie dodaj 0,2% Triton X i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z kozim przeciwciałem anty-ludzkim OTX2, rozcieńczonym w stosunku 1 do 100. Następnego dnia dodać biotynylowane drugorzędowe przeciwciało przeciw kozom króliczym, rozcieńczone w stosunku 1 do 200 i inkubować skrawki przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie potraktuj próbki kompleksem peroksydazy ABC. Następnie rozwiń reakcję immunologiczną za pomocą tetrachlorowodorku diaminobenzenu i przeciwdziałaj barwieniu jąder hematoksyliną Harrisa. Następnie odwodnić skrawki w skali alkoholowej w kształcie półksiężyca i sklarować je w substancji klarującej pochodzenia turpinowego.

Następnie zamontuj sekcje na prowadnicy z medium montażowym. Po ekstrakcji RNA i odwrotnej transkrypcji wykonaj ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym za pomocą technologii opartej na sondzie i termocyklerze. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, używając 12,5 mikrolitra mieszanki głównej na bazie sondy, 1,25 mikrolitra każdej sondy OTX1, OTX2 i ACTB, 50 nanogramów CDNA i wody wolnej od nukleaz o całkowitej objętości do 25 mikrolitrów.

Wykonaj wszystkie reakcje w trzech egzemplarzach, używając genu ACTB jako endogennej kontroli w celu normalizacji poziomów ekspresji genów. Następnie odwiruj płytkę pod ciśnieniem 1109-krotności grawitacji przez trzy minuty. Następnie przechowuj płytkę chronioną przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do eksperymentu.

Aby przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym, umieść próbki w maszynie. Następnie ustaw profil termocyklera z początkowym cyklem gorącego startu w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie minuty i 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund i końcowym cyklem w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jedną minutę. W celu analizy poziomu ekspresji genów należy znormalizować poziomy ekspresji genów za pomocą metody porównawczego progu cyklu przy użyciu genu ACTB jako kontroli endogennej.

Oceń poziomy ekspresji genów za pomocą metody porównawczego progu cyklu i wykreśl wyniki. Następnie przeprowadź analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta, biorąc pod uwagę statystycznie istotne wyniki z p<0,05. W prawidłowej błonie śluzowej obserwowano silną i jednorodną reaktywność jądrową dla genów OTX zarówno w nabłonku nabłonka typu oddechowego orzęsionego pseudostratyfikowanego, jak i w podśluzówkowych komórkach gruczołowych.

Ekspresję jądrową OTX1 stwierdzono we wszystkich próbkach gruczolakoraka typu niejelitowego, podczas gdy niewielka lub nieobecna immunoreaktywność została podkreślona w gruczolakorakach typu jelitowego. Intensywna immunoreaktywność była obecna we wszystkich nerwiakach zarodkowych węchu. Wśród wszystkich słabo zróżnicowanych raków neuroendokrynnych, ekspresja OTX różniła się intensywnością i odsetkiem komórek dodatnich.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby każdy etap ekstrakcji RNA wykonywać w sterylnych warunkach przy użyciu również sterylnego sprzętu. Równolegle z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak analiza rentgenowska, badanie endoskopowe jamy nosowej, tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny i biopsja, w celu potwierdzenia wyników uzyskanych za pomocą naszej techniki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie onkologii do zbadania tej choroby w modelach komórkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować markery molekularne w celu rozróżnienia podtypów nowotworów za pomocą immunohistochemii i PCR w czasie rzeczywistym. Nie zapominaj, że praca z tymi odczynnikami, oprzyrządowaniem i próbkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak DPI.