Name: Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans przy użyciu RNAi i szoku cieplnego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji tożsamości komórkowej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alinie El-Khalili i Martinie Hajduskovej za pomoc techniczną. Dziękujemy członkom grupy Tursun za komentarze do manuskryptu. Praca ta była sponsorowana przez ERC-StG-2014-637530 i ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 i jest wspierana przez Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbruecka w Stowarzyszeniu Helmholtza.

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez LaGeSo Berlin, Niemcy
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Płytki agarowe NGM (1 L)
	<ol>
		<li>Dodać 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej (np. Bacto-Peptonu) i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 95% zapasie EtOH), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4 i 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml zapasu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki NGM-Agar RNAi (1 L)
	<ol>
		<li>Dodaj 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 95% zapasie EtOH), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4, 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml zapasu), 1 ml 1 M IPTG i 1 ml karbenicyliny (50 mg / ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 l)
	<ol>
		<li>Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 20 g agaru, 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml 50 mg/ml karbenicyliny i 2,5 ml 5 mg/ml tetracykliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Średni (1 L)
	<ol>
		<li>Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl i 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml karbenicyliny o stężeniu 50 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor M9 (1 L)
	<ol>
		<li>Dodać 6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl i 50 mg żelatyny. Przed użyciem dodać 1 ml 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór wybielający (10 ml)
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml NaClO i 2 ml 5 N NaOH. Dodaj H2O do 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek RNAi
Uwaga: C. elegans jest zazwyczaj hodowany w laboratorium na 6 cm płytkach Petriego zawierających 7,5 ml agaru z podłożem wzrostu nicieni (NGM-Agar)10,11. Protokół ten jest zoptymalizowany dla robaków trzymanych w temperaturze 15 °C. Do przygotowania płytek z NGM należy stosować standardowe techniki sterylne, aby zapobiec skażeniu grzybiczemu i bakteryjnemu. Poniżej znajduje się protokół przygotowania płytek NGM uzupełnionych odczynnikami do RNAi.
<ol>
	<li>Przygotować 6-centymetrowe płytki RNAi NGM-Agar zawierające 1 mM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 50 μg/ml karbenicyliny. Pozostaw je do wyschnięcia na 24 – 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności12.
	<ol>
		<li>Płytki RNAi należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Nie stosować, jeśli jest starszy niż 14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz klon bakterii RNAi (Escherichia coli HT115) zawierający plazmid L4440 z sekwencją DNA genu lin-53 z zamrożonego zapasu glicerolu z dostępnej biblioteki RNAi13 na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, stosując trójfazowy wzór smugowy. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez noc12. Ten klon umożliwia zależną od IPTG produkcję lin-53 dsRNA w bakteriach.
	<ol>
		<li>Dodatkowo hoduj bakterie RNAi, które zawierają plazmid L4440 bez żadnej sekwencji genów, jako pusty wektor control14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię z lin-53 lub pustych płytek agarowych wektorowych LB za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl i zaszczep każdą z nich w oddzielnej probówce hodowlanej zawierającej 2 ml płynnego podłoża LB 14 uzupełnionego 50 μg / ml karbenicyliny. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, aż osiągną gęstość optyczną (OD) 0,6 – 0,8 przy długości fali 600 nm. Zmierz średnicę zewnętrzną za pomocą spektrofotometru15. 
	UWAGA: Płynna pożywka LB nie powinna zawierać tetracykliny, w przeciwieństwie do płytki agarowej LB używanej do usuwania bakterii z glicerolu, ponieważ włączenie tetracykliny podczas karmienia prowadzi do zmniejszenia wydajności RNAi 12</li>
	<li>Dodać 500 μl każdej kultury bakteryjnej (lin-53 lub pusty wektor) do 6 cm płytek RNAi NGM-Agar za pomocą multipipety. Inkubować płytki z zamkniętą pokrywką przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wyschnięcia. W tym czasie IPTG w płytkach NGM będzie indukować produkcję dsRNA w bakteriach.
	<ol>
		<li>Użyj co najmniej 3 płytek na kulturę bakteryjną na eksperyment. Zapewni to 3 techniczne powtórzenia dla każdego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysuszone płytki RNAi NGM-agar z bakteriami należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do dwóch tygodni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szczepu BAT28 C. elegans
<ol>
	<li>Utrzymuj szczep robaka BAT288 zawierający transgeny otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] i ntIs1 [gcy-5prom::gfp] na bakteriach OP50 za pomocą standardowych płytek NGM-Agar w temperaturze 15 °C. 
	Uwaga: Szczegółowy protokół dotyczący hodowli nicieni można znaleźć na stronie 10. rol-6 (su1006) jest dominującym allelem i powszechnie stosowanym fenotypowym markerem iniekcji16, który powoduje typowy ruch toczenia. Jest używany w transgenie otIs305 do śledzenia hsp-16.2prom::che-1.
	<ol>
		<li>Utrzymuj szczep BAT28 w temperaturze 15 °C przez cały czas, aby zapobiec ostrożnej aktywacji transgenu hsp-16.2prom::che-1. Zmniejsz narażenie na temperatury wyższe niż 15 °C, jednocześnie radząc sobie z obciążeniem w jak największym stopniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zsynchronizować starzenie się robaków, użyj techniki wybielania17.
	<ol>
		<li>Zmyć 6 cm płytki agarowe NGM zawierające dorosłe osobniki i jaja BAT28 za pomocą 900 μl buforu M9. Robaki granulowane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodaj 0,5 – 1 ml roztworu wybielającego i potrząsaj probówką przez około 1 minutę, aż dorosłe robaki zaczną pękać. Monitoruj za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego.</li>
		<li>Robaki osadzane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Przemyć osad robaka 3 razy, dodając 800 μl buforu M9 i odwirowując przy 900 x g.</li>
		<li>Oczyszczone jaja umieszczamy na świeżych płytkach NGM wysianych bakteriami OP50. Wyhodować wybieloną populację na bakteriach OP50 w temperaturze 15 °C, aż osiągną stadium L4 (około 4 dni). Larwy L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie długości brzusznej strony robaka18 przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego. 
		Uwaga: Aby osiągnąć fenotyp konwersji komórki rozrodczej do neuronu po wyczerpaniu lin-53, musi on zostać zubożony w pokoleniu rodzicielskim (P0). Punktacja dla fenotypu konwersji jest przeprowadzana w następnym pokoleniu (pokolenie potomne F1). Aby osiągnąć zubożony lin-53 już w P0, zwierzęta L4 są poddawane działaniu RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręcznie przenieś 50 robaków etapowych L4 na replikę za pomocą platynowego drutu na płytkę NGM, która nie zawiera żadnych bakterii i pozwól robakom odsunąć się od przenoszonych bakterii OP50. Pozwól robakom poruszać się po talerzu przez około 5 minut. Użyj bakterii z płytek RNAi NGM-Agar uprzednio obsianych bakteriami lin-53 RNAi (lub kontrolą pustego wektora), aby przenieść się na odpowiednie płytki RNAi.
	<ol>
		<li>Unikaj przenoszenia bakterii OP50 na właściwe płytki RNAi. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas ekspozycji szczepu na temperatury wyższe niż 15 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować robaki na płytkach RNAi NGM-Agar w temperaturze 15 °C przez około 7 dni, aż potomstwo robaków F1 osiągnie stadium L3 – L4. Można je wyraźnie oddzielić od zwierząt P0, ponieważ są większe i grubsze niż potomstwo F1.
	<ol>
		<li>Sprawdź wzrokowo pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, czy robaki potomne F1 wykazują fenotyp wystającego sromu (pvul), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. RNAi przeciwko lin-53 ma działanie plejotropowe i powoduje fenotyp pvul, który można wykorzystać do oceny, czy RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem. 
		Uwaga: RNAi przeciwko lin-53 może również powodować śmiertelność zarodków F1. Efekt ten nasila się, jeśli płytki są wystawione na działanie temperatury wyższej niż 15 °C, zanim zwierzęta osiągną etap L3 – L4. Martwe zarodki można rozpoznać po zatrzymaniu rozwoju i braku wylęgu.</li>
		<li>Inkubuj płytki w ciemności, ponieważ IPTG jest wrażliwy na światło.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Indukcja przeprogramowania komórek rozrodczych
<ol>
	<li>Inkubować badane płytki RNAi zawierające lin-53 i puste potomstwo F1 potraktowane RNAi wektorem przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności w celu aktywacji CHE-1. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.</li>
	<li>Pozwolić zwierzętom, które poddały się szokowi cieplnemu, dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez noc w ciemności.</li>
	<li>Używając standardowego mikroskopu stereoskopowego sprzężonego z fluorescencyjnym źródłem światła, zbadaj zwierzęta pod filtrem GFP pod kątem sygnałów pochodzących z gcy-5prom::gfp w środkowej części ciała robaków, jak pokazano na Rysunek 2. Ustaw mikroskop dla sygnałów GFP: maksimum wzbudzenia przy 488 nm z maksimum emisji przy 509 nm.</li>
	<li>Oceń stopień konwersji komórki rozrodczej do neuronu, montując zwierzęta z sygnałami GFP w środkowej części ciała na szkiełkach mikroskopowych zawierających podkładkę agarową19.
	<ol>
		<li>Policz liczbę zwierząt wykazujących konwersję komórki rozrodczej do neuronu w porównaniu z ciemnymi zwierzętami, aby ocenić penetrację fenotypu. Zazwyczaj około 30% zwierząt wykazuje dyskretne sygnały GFP w linii zarodkowej po wyczerpaniu lin-53, podczas gdy nie więcej niż 5% zwierząt wykazuje rozproszone sygnały GFP w linii zarodkowej po pustym wektorze RNAi.  </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
<li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+barriers+and+enhancers%3A+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li>
<li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-Dependent+Heterochromatin%3A+Barrier+to+Cell+Fate+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Gent%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li>
<li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li>
<li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li>
<li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).</li>
<li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li>
<li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100(2017).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_introreversegenetics/introreversegenetics.html">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).</li>
<li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li>
<li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li>
<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
<li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_intromethodscellbiology/intromethodscellbiology.html">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Chociaż opisany protokół wykorzystujący transgeniczny szczep C. elegans BAT28 i RNAi przeciwko lin-53 jest prosty, kilka kroków ma kluczowe znaczenie w celu zapewnienia oczekiwanego wyniku przeprogramowania komórki rozrodczej w neuron. Ważne jest, aby szczep BAT28 był utrzymywany w temperaturze 15 °C przez cały czas przed eksperymentami. Podczas obchodzenia się z odmianą i jej konserwacji, czas przebywania w temperaturach powyżej 15 °C musi być jak najbardziej zminimalizowany. Odpowiednie warunki szoku cieplnego są ważne, ponieważ niewystarczająca indukcja nadekspresji che-1 nie spowoduje konwersji komórek rozrodczych do neuronów ASE. Można to wykryć, mierząc penetrację fenotypu, jak opisano w protokole. Rozległy szok cieplny może prowadzić do śmiertelności zwierząt. Na przykład płyty, które zostały umieszczone w pobliżu ścian wewnętrznych lub na dnie statycznego inkubatora powietrza, często są poddawane intensywnej obróbce cieplnej. Dlatego zaleca się stosowanie wentylowanego inkubatora ciepła. Dodatkowo, czas indukcji szoku cieplnego ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierna ekspresja che-1 podczas stadiów larwalnych wcześniej niż L3 może prowadzić do ektopowej indukcji gcy-5prom::gfp w różnych obszarach ciała, takich jak srom (Figura 3)9. Co więcej, rozległy szok cieplny można wykryć na podstawie penetracji fenotypu u zwierząt z pustym wektorem RNAi, która nie powinna sięgać 5% i zwiększonej autofluorescencji innych tkanek, a mianowicie jelita.
Sporadycznie bakterie RNAi mogą tracić swoją aktywność, aby efektywnie wytwarzać dsRNA docelowego genu. Niestety, nie można tego wykryć przed eksperymentem RNAi. W takich przypadkach należy wyhodować świeżą smugę z glicerolu, jak opisano w sekcji 2 protokołu. Jeśli nadal nie ma widocznego fenotypu plejotropowego spowodowanego przez RNAi, takiego jak fenotyp pvul spowodowany udanym RNAi przeciwko lin-53, należy przeprowadzić izolację plazmidowego DNA z odpowiednich bakterii i świeże bakterie HT115 muszą zostać przekształcone w plazmid L4400 zawierający sekwencję lin-53 .
Co ważne, szczep BAT28 ma fenotyp rolkowy spowodowany markerem iniekcyjnym pRF4, który był używany podczas transgenezy zwierząt z konstruktem DNA hsp-16.2prom::che-1 . Czasami zwierzęta tracą fenotyp toczenia, co może wskazywać na wyciszenie transgenu hsp-16.2prom::che-1 . Aby prawidłowo utrzymać szczep BAT28, wybierz 10 zwierząt rolkowych na świeży talerz i rozmnażaj, wybierając zwierzęta do toczenia.
Zastosowanie protokołu jest ograniczone do procedury F1 RNAi, co oznacza, że zwierzęta, których rodzice (pokolenie P0) nie byli narażeni na RNAi lin-53 , nie wykażą konwersji komórek rozrodczych do neuronów z powodu ratowania matki4. Alternatywna procedura przekształcania komórek rozrodczych w neurony została opisana przez Cioska i współpracowników15 przy użyciu knock-down RNAi gld-1 i mex-3 bez nadmiernej ekspresji czynnika transkrypcyjnego. Jednak uzyskane neurony nie należą do określonego typu neuronów, a komórki rozrodcze również przekształcają się w komórki mięśniopodobne po ubytku gld-1 i mex-315 za pośrednictwem RNAi. Wcześniej wykazano, że RNAi przeciwko lin-53 umożliwia konwersję komórek rozrodczych w komórki podobne do neuronów GABA-ergicznych po nadmiernej ekspresji czynnika transkrypcyjnego homedomeny typu Pitx UNC-3016 zamiast CHE-14. W przyszłości można przetestować różne czynniki transkrypcyjne indukujące los, czy komórki rozrodcze zubożone w lin-53 mogą zostać przekształcone w inne typy komórek niż określone neurony. W tym kontekście, nadekspresja miogennego czynnika transkrypcyjnego bHLH HLH-1, homologu ssaka MyoD17, indukuje konwersję komórki rozrodczej do mięśni na lin-53 RNAi5. Ustalone przeprogramowanie komórek rozrodczych do określonego typu komórek somatycznych na podstawie RNAi lin-53 i nadmierna ekspresja odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego indukującego los mogą być wykorzystane do wielu różnych genetycznych badań przesiewowych. Takie ekrany supresorowe lub wzmacniające mogą pomóc w przeanalizowaniu szlaków regulacyjnych, które odgrywają rolę podczas konwersji losu komórki.

Przeprogramowanie losu komórki poprzez ektopową ekspresję TF, taką jak miogenny TF MyoD, który po nadekspresji przekształca fibroblasty bezpośrednio w komórki mięśniopodobne1, jest przedmiotem badań od dziesięcioleci. Jednak zróżnicowane komórki są często oporne na ten proces ze względu na mechanizmy, które chronią ich tożsamość komórkową. Komórki rozrodcze wykazują podobny stopień ochrony i istnieją podstawowe mechanizmy, które często działają jako bariera zapobiegająca przekształcaniu się komórek rozrodczych w inne typy komórek w przypadku nadmiernej ekspresji TF wywołującego los. Zazwyczaj regulacja epigenetyczna, taka jak modyfikacje histonów i struktura chromatyny, stanowi przeszkodę w przekształcaniu losów komórek2,3. Wcześniej zastosowaliśmy genetykę odwrotną przy użyciu knock-downów RNAi u C. elegans i zidentyfikowaliśmy czynniki, które chronią tożsamość komórkową, a tym samym przeciwdziałają przeprogramowaniu komórek rozrodczych w neurony4. W szczególności kompleks represyjny polycomb 2 (PRC2) i wysoce konserwatywny opiekuńczy histon LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 u ludzi) zapobiegają bezpośredniej konwersji komórek rozrodczych w określone typy komórek somatycznych, takie jak neurony smaku glutaminergicznego u C. elegans4,5. Aby zidentyfikować te czynniki barierowe przeprogramowujące komórki rozrodcze, wykorzystaliśmy transgeniczne zwierzęta przenoszące indukowany szokiem cieplnym Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 ulega normalnej ekspresji w dwóch neuronach głowy C. elegans, gdzie określa los neuronów smaku glutaminergicznego określanych jako ASE6. Los neuronu ASE może być uwidoczniony przez ekspresję specyficznego dla ASE fluorescencyjnego reportera gcy-5prom::gfp. GCY-5 jest chemoreceptorem ulegającym ekspresji tylko w prawym neuronie ASE7. Po wyczerpaniu lin-53 przez RNAi i indukcji szerokiej ektopowej ekspresji CHE-1 przez szok cieplny, komórki rozrodcze mogą zostać przekształcone w neurony in vivo4,5. Co ważne, czas leczenia RNAi jest kluczowy, ponieważ tylko dorosłe robaki (pokolenie P0) wystawione na działanie RNAi lin-53 dają początek zwierzętom potomnym F1 z linią zarodkową, która jest dopuszczalna do przeprogramowania w neurony4.
Wyżej opisana procedura konwersji komórek rozrodczych w neurony u C. elegans może być wykorzystana do badania różnych zagadnień biologicznych, takich jak implikacje szlaków sygnałowych w przeprogramowywaniu losu komórki. Na przykład, użyliśmy indukowanego przez CHE-1 przeprogramowania komórek rozrodczych do neuronów ASE na RNAi przeciwko lin-53 w celu zbadania implikacji szlaku sygnałowego Notch w procesie przeprogramowania komórek rozrodczych8. Wykonując podwójne RNAi w celu jednoczesnego zubożenia lin-53 i genu kodującego demetylazę histonów utx-1, wykazaliśmy, że szlak sygnałowy Notch przeciwdziała wyciszaniu genów za pośrednictwem PRC2 poprzez aktywację ekspresji UTX-1 w klasie linii zarodkowej8. Odkrycie to pokazuje, że konwersja komórek rozrodczych do neuronów opisana w tym protokole może być wykorzystana do badania złożonego procesu biologicznego, takiego jak przeprogramowanie komórkowe w nienaruszonym organizmie oraz w kontekście różnych warunków rozwojowych i środowiskowych. Co więcej, daje perspektywę do rzucenia wyzwania komórkom rozrodczym poprzez nadmierną ekspresję różnych TF indukujących los w celu zbadania ich roli w ograniczaniu plastyczności komórkowej9 lub oceny ich potencjału do indukowania przeprogramowania komórek rozrodczych na inne typy komórek in vivo.
Podczas gdy hodowle tkanek ssaków pozwalają również badać różne aspekty przeprogramowania losu komórek, komórki hodowane w hodowli mają ograniczoną zdolność do naśladowania warunków szlaku sygnałowego w porównaniu do nienaruszonego organizmu. Dlatego C. elegans jest wszechstronnym modelem do badania ról różnych procesów biologicznych, takich jak sygnalizacja Notch podczas przeprogramowania in vivo. Ponadto jest to potężny model do badań genetycznych, który jest stosunkowo łatwy w utrzymaniu i modyfikacji genetycznej przy niskich kosztach.

<table><tbody><tr><td>Chemicals&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>do inkubatora szoku cieplnego</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>do utrzymania szczepów robaków w temperaturze 15 & deg; C lub 25 &deg; C</td></tr><tr><td>mikroskopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>M205 FA</td> Mikroskop <td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>(obrazowanie) + kamera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(obrazowanie) + kamera</td><td>Mikroskop stereoskopowy Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>bakteryjny szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizogen: lavUV5 promotor -Polimeraza T7) (indukowana przez IPTG polimeraza T7) (RNAse III minus).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Uracil auksotrof, szczep E. coli</td></tr><tr><td>Worm szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>pochodzi z OH9846 przez 4x więcej krzyżówek wstecznych z</td></tr> <tr><td>klonami N2RNAi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Biblioteka Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>pusty vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robak&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wykonane samodzielnie przy użyciu pipety Pasteura i drutu platynowego</td></tr></tbody></table>

zastosowanie rnai i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Badanie procesów biologicznych komórek podczas przekształcania tożsamości określonych typów komórek dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmu, który utrzymuje i chroni tożsamość komórkową. Przekształcanie komórek rozrodczych w specyficzne neurony u nicienia Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest potężnym narzędziem do przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych w celu przeanalizowania szlaków regulacyjnych, które chronią ustaloną tożsamość komórki. Przeprogramowanie komórek rozrodczych na określony typ neuronów określany jako ASE wymaga transgenicznych zwierząt, które pozwalają na szeroką nadekspresję czynnika transkrypcyjnego Zn-palca (TF) CHE-1. Endogenny CHE-1 ulega ekspresji wyłącznie w dwóch neuronach głowy i jest wymagany do określenia losu glutaminergicznego neuronu ASE, który może być łatwo zobrazowany przez reportera gcy-5prom::gfp. Gen trans zawierający konstrukt ekspresji genu che-1 napędzany przez promotor szoku cieplnego pozwala na szeroką błędną ekspresję CHE-1 u całego zwierzęcia po leczeniu szokiem cieplnym. Połączenie RNAi przeciwko czynnikowi regulującemu chromatynę LIN-53 i nadmierna ekspresja che-1 wywołana szokiem cieplnym prowadzi do przeprogramowania komórki rozrodczej w komórki podobne do neuronów ASE. Opisujemy tutaj specyficzną procedurę RNAi i odpowiednie warunki leczenia szokiem cieplnym zwierząt transgenicznych w celu skutecznego wywołania konwersji komórek rozrodczych do neuronów.

Jak pokazano na Rysunku 1, osobniki F1 wykazujące fenotyp pvul ilustrują skuteczne zastosowanie RNAi przeciwko lin-53. Zwierzęta te są podatne na konwersję komórek zarodkowych w komórki podobne do neuronów ASE po indukcji szokiem termicznym nadekspresji che-1, co przedstawiono na Rysunku 2. W przeciwieństwie do nicieni hodowanych na kontrolnym pustym wektorze, traktowanie RNAi lin-53 doprowadzi do uzyskania osobników wykazujących ektopowe sygnały GFP w obrębie środkowej części ciała po szoku termicznym i inkubacji w temperaturze 25 °C przez noc, zgodnie z wcześniejszym opisem4,8. Dokładniejsza analiza tych nicieni pod mikroskopem epifluorescencyjnym wykazuje, że komórki emitujące sygnały GFP wykazują również wypustki podobne do neuronalnych (Rysunek 2B, białe strzałki), które są typowe dla komórek nerwowych. Jeśli RNAi przeciwko lin-53 nie powiodło się lub warunki szoku termicznego były niewłaściwe, sygnały GFP będą przypominać te u zwierząt traktowanych kontrolnym RNAi (Rysunek 2). Ważne jest, aby unikać indukcji nadekspresji che-1 za pomocą szoku termicznego przed osiągnięciem przez zwierzęta połowy stadium L3. Zwierzęta, które były zbyt młode w momencie indukcji nadekspresji che-1, mogą wykazywać ektopową ekspresję gcy-5prom::gfp w innych regionach ciała, takich jak rozwijająca się vulva, co pokazano na Rysunku 313.
<img alt="Eksperyment RNAi u Caenorhabditis elegans, obraz mikroskopowy przedstawiający próbki kontrolne oraz próbki poddane działaniu RNAi przeciwko lin-53." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Fenotyp Pvul wywołany przez RNAi przeciwko lin-53. (Góra) Obraz DIC nicieni potomstwa F1 w stadium L4/młodego dorosłego, pochodzących z grupy kontrolnej lub lin-53 Matki poddane RNAi. Paski skali = 20 µm. (Na dole) Zwierzęta traktowane lin-53 RNAi wywołuje wysunięcie wulwy (pvul) fenotyp (czarne groty strzałek). The pvul fenotyp potwierdza, że RNAi przeciwko lin-53 odniosło sukces. Paski skali = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment RNAi u C. elegans z wykorzystaniem DIC i fluorescencji GFP do analizy ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Nicienie z pomyślnie przeprogramowanymi komórkami linii zarodkowej w neurony. (AZwierzęta szczepu BAT28 hodowane na pustym wektorze nie wykazują sygnałów GFP w linii zarodkowej po indukcji szokiem termicznym che-1 nadekspresja. Przerywana biała linia obrysowuje nicienia. Paski skali = 20 µm. (B) W przeciwieństwie do zwierząt szczepu BAT28 hodowanych na kontrolnym pustym wektorze, zwierzęta RNAi hodowane na lin-53 Prezentacja RNAi gcy-5prom::gfp sygnały w obszarze środkowej części ciała. Zdjęcia przekroju środkowej części ciała z sygnałami GFP wykonane przy powiększeniu 63X ujawniają komórki GFP-dodatnie wykazujące wypustki (białe groty strzałek). Ta cecha morfologiczna wskazuje, że komórki linii zarodkowej uległy przekształceniu w komórki przypominające neurony ASE. Białe gwiazdki oznaczają autofluorescencję pochodzącą z jelita. Wszystkie zdjęcia zostały wykonane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z powiększeniem 20X oraz 63X. Biała przerywana linia obrysowuje nicienie. Paski skali = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Indukowana ekspresja hsp::che-1 u C. elegans, mikroskopia DIC i fluorescencyjna gcy-5prom::gfp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Nicień we wczesnym stadium rozwoju z ektopową ekspresją GFP. Zwierzęta szczepu BAT28 hodowane na bakteriach RNAi z pustym wektorem, które poddano indukcji szokiem termicznym przez che-1 nadekspresja we wczesnych stadiach larwalnych, takich jak L2, wykazuje sygnały GFP w obszarze środkowej części ciała (białe gwiazdki). Sygnały te nie wynikają z reprogramowania komórek zarodkowych. Przerywana biała linia obrysowuje nicienia. Paski skali = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie konwersji komórek rozrodczych do neuronów u C. elegans. Metoda ta może pomóc w badaniu wpływu procesów biologicznych, takich jak szlaki sygnałowe lub epigenetyka, w regulację przeprogramowania losu komórkowego. Główną zaletą metody opisanej w tym filmie jest to, że u żywych zwierząt komórki rozrodcze mogą być prowokowane przez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego indukującego los.Równolegle można przeprowadzić genetyczne badanie przesiewowe, takie jak badanie przesiewowe RNAi, w celu zidentyfikowania nowych czynników, które są zaangażowane w regulację przeprogramowania komórkowego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii regeneracyjnej. Ponieważ ta metoda in vivo może być wykorzystana do badania przeprogramowania komórkowego w różnych warunkach rozwojowych i środowiskowych.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki przeprogramowania są trudne do nauczenia. Ponieważ fenotyp konwersji komórki rozrodczej do neuronu, po wyczerpaniu lin-53, zachodzi tylko w starannie kontrolowanych warunkach. W przypadku płytek RNAi należy obciążyć sześciocentymetrowe płytki agarem NGM zawierającym IPTG i karbenicyninę.Pozostaw je do wyschnięcia na 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przenieś je do czterech stopni Celsjusza na okres do 14 dni. Następnie selektywne płytki smugowe zawierające karbenicylinę i tetracyklinę z klonami bakterii RNAi z plazmidem L4440 przenoszącym gen lin-53.Użyj trójfazowego wzoru smug i upewnij się, że umieściłeś pustą kontrolkę wektorową. Następnie hoduj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz co najmniej trzy pojedyncze kolonie i zaszczep każdą z nich w oddzielnej probówce hodowlanej z dwoma mililitrami LB, uzupełnionymi karbenicyliną, ale nie tetracykliną.Zaplanuj trzy zdrowe kultury na warunek. Następnie hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,6 do 0,8. Następnie dodaj 500 mikrolitrów każdej kultury bakteryjnej do sześciocentymetrowej płytki RNAi agaru NGM.Inkubować płytki przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Protokół ten jest zoptymalizowany dla robaków szczepu BAT28 utrzymywanych w temperaturze 15 stopni Celsjusza, przy której transgeny są najbardziej stabilne. Szczegółowe informacje na temat genetyki szczepu znajdują się w tekście.Synchronizacja wieku robaków ma kluczowe znaczenie. Użyj techniki wybielania. Umyj sześciocentymetrowe płytki agarowe NGM zawierające dorosłe osobniki i jaja za pomocą 800 mikrolitrów M9. Następnie otulić robaki przez odwirowanie i usunąć supernatant.Następnie dodaj 1/2 do jednego mililitra roztworu wybielającego do robaków. Obserwując robaki pod stereoskopem, potrząsaj rurką, aż dorosłe robaki zaczną pękać, a następnie zbierz jaja. Teraz oddziel odpadki od jaj.Najpierw odwirować probówkę i usunąć supernatant. Następnie trzykrotnie umyj osad chusteczek 800 mikrolitrami M9. Pamiętaj, aby użyć wirowania, aby zebrać tkanki między praniami.Teraz przenieś oczyszczone jaja na świeże płytki NGM obsiane bakteriami OP50. Krótko sprawdź, czy udało się wyizolować zarodki i przenieść je na płytki NGM. Hoduj zwierzęta w temperaturze 15 stopni Celsjusza.Aby osiągnąć konwersję komórki rozrodczej do neuronu po wyczerpaniu lin-53, zubożenie musi rozpocząć się w pokoleniu rodzicielskim. Aby zubożyć lin-53, poddaj zwierzęta L4 działaniu RNAi. Ręcznie przenieś 50 robaków L4 na replikę na płytkę RNAi NGM bez bakterii.Użyj drutu platynowego. Robaki L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie ich brzusznych boków. Teraz wysiaduj robaki w temperaturze 15 stopni Celsjusza w ciemności przez około siedem dni.IPTG jest światłoczuły. Kiedy potomstwo F1 osiągnie stadium L3 i L4, oddziel je od większych, grubszych zwierząt rodzicielskich. W tym momencie należy przebadać F1 pod kątem fenotypu wystającego sromu, co wskazuje, że RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem.Aktywność RNAi może również powodować śmiertelność, która wzrasta powyżej 15 stopni Celsjusza. Aby aktywować che-1 i indukować konwersję komórki rozrodczej do neuronu w potomstwie F1, należy poddawać robaki szokowi cieplnemu przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.Po szoku cieplnym inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc w ciemności. Ważne jest, aby unikać wywoływania nadekspresji che-1 przez szok cieplny, zanim zwierzęta osiągną połowę stadium L3. Może to prowadzić do ekspresji białka che-1 w tkankach niedocelowych.Następnego dnia ustaw fluorescencyjne źródło światła i filtr GFP, aby zbadać zwierzęta pod kątem fluorescencji pochodzącej z transgenu w obszarze środkowej części ciała. Aby ocenić penetrację fenotypu, znajdź stosunek zwierząt emitujących sygnał fluorescencyjny. Zazwyczaj około 30% pokaże dyskretny sygnał GFP.Dla porównania, u zwierząt będących nosicielami pustego wektora RNAi nawet sygnał rozproszony w linii zarodkowej nie jest obserwowany u więcej niż 5% populacji. Zwierzęta F1, które wykazują fenotyp wystającego sromu, ilustrują udane zastosowanie lin-53 RNAi. U tych zwierząt powszechna jest transformacja komórek rozrodczych w komórki podobne do neuronów ASE po indukcji che-1 przez szok cieplny.Dokładne badanie ujawnia wypustki podobne do neuronów, które są typowe dla neuronów z komórek linii rozrodczej. W przeciwieństwie do tego, puste kontrole wektorowe wykazywały minimalną ekspresję GFP, która była co najwyżej rozproszona. Komórki rozrodcze u tych zwierząt nie miały cech przypominających neurony.Kiedy zwierzęta były zbyt młode w momencie indukcji nadekspresji che-1, często wykazywały ektopową ekspresję transgenu w innych obszarach ciała, takich jak rozwijający się srom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak starannie planować i przeprowadzać eksperymenty z użyciem żywych robaków w celu przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony. Metoda opisana w tym filmie pozwoli Ci teraz zbadać implikacje wielu różnych czynników w regulacji przeprogramowania komórkowego.Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu 10 dni. Podczas eksperymentu ważne jest, aby dokładnie ustawić zwierzęta przed indukcją przeprogramowania i utrzymać szczep BAT28 w temperaturze 15 stopni. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak podwójne RNAi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Jakie są podstawowe mechanizmy, które odgrywają rolę podczas konwersji losu komórki?

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Ten film opisuje zasady leczenia RNAi u C. elegans i demonstruje protokół do eliminacji lin-35 w transgenicznym szczepie robaków.

Posiewanie RNAi dla karmienia C. elegans: technika indukowania docelowej ekspresji dsRNA w E. coli

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

Ten film pokazuje przeprogramowanie losu komórek rozrodczych nicieni na neurony. Transgeniczne larwy nicienia Caenorhabditis elegans są poddawane interferencji RNA (RNAi) w celu powalenia określonego czynnika regulującego chromatynę, co sprawia, że komórki rozrodcze ich potomstwa są bardziej podatne na przeprogramowanie losu komórki. Szok cieplny jest stosowany do potomstwa, indukując komórki rozrodcze do ekspresji specyficznego dla neuronów czynnika transkrypcyjnego, który wyzwala ich...

Przeprogramowanie losu komórki komórek rozrodczych nicieni na neurony

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Poznaj metodę przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans przy użyciu RNAi i szoku cieplnego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji tożsamości komórkowej in vivo.

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów