Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans
1 stycznia 2018
Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie konwersji komórek rozrodczych do neuronów u C. elegans. Metoda ta może pomóc w badaniu wpływu procesów biologicznych, takich jak szlaki sygnałowe lub epigenetyka, w regulację przeprogramowania losu komórkowego. Główną zaletą metody opisanej w tym filmie jest to, że u żywych zwierząt komórki rozrodcze mogą być prowokowane przez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego indukującego los.
Równolegle można przeprowadzić genetyczne badanie przesiewowe, takie jak badanie przesiewowe RNAi, w celu zidentyfikowania nowych czynników, które są zaangażowane w regulację przeprogramowania komórkowego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii regeneracyjnej. Ponieważ ta metoda in vivo może być wykorzystana do badania przeprogramowania komórkowego w różnych warunkach rozwojowych i środowiskowych.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki przeprogramowania są trudne do nauczenia. Ponieważ fenotyp konwersji komórki rozrodczej do neuronu, po wyczerpaniu lin-53, zachodzi tylko w starannie kontrolowanych warunkach. W przypadku płytek RNAi należy obciążyć sześciocentymetrowe płytki agarem NGM zawierającym IPTG i karbenicyninę.
Pozostaw je do wyschnięcia na 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przenieś je do czterech stopni Celsjusza na okres do 14 dni. Następnie selektywne płytki smugowe zawierające karbenicylinę i tetracyklinę z klonami bakterii RNAi z plazmidem L4440 przenoszącym gen lin-53.
Użyj trójfazowego wzoru smug i upewnij się, że umieściłeś pustą kontrolkę wektorową. Następnie hoduj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz co najmniej trzy pojedyncze kolonie i zaszczep każdą z nich w oddzielnej probówce hodowlanej z dwoma mililitrami LB, uzupełnionymi karbenicyliną, ale nie tetracykliną.
Zaplanuj trzy zdrowe kultury na warunek. Następnie hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,6 do 0,8. Następnie dodaj 500 mikrolitrów każdej kultury bakteryjnej do sześciocentymetrowej płytki RNAi agaru NGM.
Inkubować płytki przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Protokół ten jest zoptymalizowany dla robaków szczepu BAT28 utrzymywanych w temperaturze 15 stopni Celsjusza, przy której transgeny są najbardziej stabilne. Szczegółowe informacje na temat genetyki szczepu znajdują się w tekście.
Synchronizacja wieku robaków ma kluczowe znaczenie. Użyj techniki wybielania. Umyj sześciocentymetrowe płytki agarowe NGM zawierające dorosłe osobniki i jaja za pomocą 800 mikrolitrów M9. Następnie otulić robaki przez odwirowanie i usunąć supernatant.
Następnie dodaj 1/2 do jednego mililitra roztworu wybielającego do robaków. Obserwując robaki pod stereoskopem, potrząsaj rurką, aż dorosłe robaki zaczną pękać, a następnie zbierz jaja. Teraz oddziel odpadki od jaj.
Najpierw odwirować probówkę i usunąć supernatant. Następnie trzykrotnie umyj osad chusteczek 800 mikrolitrami M9. Pamiętaj, aby użyć wirowania, aby zebrać tkanki między praniami.
Teraz przenieś oczyszczone jaja na świeże płytki NGM obsiane bakteriami OP50. Krótko sprawdź, czy udało się wyizolować zarodki i przenieść je na płytki NGM. Hoduj zwierzęta w temperaturze 15 stopni Celsjusza.
Aby osiągnąć konwersję komórki rozrodczej do neuronu po wyczerpaniu lin-53, zubożenie musi rozpocząć się w pokoleniu rodzicielskim. Aby zubożyć lin-53, poddaj zwierzęta L4 działaniu RNAi. Ręcznie przenieś 50 robaków L4 na replikę na płytkę RNAi NGM bez bakterii.
Użyj drutu platynowego. Robaki L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie ich brzusznych boków. Teraz wysiaduj robaki w temperaturze 15 stopni Celsjusza w ciemności przez około siedem dni.
IPTG jest światłoczuły. Kiedy potomstwo F1 osiągnie stadium L3 i L4, oddziel je od większych, grubszych zwierząt rodzicielskich. W tym momencie należy przebadać F1 pod kątem fenotypu wystającego sromu, co wskazuje, że RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem.
Aktywność RNAi może również powodować śmiertelność, która wzrasta powyżej 15 stopni Celsjusza. Aby aktywować che-1 i indukować konwersję komórki rozrodczej do neuronu w potomstwie F1, należy poddawać robaki szokowi cieplnemu przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.
Po szoku cieplnym inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc w ciemności. Ważne jest, aby unikać wywoływania nadekspresji che-1 przez szok cieplny, zanim zwierzęta osiągną połowę stadium L3. Może to prowadzić do ekspresji białka che-1 w tkankach niedocelowych.
Następnego dnia ustaw fluorescencyjne źródło światła i filtr GFP, aby zbadać zwierzęta pod kątem fluorescencji pochodzącej z transgenu w obszarze środkowej części ciała. Aby ocenić penetrację fenotypu, znajdź stosunek zwierząt emitujących sygnał fluorescencyjny. Zazwyczaj około 30% pokaże dyskretny sygnał GFP.
Dla porównania, u zwierząt będących nosicielami pustego wektora RNAi nawet sygnał rozproszony w linii zarodkowej nie jest obserwowany u więcej niż 5% populacji. Zwierzęta F1, które wykazują fenotyp wystającego sromu, ilustrują udane zastosowanie lin-53 RNAi. U tych zwierząt powszechna jest transformacja komórek rozrodczych w komórki podobne do neuronów ASE po indukcji che-1 przez szok cieplny.
Dokładne badanie ujawnia wypustki podobne do neuronów, które są typowe dla neuronów z komórek linii rozrodczej. W przeciwieństwie do tego, puste kontrole wektorowe wykazywały minimalną ekspresję GFP, która była co najwyżej rozproszona. Komórki rozrodcze u tych zwierząt nie miały cech przypominających neurony.
Kiedy zwierzęta były zbyt młode w momencie indukcji nadekspresji che-1, często wykazywały ektopową ekspresję transgenu w innych obszarach ciała, takich jak rozwijający się srom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak starannie planować i przeprowadzać eksperymenty z użyciem żywych robaków w celu przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony. Metoda opisana w tym filmie pozwoli Ci teraz zbadać implikacje wielu różnych czynników w regulacji przeprogramowania komórkowego.
Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu 10 dni. Podczas eksperymentu ważne jest, aby dokładnie ustawić zwierzęta przed indukcją przeprogramowania i utrzymać szczep BAT28 w temperaturze 15 stopni. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak podwójne RNAi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Jakie są podstawowe mechanizmy, które odgrywają rolę podczas konwersji losu komórki?
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę badania procesów komórkowych podczas konwersji komórek linii zarodkowej w neurony in vivo u Caenorhabditis elegans. Dzięki wykorzystaniu zwierząt transgenicznych badacze mogą obserwować efekty nadekspresji czynnika transkrypcyjnego CHE-1, indukującego los neuronów, oraz wyciszenia czynnika regulującego chromatynę LIN-53 za pomocą interferencji RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Zrozumienie przeprogramowania losu komórkowego jest kluczowe dla poznania biologii rozwoju.
- Modele transgeniczne umożliwiają obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Znane jest, że LIN-53 odgrywa rolę w regulacji chromatyny i tożsamości komórkowej.
- CHE-1 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który może indukować los neuronalny.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów leżących u podstaw konwersji komórek linii zarodkowej w neurony.
- Zbadanie roli szlaków sygnałowych i czynników epigenetycznych w przeprogramowaniu komórkowym.
- Opracowanie metody, która może zostać zastosowana w badaniach nad terapią regeneracyjną.
Zastosowane metody
- Transgeniczne *C. elegans* wykazujące ekspresję CHE-1 pod promotorem szoku termicznego.
- Interferencja RNA w celu wyczerpania LIN-53 w komórkach linii zarodkowej.
- Synchronizacja wieku nicieni z wykorzystaniem techniki wybielania.
- Obróbka szokiem termicznym w celu indukowania ekspresji CHE-1 w określonych etapach rozwoju.
Główne wyniki
- Po wyczerpaniu LIN-53 zaobserwowano pomyślną konwersję komórek zarodkowych w komórki neuronopodobne.
- Około 30% potomstwa F1 wykazywało sygnał fluorescencyjny wskazujący na pomyślną ekspresję transgenu.
- Grupy kontrolne z RNAi pustego wektora wykazywały minimalną fluorescencję, co potwierdza specyficzność metody.
- Analiza fenotypowa ujawniła wypustki neuronopodobne w konwertowanych komórkach.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia wiarygodną metodę badania przeprogramowania komórkowego in vivo.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia regulacji tożsamości komórkowej oraz potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
- Opanowanie tej techniki może ułatwić dalsze badania nad czynnikami przeprogramowania komórkowego.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przeprogramowanie komórek linii zarodkowej w neurony u C. elegans umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów tożsamości komórkowej oraz regulacji epigenetycznej w żywym systemie. Podejście to wspiera wysoką wiarygodność walidacji celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do szlaków zaangażowanych w decyzje o losie komórki. Metoda ta jest strategicznym narzędziem dla zespołów zajmujących się wczesnym etapem odkryć, dążących do przeanalizowania sieci regulacyjnych chroniących tożsamość komórkową i stanowiących podstawę strategii regeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną regulatorów chromatyny i czynników transkrypcyjnych w reprogramowaniu losów komórek.
- Wspiera badania przesiewowe genetycznie w celu zidentyfikowania nowych modulatorów utrzymania tożsamości komórkowej.
- Ułatwia analizę mechaniczną poprzez izolację wpływu specyficznych zaburzeń genetycznych na wyniki reprogramowania.
- Zapewnia kontekst żywego organizmu dla wyjaśnienia szlaków sygnałowych i testowania hipotez.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia solidny system in vivo do przesiewów genetycznych opartych na RNAi, celujących w czynniki reprogramowania.
- Zapewnia ilościowe odczyty oparte na fluorescencji w celu standaryzacji i powtarzalności testu.
- Umożliwia skalowalną ocenę funkcji genów w wielu warunkach i na różnych etapach rozwoju.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych przesiewów związków chemicznych lub modyfikatorów genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z pytaniami dotyczącymi chorób w zakresie plastyczności komórkowej i potencjału regeneracyjnego.
- Zapewnia ciągłość od genetycznych odkryć na etapie badań podstawowych do rozwoju modeli przedklinicznych.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie celów terapeutycznych zaangażowanych w regulację losów komórek.
- Oferuje predykcyjne informacje na temat wykonalności strategii terapeutycznych opartych na przeprogramowaniu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje etap wczesnego etapu odkrywania z identyfikacją wiodących związków, umożliwiając prowadzenie genetycznych przesiewów opartych na hipotezach oraz funkcjonalną walidację czynników reprogramujących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych dotyczących funkcji genów w konwersji losu komórek.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji do porównań między różnymi warunkami.
- Analityka: Zapewnia statystyczne dane o penetracji, które pomagają w podejmowaniu decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z opracowaniem modeli przedklinicznych, gdy są one zgodne ze ścieżkami istotnymi dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz genetycznych i epigenetycznych dla różnych celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad losem komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w reprogramowaniu in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka hipotez biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków w oparciu o dostosowane do ryzyka kryteria w celu ich dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w genetyce C. elegans, RNAi oraz obsłudze szczepów transgenicznych.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i aparatury do kontrolowanego szoku termicznego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów indukcji i określania stadiów rozwojowych zwierząt pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
- Penetracja i specyficzność fenotypu są wrażliwe na czas rozwoju oraz warunki środowiskowe.
