Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym
23 lutego 2018
Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.
Cześć, nazywam się Joseph DeShields, pracuję na Wydziale Patologii Roślin na Uniwersytecie Stanowym w Waszyngtonie i dzisiaj pokażę wam protokół wykrywania chorób przenoszonych przez glebę na miejscu. Diagnozowanie na miejscu chorób roślin na polu ma kluczowe znaczenie dla skutecznego zarządzania chorobami i może ostatecznie ograniczyć wtórne rozprzestrzenianie się patogenów na polu. Patogeny przenoszone przez glebę są szczególnie trudne do zdiagnozowania ze względu na duże i złożone środowisko glebowe, co może utrudniać zrozumienie chorób przenoszonych przez glebę. Reakcja łańcuchowa polimerazy, znana również jako PCR, jest obecnie najszerzej akceptowanym czułym i dokładnym podejściem do wykrywania patogenów roślinnych w terenie. Poniższy protokół przedstawia czułą i dostępną na miejscu metodę wykrywania patogenów przenoszonych przez glebę, składającą się z ekstrakcji DNA na bazie kulek magnetycznych, PCR, którą można wykonać za pomocą przenośnego urządzenia do PCR, oraz analizy danych, którą można wykonać zdalnie, za pomocą laptopa. Ekstrakcja DNA za pomocą kulek magnetycznych. Zestaw do ekstrakcji DNA i RNA został przygotowany i używany zgodnie z instrukcją producenta z niewielkimi modyfikacjami. Wszystkie odczynniki przechowywano w temperaturze pokojowej, a przygotowaną proteinazę K przechowywano w temperaturze 20
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym do diagnostyki patogenów roślin przenoszonych przez glebę w miejscu pobrania próbek. Szybka detekcja jest niezbędna dla skutecznego zarządzania chorobami i zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorób roślin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fitopatologia
- Mikrobiologia gleby
- Diagnostyka polowa
Wstęp
- Patogeny glebowe są trudne do zdiagnozowania ze względu na złożone środowisko glebowe.
- Diagnostyka w miejscu występowania patogenów jest kluczowa dla skutecznego zwalczania chorób roślin.
- Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest powszechnie uznaną metodą wykrywania patogenów.
- Przenośne systemy PCR umożliwiają prowadzenie diagnostyki w terenie.
Cel badania
- Opracowanie czułej i dokładnej metody wykrywania patogenów glebowych.
- Przedstawienie zastosowania przenośnego systemu PCR do diagnostyki w terenie.
- Ograniczenie wtórnego rozprzestrzeniania się patogenów w środowisku rolniczym.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych.
- Kwantytatywna PCR (real-time PCR) do wykrywania patogenów.
- Użycie przenośnego urządzenia do PCR w analizach terenowych.
- Zdalna analiza danych z wykorzystaniem laptopa.
Główne wyniki
- Opracowana metoda umożliwia szybką detekcję patogenów glebowych.
- Warunki terenowe mogą być skutecznie zarządzane przy użyciu tego przenośnego systemu.
- Diagnostyka w miejscu poboru próbek może zapobiec dalszej produkcji inokulum.
- Protokół jest możliwy do dostosowania do różnych środowisk glebowych.
Wnioski
- Przenośny system PCR zwiększa możliwość diagnozowania patogenów glebowych w terenie.
- Szybka i dokładna detekcja jest niezbędna dla skutecznego zarządzania chorobami.
- Metoda ta może w znacznym stopniu przyczynić się do ograniczenia rozprzestrzeniania się chorób roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka detekcja patogenów glebowych w miejscu ich występowania umożliwia timely interwencję w procesach biotechnologii rolniczej, co ogranicza straty w plonach i wspiera strategie predykcyjnego zarządzania chorobami. Przenośna diagnostyka molekularna stanowi pomost pomiędzy pobieraniem próbek w terenie a walidacją laboratoryjną, przyspieszając proces podejmowania decyzji na wczesnych etapach opracowywania środków agrochemicznych i biopestycydów. Podejście to usprawnia walidację celów w badaniach nad interakcjami między rośliną a patogenem, dostarczając mierzalnych i powtarzalnych danych o ładunku patogenu bezpośrednio z złożonych matryc środowiskowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną walidację czynników wirulencji patogenów poprzez ilościowe wykrywanie kopii DNA w glebie.
- Wartość operacyjna: Wspiera testowanie hipotez w procesach walidacji celów poprzez dostarczanie powtarzalnej kwantyfikacji patogenów z próbek pobranych w terenie.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź dla przesiewu związków przeciwdrobnoustrojowych lub przełamujących oporność w realistycznych warunkach środowiskowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość testu: Ekstrakcja kwasów nukleinowych z wykorzystaniem kulek magnetycznych zapewnia standaryzowane, odporne na inhibitory przygotowanie próbek do wysokoprzepustowego wykrywania patogenów.
- Wynik ilościowy: Real-time PCR z wykorzystaniem sond fluorogennych dostarcza wartości Ct umożliwiających określenie granicy wykrywalności (nawet do 100 kopii) w celu optymalizacji testu.
- Przenoszalność platformy: Kompatybilność protokołu z urządzeniami przenośnymi wspiera zdecentralizowane procesy przesiewowe w geograficznie rozproszonych ośrodkach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Wykorzystuje Spongospora subterranea w macierzach glebowych do modelowania rzeczywistych wyzwań związanych z detekcją patogenów w uprawach bulwiastych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy opracowywanie analiz laboratoryjnych z diagnostyką możliwą do zastosowania w terenie, zmniejszając ryzyko translacyjne w biotechnologii rolniczej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia monitorowanie dynamiki ładunku patogenów w celu oceny mechanizmu działania środków biologicznych lub chemicznych środków ochronnych stosowanych do gleby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do zastosowań translacyjnych, umożliwiając wczesną kwantyfikację patogenów w procesie walidacji celów, wspierając standaryzację testów w badaniach przesiewowych oraz dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w fazie przedklinicznego rozwoju środków ochrony roślin.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań patogen-gospodarz poprzez precyzyjną kwantyfikację docelowego DNA w naturalnych środowiskach glebowych.
- Screening: Zapewnia ustandaryzowane, ilościowe wyniki detekcji patogenów, odpowiednie do oceny bibliotek związków w formatach testów opartych na glebie.
- Analityka: Generuje powtarzalne wartości Ct oraz krzywe amplifikacji, które umożliwiają statystyczne porównanie efektów zabiegów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przejścia od kontrolowanych testów laboratoryjnych do badań walidacyjnych w terenie poprzez zachowanie sprawności testu w różnych typach próbek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy przenośną, powtarzalną platformę detekcji patogenów, którą można zastosować w wielu systemach uprawa-patogen w globalnych sieciach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad interakcjami roślin i patogenów, dostarczając dokładnych, zwalidowanych w warunkach polowych pomiarów ładunku patogenu.
- Wartość operacyjna: zwiększa powtarzalność i skalowalność wykrywania patogenów w różnych lokalizacjach polowych dzięki standaryzowanym protokołom ekstrakcji i amplifikacji.
- Wartość strategiczna: zwiększa pewność podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w programach ochrony roślin na wczesnym etapie poprzez redukcję odsetka wyników fałszywie ujemnych w detekcji patogenów.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację głównych kandydatów w oparciu o analizę ryzyka oraz wykazaną skuteczność w realistycznych warunkach presji patogenów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu diagnostyki molekularnej i fitopatologii w celu zaprojektowania testu oraz interpretacji wyników.
- Zależność od dostępu do przenośnych urządzeń do PCR w czasie rzeczywistym oraz kompatybilnych zestawów sond fluorogenicznych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów pobierania i przetwarzania próbek we wszystkich punktach terenowych w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Należy uwzględnić inhibitory PCR pochodzące z gleby poprzez walidację wydajności ekstrakcji opartej na kuleczkach magnetycznych w analizowanych macierzach.
- Metoda ograniczona do detekcji kwasów nukleinowych; nie ocenia żywotności ani zakaźności patogenu bez zastosowania uzupełniających testów.
