Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem tej techniki jest przetestowanie wpływu różnych związków na organizmy modelowe C.elegans w teście wysokoprzepustowym. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chemii, biologii i starzenia, takie jak to, czy określone struktury chemiczne przedłużają żywotność C.elegans? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przesiewanie wielu związków w sposób efektywny czasowo i szybko.

Aby przygotować płytki do hodowli masowych do produkcji dużej liczby robaków, w komorze z przepływem laminarnym najpierw dozuj 30 mililitrów pożywki do wzrostu nicieni o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 10-centymetrowe płytki hodowlane w celu zestalenia przez noc. Następnego ranka dodaj dwa mililitry skoncentrowanej E. coli na każdą płytkę, przechylając i obracając płytkę, aby całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni płytki. Gdy płytki z kultur masowych wyschną, przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni.

Aby przygotować wysokoprzepustowe płytki hodowlane do badań przesiewowych, użyj automatycznego ośmiokanałowego dozownika, aby dodać 0,15 mililitra stopionego agaru do wzrostu pożywki do wzrostu nicieni do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. Pozostaw agar do zestalenia się na noc. Następnie przechowuj płytki testowe o wysokiej przepustowości w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni.

Aby ustawić kultury C.elegans, użyj kilofa do robaków i mikroskopu preparacyjnego, aby przenieść 20 jaj na każdą płytkę do hodowli masowej i inkubować płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez sześć dni. Siódmego dnia użyj mikroskopu preparacyjnego, aby wizualnie potwierdzić obecność jaj w macicy. Aby zebrać ciężarne dorosłe osobniki, użyj szklanej pipety, aby dodać od dwóch do trzech mililitrów roztworu S Basal na płytkę i ręcznie obracać roztwory wokół każdej płytki.

Użyj szklanej pipety, aby przenieść robaki do 15-mililitrowej probówki i granulować robaki przez odwirowanie. Ponownie zawieś robaki w 10 mililitrach roztworu podchlorynu i szybko potrząsaj probówkami w górę iw dół przez pięć sekund. Następnie inkubuj robaki przez pięć minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem co 2,5 minuty.

Pod koniec inkubacji ponownie odwirować robaki. Granulki powinny być żółtawobrązowe. Zastąp supernatanty 10 mililitrami świeżego roztworu podchlorynu i ponownie energicznie potrząśnij probówką.

Wysiaduj robaki przez kolejną jedną do trzech minut, od czasu do czasu potrząsając. Gdy pozostaną tylko jaja, odwirować probówki i odessać supernatanty. Granulki powinny być białe, bez brązowego zabarwienia.

Stosując sterylną technikę, otwórz probówki w sterylnej komorze z przepływem laminarnym i dodaj 14 mililitrów roztworu S Basal do każdej granulki. Umyj granulkę trzykrotnie 14 mililitrami S Basal. Po trzech płukaniach przez odwirowanie ponownie zawiesić jaja w dwóch do trzech mililitrach świeżego roztworu S Basal.

Aby przygotować larwy C.elegans w stadium L1, przenieś supernatanty do jednej sterylnej szklanej szalki Petriego na probówkę i użyj dwóch do trzech mililitrów roztworu S Basal do wypłukania pozostałych jaj z probówek do każdego naczynia. Dodaj pięć mililitrów roztworu S Basal do każdego naczynia, aby złagodzić stłoczenie i umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 20 obr./min na 16 do 24 godzin, aby zachęcić do wylęgu. Wszystkie pisklęta zatrzymują się w pierwszym stadium larwalnym z powodu braku pożywienia.

Za pomocą pipety serologicznej przenieś larwy L1 do 15-mililitrowej probówki w celu ich odwirowania. Po tym, jak wszystkie wyklute L1 zostaną skonsolidowane przez wielokrotne wirowanie i aspirację, ponownie zawiesić osad larwy za pomocą 10 mililitrów sterylnego roztworu S Basal. Następnie przenieś 10 mikrolitrów na talerz bez nasion i policz liczbę larw obecnych na talerzu.

Powtórz to 10 razy, aby uzyskać średnią gęstość L1 w roztworze. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej oznaczyć całkowitą objętość roztworu zawierającego L1s. Następnie użyj objętości roztworu L1 i gęstości L1 w roztworze, aby obliczyć całkowitą liczbę L1 obecnych w roztworze.

Aby umieścić robaki na 96-dołkowej płytce do oznaczania o wysokiej przepustowości, należy rozcieńczyć zawiesinę L1 do jednej larwy L1 na mikrolitr w sterylnej, okrągłej butelce z pożywką, wyposażonej w umiarkowanie wolno obracającą się mieszadło i pozwolić płytkom testowym ogrzać się do temperatury pokojowej. Następnie w komorze z przepływem laminarnym dodaj pięć mikrolitrów skoncentrowanej E. coli do każdej studzienki, a następnie 10 mikrolitrów zawiesiny L1 na studzienkę, aby uzyskać średnio 10 robaków na studzienkę. Kiedy wszystkie robaki zostaną pokryte, przykryj płytki i wysiaduj robaki przez dwa dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby larwy mogły rozwinąć się w dorosłe osobniki.

Pod koniec inkubacji doprowadzić płytki biblioteki chemicznej do temperatury pokojowej od zamrożenia. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie potrząsaj rozmrożonymi płytkami z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek przez jedną minutę. Za pomocą zautomatyzowanego 96-dołkowego urządzenia do obsługi cieczy przenieś 0,75 mikrolitra związku z płytki bibliotecznej na płytkę testową.

Po oczyszczeniu wszystkich studzienek należy wysuszyć związek na powietrzu z powierzchni płytek w komorze z przepływem laminarnym przez cztery do ośmiu godzin, usuwając poszczególne płytki, gdy tylko wyschną. Uszczelnij wysuszone płytki przezroczystą folią i przykryj je. Następnie obracaj płytki przez 45 sekund w temperaturze 1000 G i przechowuj je w pozycji odwróconej w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Aby przetestować reakcje C. elegans na związki będące przedmiotem zainteresowania, można użyć płytki kontroli ujemnej w celu oceny całkowitego przeżycia do momentu, gdy 95% zwierząt kontrolnych umrze, w którym to momencie można ocenić wszystkie płytki testowe. Na przykład w tym badaniu zaobserwowano 57 trafień z biblioteki 179 związków z ponownego testu, co pokazuje, że 32% ponownie testowanych substancji chemicznych dało łącznie wynik pozytywny. Grupowanie uśrednionych wyników procentowych liczby żywych zwierząt dla dołków kontroli ujemnej i badanych wykazało, że dołki testowe osiągały lepsze wyniki niż studzienki kontrolne.

Można również przeprowadzać badania przesiewowe na małą skalę, jak wykazano w tym reprezentatywnym teście, w którym zastosowano 50 mikromolowych i 100 mikromolowych stężeń badanego związku. Ponowna ocena tych płytek testowych do testów na małym ekranie, gdy ponad 99% zwierząt poddanych kontroli ujemnej było martwych, wskazało, że studzienki kontroli dodatniej znacznie przewyższały kontrole ujemne i studzienki testowe, ponieważ studzienki testowe działały nieco lepiej niż kontrole negatywne. W tym eksperymencie ten ostatni wynik był zniekształcony przez wskazanie, że wiele studzienek testowych wydawało się wykazywać toksyczność w stosunku do leczenia kontrolnego, co zagmatwało tę prostą interpretację.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować integralność płytek testowych, upewniając się, że są one nieskazitelne przed użyciem. Stosując tę technikę, można uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: Który z tych związków indukuje mitofagię?

Do testu mitofagii użyto by nici reporterowej mitofagii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak przeprowadzić wysokoprzepustowe badanie chemiczne przy użyciu C.elegans jako organizmu modelowego.