Name: Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Naucz się rutynowej metody badań przesiewowych mikrocząstek w koncentratach płytek krwi przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła. Technika ta pozwala szybko odróżnić aktywowane i nieaktywowane płytki, optymalizując leczenie pacjentów hematologiczno-onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dawcom krwi i personelowi Centrum Rozwoju Stosowanego Kanadyjskiej Sieci Usług Krwiodawstwa za pobranie i produkcję jednostek płytek krwi używanych w tym badaniu. Dziękujemy Kanadyjskiej Fundacji Innowacji i Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem za finansowanie infrastruktury w Centrum Badań Krwi UBC. Finansowanie publikacji zapewniła firma LightIntegra Technology Inc., producent szczepionki ThromboLUX.

Poniższy protokół został wykonany zgodnie ze wszystkimi wytycznymi Canadian Blood Services (CBS). Wolontariusze wyrazili zgodę na wykorzystanie ich darowizn do przeprowadzenia tych badań. Koncentraty płytek krwi zostały przygotowane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi CBS. Wszystkie opisane tutaj testy wydajności zostały przeprowadzone w Centre for Blood Research na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie, za zgodą instytucjonalnej Rady Etyki Badań.
1. Kontrola jakości
<ol>
	<li>Przynajmniej raz w dniu przeprowadzania badań wykonaj kontrolę jakości, aby zweryfikować prawidłowe działanie systemu DLS. Zmierz dostarczone kuleczki kontrolne (promień 50 nm) zgodnie z instrukcją użycia producenta.</li>
	<li>Wyjmij fiolkę kontrolną z przechowywania w niskiej temperaturze i pozostaw ją na 15 min w celu ogrzania do temperatury pokojowej. Kuleczki muszą osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem.</li>
	<li>Włącz system DLS przed przygotowaniem próbki, aby 15-minutowy okres rozgrzewania lasera zakończył się w momencie, gdy pierwsza próbka będzie gotowa do badania.</li>
	<li>Po uruchomieniu konsoli postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie dotykowym, aby zalogować się i wybrać opcję System Test w celu pomiaru próbki kontrolnej.</li>
	<li>Wymieszaj fiolkę w vorteksie przez 10 s, aby zapewnić reprezentatywność próbki.</li>
	<li>Napełnij kapilarę kuleczkami kontrolnymi, używając pipety o stałej objętości 10 µL, końcówki do pipety oraz kapilary z zestawu testowego.</li>
	<li>Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie systemu DLS. 
	UWAGA: Wyniki testu kuleczek kontrolnych są automatycznie porównywane z informacjami zapisanymi w etykiecie kodowej kuleczek kontrolnych, a powiadomienie PASS lub FAIL oraz informacje o próbce są wyświetlane na ekranie systemu DLS po zakończeniu testu.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbki z koncentratu płytek krwi
UWAGA: Kroki te opisują proces nieinwazyjnego pobierania próbek z transfuzji płytek krwi do kapilary testowej DLS w ramach rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi. Przegląd procesu przedstawiono na Ryc. 1. Wymagane akcesoria: uszczelniacz probówek, ręczny ściągacz probówek, nożyczki oraz osłona przeciwrozpryskowa.
<ol>
	<li>Wyjąć koncentrat płytek krwi z zapasu nieprzebadanych próbek.</li>
	<li>Pobrać próbkę produktu płytkowego albo z nieużywanego woreczka pobraniowego (przejść do kroku 2.3), albo z segmentu przewodu (przejść do kroku 2.4, jeśli jest pusty, lub do kroku 2.5, jeśli nie jest pusty). 
	Aby odłączyć przewód woreczka lub segment przewodu, należy użyć zgrzewarki do przewodów. Urządzenie to należy obsługiwać zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: należy zacisnąć przewód w precyzyjnie określonym miejscu między dwiema podgrzewanymi szczękami. W urządzeniu ręcznym należy docisnąć stopione ścianki przewodu i schłodzić je pod wysokim ciśnieniem, naciskając dźwignię (czas trwania procesu jest sygnalizowany zielonym światłem), co zapewni trwałe i szczelne zamknięcie.</li>
	<li>Pobieranie próbki z woreczka
	<ol>
		<li>Dokładnie wymieszać zawartość worka z płytkami, wykonując delikatne ruchy poziome przez 5 s (przechylając worek z jednego końca na drugi pięć razy).</li>
		<li>Otworzyć zacisk woreczka. Woreczek jest ewakuowany i napełni się samoczynnie. Nie ma potrzeby całkowitego napełnienia woreczka, ponieważ do testów DLS wymagana będzie jedynie próbka o objętości 10 µL.</li>
		<li>Odłączyć woreczek od worka, zgrzewając termicznie łączący je przewód za pomocą zgrzewarki do przewodów. Kontynuować od kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbki z pustego przewodu
	<ol>
		<li>Upewnić się, że przewód worka z płytkami był przechowywany w stanie pustym i że blokada przewodu jest nadal na miejscu. Wizualnie sprawdzić przewód, aby upewnić się, że nie znajduje się w nim znacząca ilość koncentratu płytek. Jeśli przewód nie jest pusty, kontynuować od kroku 2.5.</li>
		<li>Zamknąć wyciskacz do przewodów na przewodzie tak blisko blokady przewodu, jak to możliwe, ściskając uchwyty, aby docisnąć przewód między rolkami.</li>
		<li>Zawiesić worek pionowo i nadal ściskać uchwyty wyciskacza.</li>
		<li>Trzymając wyciskacz zamknięty, zwolnić blokadę przewodu.</li>
		<li>Powoli przesuwać wyciskacz w dół pustego przewodu, pozwalając na powolne napełnianie się przewodu za wyciskaczem. Kontynuować, aż sekcja poniżej wyciskacza zostanie całkowicie nadmuchana lub aż wyciskacz znajdzie się w odległości 1 cala od końca przewodu.</li>
		<li>Po osiągnięciu punktu zatrzymania wyciskacza, użyć zgrzewarki do przewodów, aby termicznie zgrzać przewód 1 cal powyżej wyciskacza.</li>
		<li>Zwolnić uchwyty ręcznego wyciskacza do przewodów.</li>
		<li>Zgrzać termicznie ponownie 1 do 2 cali powyżej poprzedniego zgrzewu, aby utworzyć segment testowy.</li>
		<li>Odciąć segment testowy od jednostki płytek. Segment ten zostanie wykorzystany do testów DLS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbki z przewodu, który nie jest pusty
	<ol>
		<li>Zawiesić worek pionowo i zwolnić blokadę przewodu, jeśli jest założona.</li>
		<li>Wizualnie sprawdzić przewód, aby ustalić, czy nie ma w nim znaczących grudek stałych. Jeśli grudki występują, należy zgrzać przewód powyżej nich, tak aby nie mogły zostać wyciśnięte do worka.</li>
		<li>Zamknąć wyciskacz do przewodów na przewodzie tak blisko zgrzanego końca przewodu, jak to możliwe.</li>
		<li>Wypchnąć zawartość przewodu do worka, ściskając uchwyty w celu dociśnięcia przewodu między rolkami i, utrzymując siłę zacisku, przesuwając wyciskacz wzdłuż przewodu w kierunku worka.</li>
		<li>Zdjąć worek z płytkami z haka i delikatnie wymieszać zawartość przez 5 s, przechylając go z jednego końca na drugi pięć razy, trzymając wyciskacz zamknięty.</li>
		<li>Zawiesić worek pionowo, utrzymując wyciskacz zamknięty.</li>
		<li>Powoli przesuwać wyciskacz w dół pustego przewodu, pozwalając na powolne napełnianie się przewodu za wyciskaczem. Kontynuować, aż sekcja poniżej wyciskacza zostanie całkowicie nadmuchana lub aż wyciskacz znajdzie się w odległości 1 cala od końca przewodu.</li>
		<li>Po osiągnięciu punktu zatrzymania wyciskacza, użyć zgrzewarki do przewodów, aby termicznie zgrzać przewód 1 cal powyżej wyciskacza.</li>
		<li>Zwolnić wyciskacz.</li>
		<li>Zgrzać termicznie ponownie 1 do 2 cali powyżej poprzedniego zgrzewu, aby utworzyć segment testowy.</li>
		<li>Odciąć i wyrzucić ostatnią część przewodu.</li>
		<li>Odciąć segment testowy od jednostki płytek. Segment ten zostanie wykorzystany do testów DLS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Napełnianie kapilary testowej DLS próbką
<ol>
	<li>Używając osłony przed rozpryskami oraz czystych i suchych nożyczek, odetnij jeden koniec rurki z woreczka lub segmentu testowego. 
	UWAGA: Kapilarę wykorzystywaną do testów DLS należy napełnić natychmiast.</li>
	<li>Napełnij kapilarę, używając narzędzia do pobierania próbek (złożonej pipety o stałej objętości 10 µL, końcówki pipety i kapilary), aby pobrać próbkę bezpośrednio z otwartego woreczka lub segmentu rurki do wnętrza kapilary.</li>
	<li>Uszczelnij dno napełnionej kapilary, delikatnie wsuwając ją w uszczelniacz do kapilar, lekko obracając i dociskając do tacki.</li>
	<li>Odłącz pipetę o stałej objętości 100 µL i końcówkę od kapilary, upewniając się, że kapilara pozostaje mocno osadzona w uszczelniaczu do kapilar.</li>
	<li>Wyjmij kapilarę z tacki z uszczelniaczem, przetrzyj ją wacikiem z izopropylowym alkoholem i upewnij się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza, delikatnie strzepując dno kapilary.</li>
	<li>Umieść kapilarę w systemie DLS.</li>
</ol>
4. Przeprowadzenie testu DLS
<ol>
	<li>Wybierz opcję testu MP, aby rozpocząć nowy test DLS w celu pomiaru zawartości mikrocząstek w próbce płytek krwi.</li>
	<li>Wprowadź informacje o próbce (numer identyfikacyjny donacji (ISBT), datę ważności zbioru/produkcji oraz kod produktu) za pomocą skanera kodów kreskowych lub ręcznie.</li>
	<li>Jeśli nie jest dostępny kod produktu, z którego system DLS mógłby pobrać informacje o ośrodku płynnym, wybierz odpowiedni ośrodek płynny ręcznie (dla większości koncentratów płytek wybierz plazmę, a dla próbek zawierających roztwór dodatkowy do płytek (PAS) wprowadź procent pozostałej plazmy). 
	UWAGA: Niewielkie odchylenie procentowej zawartości PAS od nominalnych 65% spowoduje niewielki błąd w obliczeniu lepkości (obliczanej automatycznie przez system DLS), co minimalnie wpływa na obliczony promień MP, ale nie na %MP.</li>
	<li>Włóż kapilarę do systemu DLS po wyświetleniu instrukcji i rozpocznij test.</li>
	<li>Po zakończeniu testu wyjmij próbkę z uchwytu kapilary i zutylizuj materiały zużywalne zgodnie z wytycznymi placówki. Wyjmij próbkę z uchwytu kapilary i zutylizuj materiały zużywalne zgodnie z wytycznymi placówki.</li>
	<li>Oznakuj worek z płytkami kolorem odpowiadającym wynikowi, na przykład pomarańczowym dla nieaktywowanych (homogennych) przy %MP równym lub niższym niż 15% oraz różowym dla aktywowanych (heterogennych) przy %MP powyżej 15%.</li>
</ol>
<img alt="Analiza próbek krwi metodą DLS; wykres przedstawia rozmiar cząstek płytek krwi nieaktywowanych w porównaniu do aktywowanych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Przegląd metody. Przegląd etapów rutynowego zarządzania zapasami koncentratów krwopławczych w szpitalnej banku krwi: pobranie próbki z koncentratu krwopławczkowego, wprowadzenie próbki do kapilary do pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząsteczek oraz wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząsteczek do identyfikacji aktywowanych krwopławczyków. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

EMS jest założycielem LightIntegra Technology Inc., firmy produkującej urządzenia medyczne, która opracowała system ThromboLUX do badania jakości mikrocząstek i płytek krwi. Wszyscy pozostali autorzy są pracownikami firmy LightIntegra Technology. Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez LightIntegra Technology Inc.

Protokół ten opisuje metodę dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych mikrocząstek, zoptymalizowaną pod kątem wysokich stężeń cząstek występujących w próbkach biologicznych, takich jak koncentraty płytek krwi. Metoda DLS jest z natury ustandaryzowana w celu dokładnego pomiaru rozmiaru. Względne stężenie mikrocząstek można przekształcić w stężenie bezwzględne, jeśli stężenie płytek krwi jest znane, a powierzchnia piku płytkowego jest używana jako pik odniesienia19. Ponieważ stężenia płytek krwi są zwykle uzyskiwane za pomocą analizatorów hematologicznych lub cytometrów przepływowych, metody te można uznać za technologie towarzyszące DLS.
Funkcjonalność systemu DLS jest zapewniona poprzez regularne uruchamianie koralików kontrolnych. Wodę destylowaną można zmierzyć, aby sprawdzić, czy hałas tła jest minimalny. Dostępne na rynku wzorce płytek krwi mogą być analizowane jako kontrole ujemne MP, a po dodaniu kulek o promieniu 125 nm jako kontrole dodatnie MP. W biologicznym zakresie stężeń MP będących przedmiotem zainteresowania, procedury są praktyczne i szybkie do wykonania w ramach rutynowej pracy banku krwi.
W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, metoda ta nie opiera się na porównaniu intensywności rozpraszania cząstek, ale raczej na prędkości ich ruchu Browna. W ten sposób egzosomy mogą być również wykrywane pomimo ich niewielkich rozmiarów i są zgłaszane oddzielnie od MP.
Metoda ta, zaprojektowana jako narzędzie przesiewowe, wiąże się z jej niezdolnością do rozróżnienia różnych typów mikrocząstek. Istnieje potencjalne pole do poprawy, jeżeli zastosowane zostaną dodatkowe etapy izolacji; Próbki można testować przed i po specyficznym usunięciu mikrocząstek poprzez wychwytywanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami. Ponadto nie można założyć, że wszystkie wykryte mikrocząstki są pochodzenia komórkowego, ponieważ chylomikrony powstałe w hiperlipidemii47,48 oraz małe bakterie lub wirusy6 zostaną również zgłoszone w zakresie mikrocząstek. Istnieją jednak inne zabezpieczenia w zakresie zaopatrzenia w krew, aby zapobiec przedostawaniu się do inwentarza szpitalnego banku krwi silnie lipemicznego lub zanieczyszczonych płytek krwi.
Wybór antykoagulantu w próbce wpływa na stopień aktywacji płytek krwi, a tym samym na zawartość MP49. W przypadku porównań różnych produktów należy wziąć pod uwagę ten czynnik. Ponadto wymiana osocza na pożywki zawiesinowe wolne od MP, takie jak PAS, wpłynie na zawartość MP i próg oznaczania niejednorodności - jeśli tylko około jedna trzecia pierwotnej zawartości MP pozostanie w osoczu resztkowym w koncentracie, odpowiednio niższy próg zawartości MP będzie wskazywał na taki sam poziom aktywacji płytek krwi, jak w 100% osoczu. Procent MP to zawartość MP w stosunku do płytek krwi. Wcześniej informowano, że średnia liczba płytek krwi w produkcie PAS była niższa, tak że średni %MP nadal wynosił 9,5%19. Próg %MP dla płytek krwi PAS zarejestrowanych w USA jest obecnie ustawiony na 10%.
Podczas gdy głównym źródłem MP w koncentratach płytek krwi jest dawca, procesy, które powodują stres u płytek krwi, zwiększą poziom MP w zależności od podatności płytek krwi na stres - jeśli płytki krwi są już silnie aktywowane, drobne czynniki stresogenne, takie jak wydłużony okres przydatności do spożycia, inaktywacja patogenów, mycie, napromienianie lub transport na duże odległości, mogą prowadzić do znacznego wzrostu zawartości MP. Wykazano, że żaden z tych czynników stresogennych nie wpływa znacząco na jednorodne, nieaktywowane płytki krwi19. Ponadto należy zwrócić uwagę na możliwość wystąpienia zmian w składzie próbki w obrębie kapilary, jeżeli nie zostanie ona przebadana natychmiast po przygotowaniu (zakończenie kroku 3 niniejszego protokołu).
Protokół ten koncentruje się na określeniu składu cząstek obecnych w transfuzjach płytek krwi i wykorzystaniu mikrocząstek jako biomarkerów aktywacji płytek krwi. Transfuzje płytek krwi są oznaczane jako nieaktywowane (pomarańczowy) lub aktywowane (różowe) w oparciu o próg procentowy mikrocząstek wynoszący 15%. Próg 15% MP dla płytek krwi w 100% osoczu określono empirycznie jako średni 66. percentyl z wielu miejsc.
Celem zarządzania zapasami płytek krwi w oparciu o rutynowe badania przesiewowe mikrocząsteczek za pomocą DLS jest poprawa opieki nad pacjentem i zwiększenie efektywności kosztowej poprzez zapobieganie nieimmunologicznej oporności na płytki krwi. Wdrożenie systemu DLS do badań przesiewowych worków płytkowych umożliwi użytkownikowi kierowanie nieaktywowanych płytek krwi do populacji pacjentów najbardziej narażonych na rozwój ogniotrwałości płytek krwi.

Zainteresowanie mikrocząstkami skupiało się głównie na ich udziale w komunikacji międzykomórkowej i procesach biologicznych. 1,2,3 Ostatnio mikrocząsteczki wzbudziły zainteresowanie jako potencjalne wczesne markery diagnostyczne chorób autoimmunologicznych i sercowo-naczyniowych. 4,5 Mikrocząsteczki, znane również jako pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub egzosomy, były szeroko badane za pomocą cytometrii przepływowej. Niestety, pomimo wysiłków zmierzających do standaryzacji konwencjonalnych protokołów cytometrii przepływowej, nie ma konsensusu co do optymalnego protokołu, który należy zastosować. 6,7,8,9,10
Chociaż konwencjonalna cytometria przepływowa może charakteryzować określone subpopulacje MP,11 ma kilka zgłoszonych ograniczeń. 11,12,13,14 Niektóre z tych ograniczeń zostały rozwiązane poprzez użycie laserów i detektorów o większej mocy w tak zwanej "opcji małych cząstek",15,16, a także wykrywanie pod kątem rozproszenia 15°-25° do przodu i zmodyfikowany nacisk na osłonę. 17,18 Niemniej jednak, szybka i łatwa w użyciu metoda przesiewowa, którą można połączyć z tymi wyrafinowanymi metodami, jest nadal potrzebna do wykorzystania mikrocząsteczek jako wczesnych markerów diagnostycznych. Podwyższony poziom mikrocząsteczek jest wykrywalny u około jednej trzeciej zdrowych dawców krwi19 i może wskazywać na stany subkliniczne. W związku z tym wysoki poziom mikrocząstek w oddanych produktach krwiopochodnych może być niezgodny z wymaganiami biorców. 20
Podczas transfuzji płytek krwi istnieje ryzyko nieimmunologicznej oporności - stanu, w którym ciało pacjenta odrzuca kolejne transfuzje i nie pozwala na krążenie znacznej części płytek krwi. 21,22 Oporność na uszkodzenia może prowadzić do marnotrawstwa transfuzji, komplikacji zdrowotnych u pacjentów i przedłużających się pobytów w szpitalu. 23 Transfuzje płytek krwi zawierające dużą liczbę mikrocząsteczek mogą być czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju oporności na działanie układu immunologicznego u wrażliwych pacjentów hematologiczno-onkologicznych. 20 Możliwe jest zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi zgodnie ze składem transfuzji płytek krwi poprzez badania przesiewowe na obecność mikrocząstek, zmniejszając w ten sposób ryzyko dla wrażliwych pacjentów. Jednak większość testów mikrocząstek wymaga izolacji mikrocząstek z płytek krwi5,12 lub są w inny sposób bardzo pracochłonne24,25 i dlatego nie mogą być stosowane rutynowo w szpitalnych bankach krwi.
Opisana tutaj technika wykorzystuje dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) - znane również jako spektroskopia korelacji fotonów lub quasi-elastyczne rozpraszanie światła. Przez dziesięciolecia dynamiczne rozpraszanie światła było szeroko stosowane w przemyśle farmaceutycznym do charakteryzowania liposomalnych preparatów leków lub emulsji, w których rozmiary cząstek mieszczą się w zakresie submikronowym. 26,27 Jednak narzędzia opracowane dla tych zastosowań nie są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych produktów krwiopochodnych. Nowy system DLS został opracowany w celu przezwyciężenia ograniczeń technicznych i wykorzystania dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych transfuzji płytek krwi. 28
Dynamiczne pomiary rozpraszania światła są wykonywane poprzez oświetlanie zawieszonych cząstek światłem laserowym i analizowanie zmian w czasie intensywności rozproszonego światła, które są konsekwencją cząstek poruszających się w zawieszeniu. Co więcej, metoda ta wykorzystuje odwrotną zależność między prędkością a wielkością cząstek - małe cząstki poruszają się szybko, a duże cząstki poruszają się wolno - w celu dostarczenia informacji o rozkładach wielkości i względnych stężeniach składników próbki. Za pomocą DLS można określić ilościowo średnią zawartość mikrocząstek i średni promień składnika mikrocząstek. Zawartość mikrocząstek w produkcie krwiopochodnym jest podawana jako %MP na podstawie pola na zmierzonym histogramie dla promieni cząstek od 50 do 550 nm. Podczas gdy cząstki o promieniu poniżej 50 nm są wykrywane przez DLS i raportowane przez system DLS, nie są one uwzględniane w %MP. Zamiast izolować mikrocząstki z płytek krwi, niejednorodność transfuzji płytek krwi określa się na podstawie względnej zawartości mikrocząstek i płytek krwi w próbce. W rzeczywistości stosunek pików płytek krwi i mikrocząstek można wykorzystać do obliczenia bezwzględnego stężenia MP, gdy znana jest liczba płytek krwi. 19
System DLS dostarcza pracownikom służby zdrowia jakościowych i ilościowych informacji o mikrocząsteczkach znalezionych w próbkach pochodzących z ludzkiej krwi lub produktów krwiopochodnych. Główną przewagą opisanej techniki DLS nad technikami alternatywnymi, takimi jak cytometria przepływowa, mikroskopia elektronowa,29 nanoparticle tracking analysis30 lub tunable resistive pulse sensing31 jest przygotowanie próbki: podwielokrotności koncentratów płytek krwi mogą być mierzone bezpośrednio, bez konieczności izolowania MP od płytek krwi, rozcieńczania próbki lub innych modyfikacji. 9,17 Ponadto DLS jest bezwzględną metodą wymiarowania i nie cierpi z powodu braku koralików kalibracyjnych o odpowiednim współczynniku załamania. 14,32
Korelacja między aktywacją płytek krwi a zawartością MP została wcześniej wykazana przez mikroskopię33,20 i można ją wywnioskować ze wzrostu zawartości MP w stanach patologicznych15,34,35,36 i w warunkach in vitro, o których wiadomo, że aktywują płytki krwi. 19,37,38 Potrzebne są jednak dalsze badania, aby w pełni zrozumieć związek między zawartością mikrocząstek mierzoną przez DLS a aktywacją płytek krwi. Opierając się na naszej obecnej wiedzy, że aktywowane płytki krwi zawierają dużą liczbę mikrocząstek, najlepiej stosować je w leczeniu pacjentów z aktywnym krwawieniem39, podczas gdy pacjenci hematologiczno-onkologiczni odnoszą korzyści z nieaktywowanych płytek krwi bez mikrocząstek lub z niskim poziomem mikrocząstek20. Niedawno doniesiono, że reakcja płytek krwi dawcy w warunkach in vitro nie wpłynęła znacząco na regenerację i przeżycie tych płytek krwi w pojedynczych transfuzjach u stabilnych, w większości niekrwawiących pacjentów hematologiczno-onkologicznych40. Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że aktywacja płytek krwi identyfikowana przez wysoką zawartość MP również nie odgrywa istotnej roli w leczeniu profilaktycznym pacjentów. Jednak ze względu na wąski wybór pacjentów, badanie to nie dotyczyło wpływu czynników dawcy na pacjentów ze złożonym stanem gorączkowym, niestabilnych i otrzymujących więcej niż jedną transfuzję płytek krwi. Pytanie, w jaki sposób można zmniejszyć złożoność tych przypadków pacjentów, co daje nadzieję na zmniejszenie ogniotrwałości, pozostaje bez odpowiedzi.
Mikrocząsteczki są wczesnymi markerami stanu zapalnego41,42,43,44 i aktywacja płytek krwi45 i dlatego są wykrywane u wielu normalnych dawców. 19 W związku z tym, aktywowane płytki krwi i mikrocząsteczki są obecne w dawstwie płytek krwi. Uzasadnione jest postawienie hipotezy, że pacjenci z gorączką, tj. w pełni aktywowanym wrodzonym układem odpornościowym, nie mogą tolerować dodatkowego wyzwania, jakim jest transfuzja aktywowanych płytek krwi. Potrzebne są jednak badania, aby udowodnić tę hipotezę. Badania przesiewowe mikrocząsteczek mogą zmniejszyć obecną niepewność co do zawartości transfuzji płytek krwi i zmniejszyć złożoność leczenia pacjentów.
Stosunek aktywowanych do nieaktywowanych płytek krwi w szpitalnym banku krwi zależy przede wszystkim od populacji dawców, a w znacznie mniejszym stopniu od transportu, napromieniania, inaktywacji patogenów i innych procesów, które mogą zwiększyć aktywację płytek krwi w koncentratach. 19 Dane z głównych szpitalnych banków krwi w Stanach Zjednoczonych wykazały, że średni skład inwentarza płytek krwi jest w 49% aktywowany i w 51% nieaktywowany (zakres dla aktywowanych płytek krwi: 38 - 62%, komunikacja osobista). Jeśli dostawcy produktów krwiopochodnych lub szpitalne banki krwi chcą wiedzieć, ile aktywowanych i nieaktywowanych koncentratów płytek krwi produkują lub otrzymują, a także chcą zarządzać swoimi zapasami w oparciu o aktywację płytek krwi zgodnie z zawartością mikrocząstek, ten protokół może być dla nich odpowiedni.
Na podstawie składu płytek krwi szpitalny bank krwi będzie mógł skierować nieaktywowane, jednorodne płytki krwi do użytku profilaktycznego oraz aktywowane, heterogenne płytki krwi do użytku terapeutycznego. Badania przesiewowe płytek krwi pozwalają szpitalom zmaksymalizować wykorzystanie dostępnych zapasów, co poprawia opiekę nad pacjentem i obniża koszty. Protokół ten jest przeznaczony dla personelu laboratoryjnego, który jest zaznajomiony z podstawową obsługą i manipulacją produktami krwiopochodnymi.
Przedstawiona tutaj jest metoda przesiewowa dla mikrocząsteczek w transfuzjach płytek krwi, która może być rutynowo stosowana do zarządzania zapasami szpitalnego banku krwi, gdzie wybór produktu na podstawie zawartości mikrocząstek jest pożądany. Celem niniejszego protokołu jest nakreślenie wdrożenia i oceny DLS do badań przesiewowych dawczyń krwi. Opisany protokół odpowiada na często zadawane pytania dotyczące nieinwazyjnego dostępu do próbek, integracji testów z przepływem pracy banku krwi oraz charakterystyki wydajności.

<table><tbody><tr><td>ThromboLUX-M</td><td>LightIntegra Technology Inc.&nbsp;</td><td>LPN120</td><td>DLS System</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ThromboSight</td><td>LightIntegra Technology Inc.&nbsp;</td><td>Oprogramowanie analityczne LPN124</td><td>DLS</td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Optinova MLE)</td><td>LPN065</td><td>Niestandardowa wytłaczana, nieaktywująca, niedwójnomocna rurka z tworzywa sztucznego, sprawdzona i napromieniowana</td></tr><tr><td>MiniPet&nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca TriContinent Scientific)</td><td>LPN082</td><td>100 &micro; L pipeta o stałej objętości do pobierania próbek&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex 1-200 i mikro; L Końcówki do pipet</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca ESBE Scientific)</td><td>LPN080</td><td>Końcówki do pipet do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Critoseal&nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Fisher Scientific)</td><td>LPN075</td><td>Uszczelniacz do rurek kapilarnych</td></tr><tr><td>Dukal Alcohol Pad lub równoważny</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarty w zestawie testowym, dostawca Dukal Corp.)</td><td>LPN085</td><td>Podkładka izopropylowa (nasycona 70% alkoholem izopropylowym)</td></tr><tr><td>Koraliki kontrolne, promień 50 nm</td><td>LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca PolySciences Inc.)</td><td>LPN128</td><td>Koraliki kontrolne</td></tr><tr><td>Mikrokulki NIST Identyfikowalny rozmiar cząstek Standardowy, 3 i mikro; m</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64060</td><td>Standardowe mikrokulki: 1,5 i mikro; m promień Koraliki polistyrenowe; zakres 1,43-1,58 i mikro; m; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64014-15</td><td>Standardowe nanokulki: promień 125 nm Kulki polistyrenowe; zakres 120 - 130 nm; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Genesis BPS RapidSeal II lub odpowiednik</td><td>Genesis BPS</td><td>428-SE640</td><td>Zgrzewarka do tub</td></tr><tr><td>Fresenius Kabi Tube Stripper lub odpowiednik</td><td>Fresenius Kabi</td><td>6R4452</td><td>Ręczna maszyna do ściągania izolacji z tubek</td></tr><tr><td>Biohazard Shield - Cell Counter lub odpowiednik</td><td>CardinalHealth</td><td>S1389-75</td><td>Splash Shield</td></tr><tr><td>Corning LSE Vortex Mixer lub odpowiednik</td><td>Corning Incorporated</td><td>6775</td><td>Vortex mixer</td></tr><tr><td>FACSCanto II Cytometr przepływowy&nbsp; z oprogramowaniem FACSDiva w wersji 6.1.3 lub równoważnym</td><td>Cytometr przepływowy</td> <td>BD Biosciences</td><td>338960</td></tr></tbody></table>

rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości dla szpitalnych banków krwi. Komórki rozdrabniają mikrocząstki (MP), gdy są naprężone. Krew i składniki krwi mogą zawierać fragmenty komórkowe z różnych komórek, w szczególności z aktywowanych płytek krwi. Pełniąc swoje role jako wrodzone komórki odpornościowe i główni gracze w krzepnięciu i hemostazie, płytki krwi zmieniają kształt i wytwarzają mikrocząsteczki. Dzięki detekcji mikrocząstek opartej na dynamicznym rozpraszaniu światła (DLS) możliwe jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych (o wysokiej zawartości mikrocząstek) od nieaktywowanych (o niskiej zawartości mikrocząstek) w transfuzjach i zoptymalizowanie wykorzystania tego rzadkiego produktu krwiopochodnego. Wcześniejsze badania sugerują, że dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi do stosowania profilaktycznego u pacjentów hematologiczno-onkologicznych może zmniejszyć ryzyko wystąpienia oporności na leczenie i poprawić opiekę nad pacjentem. Celem tej metody badań przesiewowych jest rutynowe różnicowanie płytek krwi aktywowanych i nieaktywowanych. Opisana tutaj metoda przedstawia kroki, które należy wykonać w celu rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi w szpitalnym banku krwi: uzyskanie próbki z transfuzji płytek krwi, załadowanie próbki do kapilary w celu pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząstek oraz wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząstek do identyfikacji aktywowanych płytek krwi.

Średni czas przygotowania 
Proces przesiewania płytek krwi z wykorzystaniem systemu DLS przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 1. Płytki krwi są badane za pomocą systemu DLS w momencie ich otrzymania od dostawcy krwi. Jak szczegółowo opisano w Tabeli 1, średni czas przygotowania dla przeszkolonych użytkowników wynosi 2 min 23 s, natomiast czas oczyszczania i prace po teście trwają odpowiednio 14 s i 46 s. Łącznie średni czas pracy manualnej użytkownika na jeden test wynosi 3 min 23 s.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aktywność </td>
			<td>Czas aktywny</td>
			<td>Czas badania bezobsługowego</td>
			<td>SUMARYCZNIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przygotowanie systemu DLS</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montaż narzędzia do pobierania próbek</td>
			<td>28 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pozyskanie segmentu</td>
			<td>52 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napełnić kapilarę i rozpocząć test</td>
			<td>49 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczanie</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oznaczenie i ewidencja worka z koncentratem krążków krwi</td>
			<td>46 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity czas potrzebny na jedną próbkę</td>
			<td>3 min 23 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>8 min 23 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podział czasu aktywnego badania. Samo badanie jest testem typu „walk away” o średnim czasie trwania 5 min. Średni czas potrzebny użytkownikowi na przygotowanie systemu DLS do badania, pobranie i przetestowanie próbki zgodnie z niniejszym protokołem oraz oznaczenie worka z płytkami wynosi 3 min 23 s.
Precyzja 
Precyzję systemu DLS oceniono dla trzech poziomów mikrocząstek: 0-7%, 12-25% oraz 28-75%. Klinicznie istotny zakres %MP wynosi 3 - 75%. Dwóch operatorów testowało próbki kontrolne o niskim, średnim i wysokim stężeniu przez 16 dni roboczych na dwóch systemach DLS równolegle. Próbki analizowano w dwóch powtórzeniach, lecz w losowej kolejności każdego dnia badań.
Tabela 2 podsumowuje precyzję wewnątrzpomiarową pomiarów DLS dla procentowej zawartości mikrocząstek (%MP) w stosunku do płytek krwi.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Zawartość mikrocząsteczek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Niski</td>
			<td>Pożywka</td>
			<td>Wysoki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia %MP (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>19.5</td>
			<td>53.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odchylenie standardowe (%)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.6</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV (%)</td>
			<td>40.4</td>
			<td>13.2</td>
			<td>10.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Precyzja wewnątrz urządzenia dla procentowej zawartości mikrocząsteczek (%MP). Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząsteczek małe płytki krwi mogą wpływać na %MP, co prowadzi do zwiększonej zmienności w próbkach o niskiej zawartości mikrocząsteczek.
Tabela 3 przedstawia precyzję wewnątrzpomiarową pomiarów DLS dla średniego promienia mikrocząstek w zakresie od 50-50 nm.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td colspan="3">Zawartość mikrocząstek</td>
		</tr>
		<tr >
			<td></td>
			<td>Niska</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>Wysoka</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Średni promień (nm)</td>
			<td>31</td>
			<td>161</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Odchylenie standardowe (mm)</td>
			<td>13</td>
			<td>41</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>CV (%)</td>
			<td>40.1</td>
			<td>25.2</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Precyzja wewnątrz urządzenia dla promienia mikrocząsteczek. Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząsteczek małe płytki krwi mogą wpływać na procent mikrocząsteczek (%MP), co prowadzi do zwiększonej zmienności w próbkach o niskiej zawartości mikrocząsteczek.
Tabela 4 przedstawia powtarzalność pomiarów DLS dla procentowej zawartości mikrocząsteczek (%MP).
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Zawartość mikrocząsteczek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Niski</td>
			<td>Pożywka</td>
			<td>Wysoki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia wartość %MP (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>29.2</td>
			<td>53.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powtarzalność (%)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV (%)</td>
			<td>35</td>
			<td>11.8</td>
			<td>9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Powtarzalność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) dla procentowej zawartości mikrocząstek (%MP).
Liniowość 
Rysunek 2 wykazuje, że wyniki DLS są liniowe, t.j.następnie dopasowano linię prostą względem przypisanych wartości próbek. Przygotowano siedem próbek o różnej zawartości mikrocząsteczek. Próbki o wysokiej (MP7) oraz niskim (MP1) zawartość mikrocząsteczek oraz odpowiadające im stężenie płytek krwi zostały przygotowane i zmieszane w różnych proporcjach w celu stworzenia próbek pośrednich (MPProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.). Próbki poddano analizie cytometrycznej zgodnie z opisaną wcześniej procedurą19 wyniki DLS i %MP dla każdego stężenia przedstawiono na wykresie jako wartości wejściowe i wyjściowe. Współczynnik determinacji wyniósł 0,985. Przykładowe histogramy DLS dla niskiej i wysokiej zawartości mikrocząsteczek przedstawiono w Rysunek 3AWyniki DLS potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3B).
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej a DLS; analiza korelacji wielkości cząstek; wykres rozrzutu z linią trendu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Porównanie wyników cytometrii przepływowej i DLS. Liniowa zależność między wartością %MP wyznaczoną za pomocą cytometrii przepływowej (wejście) a DLS (wyjście); oryginalne dane DLS z dwóch próbek oznaczone pustym symbolem ○ przedstawiono w Rycina 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład wielkości cząstek, analiza wykresu rozrzutu, wykres intensywności/logarytmu promienia, wyniki dopasowania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Zawartość mikrocząsteczek w celu rozróżnienia między płytkami krwi aktywowanymi a nieaktywowanymi. (A) Wyniki DLS dla zawartości MP w płytkach aktywowanych (linia przerywana) wyniosły 57% w porównaniu do 4% w płytkach nieaktywowanych (linia ciągła). Testy przeprowadzono w temperaturze pomiaru wynoszącej 37 °C, ustawienie lepkości plazmy wynoszące 1,06 x10-3 Pa·s oraz ustawienia całkowitej intensywności w zakresie 20–60 kHz. (B) Wyniki analizy cytometrii przepływowej (uzyskane zgodnie z wcześniejszym opisem)19) tych samych próbek, co pokazano na (A); na histogramach rozprosiania przedniego P1 i P2 reprezentują odpowiednio bramki dla MP i płytek krwi; w przypadku płytek aktywowanych (po lewej) 76% zdarzeń znalazło się w bramce MP, w porównaniu do 6% dla płytek nieaktywowanych (po prawej). Linia regresji liniowej sugeruje stały relatywny wkład szumu tła do wartości %MP w cytometrii przepływowej, co prowadzi do konsekwentnie wyższych wyników. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Specyficzność/Interferencje 
Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (ISO) definiuje specyficzność analityczną jako zdolność procedury pomiarowej do wykrywania lub pomiaru wyłącznie mierzanego składnika (measurandu) w obecności innych ilości w próbce. Specyficzność analityczna przesiewu mikrocząsteczek może być wpływana przez erytrocyty (RBC). Metoda DLS mierzy zawartość MP w stosunku do zawartości płytek krwi. Erytrocyty mogą powodować interferencję, ponieważ ich udział w rozpraszaniu jest wliczony do udziału płytek krwi w rozpraszaniu, co zmniejsza względny udział MP. Istnieją limity regulacyjne dotyczące dopuszczalnej zawartości erytrocytów w produktach krwi; konserwatywna konwersja progu zalecanego przez AABB dla dopuszczalnego stężenia erytrocytów w koncentratach płytek krwi – 2 ml upakowanych erytrocytów w jednej jednostce płytek – poskutkowała wartością 8,0 x 1010 komórek/L (założenia: objętość RBC wynosi 8,5 x10-14L, hematokryt koncentratu erytrocytów wynosi 68%, objętość jednostki płytek wynosi 20 ml). Zgłaszane stężenia resztkowe erytrocytów w różnych produktach znajdują się znacznie poniżej tego progu46.
Trzech różnych dawców przekazało płytki krwi oraz erytrocyty (RBC) w dwa różne dni, zgodnie z kwalifikacją, na potrzeby trzech niezależnych eksperymentów. Początkowa zawartość RBC w koncentratach płytek krwi (próbka referencyjna) wynosiła 0,05 - 0,15 x109 komórek/L, co określono za pomocą hemocytometru. Pięć dodatkowych próbek przygotowano poprzez dodanie znanych ilości RBC do alikwotów koncentratu płytek krwi; docelowe poziomy RBC w tych próbkach wynosiły odpowiednio 1,0, 5,0, 10, 40 i 80 x109 komórek/L.
Próg interferencji erytrocytów wynosił około 1,0 x1010 komórek/L (Rysunek 4), co korelowało z poziomem, przy którym obecność erytrocytów była widoczna wizualnie (Rysunek 5). Powyżej tego poziomu wartość %MP była niedoszacowana, co oznacza, że w próbkach widocznie czerwonych – zawierających erytrocyty, a nie hemoglobinę – zgłaszana zawartość mikrocząsteczek będzie zbyt niska.
<img alt="Wykres reologiczny, stężenie RBC względem %MP (DLS), analiza danych, wyniki regresji liniowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4Zależność liniowa między %MP (DLS) a stężeniem RBC (komórki/L). zwiększające się stężenia RBC o 0,1 x109, 1,0 x109, 5,0 x109, 1,0 x1010, 4,0 x 1010, oraz 8,0 x 1010 komórek/L (od lewej do prawej) z 3 niezależnych eksperymentów (○ eksperyment 1, ● eksperyment 2, □ eksperyment 3, dla każdego eksperymentu przedstawiono linie regresji liniowej). Powyżej 1,0 x1010 Liczba RBC/L prowadzi do niedoszacowania %MP. Wygląd próbek zawierających RBC przedstawiono w Rycina 5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment spektroskopowy prezentujący wyniki reakcji kolorymetrycznej w probówkach; zaobserwowano gradient barw." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Wygląd zewnętrzny próbek zawierających erytrocyty (RBC). Zaczerwienienie próbek płytek krwi zawierających stężenia RBC wynoszące 0,1 x109, 1,0 x 109, 5,0 x109, 1,0 x1010, 4,0 x1010, oraz 8,0 x 1010 komórek/L od lewej do prawej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Dokładność 
Dokładność definiuje się jako różnica między pojedynczym wynikiem pomiaru a prawdziwą wartością wielkości przypisanej do próbki. Ten błąd pomiarowy obejmuje komponent systematyczny szacowany przez błąd systematyczny (bias) oraz komponent losowy szacowany przez odchylenie standardowe. Zatem dokładność wyniku pomiaru jest kombinacją prawdziwości i precyzji.
Do oznaczenia dokładności testu DLS wykorzystano standard kulek. Dokładność oceniano przy dwóch stężeniach w klinicznie istotnym zakresie analizy wynoszącym 3 - 75% MP. Do przygotowania próbek o znanych stężeniach użyto referencyjnych mieszanin kulek, ponieważ kulki referencyjne mają znaną wielkość i stężenie. W związku z tym kulki referencyjne można mieszać w celu uzyskania próbek o pożądanych rozmiarach cząstek i stężeniach.
Do reprezentowania mikrocząsteczek wykorzystano standardowe kulek polistyrenowe o promieniu 125 nm, a do reprezentowania płytek krwi kulki o promieniu 1,5 µm. Dokładność analizy mikrocząsteczek oceniono za pomocą mieszanin kulek o zawartości MP wynoszącej odpowiednio około 20% i 50%. Dokładność pomiaru promieni cząsteczek porównano z promieniami cząsteczek udokumentowanymi w certyfikatach analizy (Certificates of Analysis) dla kulek referencyjnych, zgodnie z Tabelą 5.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">kuleczki o średnicy 125 nm</td>
			<td colspan="3">1.5 µm beady/kuleczki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Certyfikat analizy</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Certyfikat analizy</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia wartość promienia</td>
			<td>122.0</td>
			<td>113.8</td>
			<td>124.4</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odchylenie std.</td>
			<td>4.5</td>
			<td>2.83</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.035</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Życiorys zawodowy</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>2.48%</td>
			<td>2.89%</td>
			<td>2.20%</td>
			<td>3.74%</td>
			<td>4.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dokładność</td>
			<td></td>
			<td>6.70%</td>
			<td>2.00%</td>
			<td></td>
			<td>6.50%</td>
			<td>6.30%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Dokładność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Porównanie rozmiarów z wyników DLS z certyfikatem analizy dla kulek o promieniu 125 nm i promieniu 1,5 µm w mieszaninach.

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości w szpitalnych bankach krwi. Celem jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych od nieaktywowanych, aby zoptymalizować wykorzystanie płytek krwi. Dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi pacjentom hematologicznym i onkologicznym może zmniejszyć ich wysokie ryzyko wystąpienia oporności na krwiożerczość.

Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Ogólnym celem tej metody jest scharakteryzowanie transfuzji płytek krwi za pomocą rutynowych testów, które można wykonać w ośrodkach krwiodawstwa lub szpitalnych bankach krwi w celu optymalizacji stosowania tych produktów krwiopochodnych u pacjentów z krwawieniami lub rakiem krwi. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w medycynie transfuzjologicznej, takie jak to, czy transfuzja płytek krwi zawiera płytki aktywowane czy nieaktywowane. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia szybkie i dokładne badanie przesiewowe pod kątem zawartości mikrocząstek, które są sprawdzonym wskaźnikiem aktywacji płytek krwi.Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą musiały nauczyć się pobierać próbki z segmentów rurek worków, ponieważ obecnie nie jest to rutynowo wykonywane. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że płytki krwi od różnych dawców mają dużą zmienność w stanie aktywacji, co wydaje się mieć wpływ na pacjenta. Istnieją trzy metody uzyskiwania próbki z koncentratu płytek krwi.Aby pobrać próbkę z torebki, należy dobrze wymieszać zawartość worka płytkowego, delikatnie przesuwając poziomo przez pięć sekund, przechylając się od końca do końca, pięć razy. Otwórz zacisk do woreczka, worek zostanie opróżniony i sam się napełni. Nie jest konieczne całkowite napełnienie torebki, ponieważ do testów dynamicznego rozpraszania światła lub DLS wymagana będzie tylko próbka o pojemności 100 mikrolitrów.Odłącz woreczek od worka, zgrzewając rurkę łączącą za pomocą zgrzewarki do rurek. W przypadku pobierania próbek z pustego przewodu należy sprawdzić, czy rurka worka z płytkami krwi była przechowywana pusta i czy blok rurki jest nadal na swoim miejscu. Sprawdź wzrokowo rurkę, aby upewnić się, że nie ma w niej koncentratu płytek krwi.Zamknij ściągacz izolacji na rurce, jak najbliżej bloku rurki, ściskając uchwyty, aby ścisnąć rurkę między rolkami, jednocześnie trzymając ściągacz izolacji w pozycji zamkniętej, zwolnij blok rurki. Powoli pociągnij ściągacz izolacji w dół pustego wężyka, pozwalając, aby rurka powoli wypełniała się za stripperem. Kontynuuj, aż sekcja poniżej ściągacza izolacji zostanie całkowicie napełniona lub do momentu, gdy ściągacz znajdzie się w odległości jednego cala od końca rurki.Bardzo ważne jest, aby mocno ścisnąć uchwyty ściągacza izolacji i powoli ciągnąć ściągacz w dół rurki. Po osiągnięciu punktu zatrzymania za pomocą ściągacza izolacji, użyj zgrzewarki do rurek, aby uszczelnić rurkę na gorąco jeden cal nad ściągaczem izolacji. Teraz zwolnij uchwyty ręcznego ściągacza izolacji.Ponownie zgrzewaj na gorąco, od jednego do dwóch cali powyżej poprzedniej uszczelki, aby utworzyć segment testowy. Następnie odciąć segment testowy od jednostki płytek krwi. Ten segment będzie używany do testowania DLS.W przypadku pobierania próbek z rurki, która nie jest pusta, należy zawiesić worek pionowo i zwolnić blok rurki, jeśli jest na swoim miejscu. Sprawdź wzrokowo rurkę, aby ustalić, czy nie ma znacznych stałych grudek. Jeśli istnieją stałe grudki, zamknij je nad nimi, tak aby nie można było ich wedrzeć do torby.Następnie zamknij ściągacz izolacji na rurce, jak najbliżej uszczelnionego końca rurki. Zbierz zawartość rurki do torby, ściskając uchwyty, aby ścisnąć rurkę między rolkami. Utrzymując siłę zacisku, przesuń ściągacz izolacji wzdłuż rurki w kierunku worka.Wyjmij worek płytkowy z haczyka do zawieszania i delikatnie mieszaj worek przez pięć sekund, przechylając go pięciokrotnie od końca do końca, trzymając striptizerkę zamkniętą. Zawieś torbę pionowo, trzymając striptizerkę zamkniętą. Powoli pociągnij ściągacz izolacji w dół pustego wężyka, pozwalając, aby rurka powoli wypełniała się za stripperem.Kontynuuj, aż sekcja pod ściągaczem izolacji zostanie całkowicie napompowana lub do momentu, gdy ściągacz znajdzie się w odległości jednego cala od końca rurki. Po osiągnięciu punktu zatrzymania za pomocą ściągacza izolacji, użyj zgrzewarki do rurek, aby uszczelnić rurkę na gorąco, jeden cal nad ściągaczem. Po zwolnieniu ściągacza ponownie zgrzej od jednego do dwóch cali powyżej poprzedniego uszczelnienia, aby utworzyć segment testowy.Odetnij i wyrzuć ostatnią część rurki. Następnie odciąć segment testowy od jednostki płytek krwi. Ten segment będzie używany do testowania DLS.Używając osłony przeciwbryzgowej i czystych, suchych nożyczek, odetnij jeden koniec rurki woreczka lub segmentu testowego. Natychmiast napełnić kapilatę za pomocą narzędzia do pobierania próbek, aby pobrać próbkę bezpośrednio z otwartego woreczka lub segmentu rurki do kapilary. Uszczelnij spód napełnionej kapilary, delikatnie wciskając ją w uszczelniacz do rurki kapilarnej, jednocześnie delikatnie skręcając i lekko dociskając do tacy.Następnie odłącz pipetę i końcówkę o stałej objętości 100 mikrolitrów od kapilary, upewniając się, że kapilara pozostaje mocno osadzona w uszczelniaczu rurki kapilarnej. Wyjmij kapilarę z tacki na uszczelniacz rurki kapilarnej i przetrzyj wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione, delikatnie przesuwając dno kapilary.Na koniec umieść kapilarnę w systemie DLS. Aby rozpocząć, uruchom konsolę, postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie dotykowym, aby się zalogować i wybierz opcję testu mikrocząstek lub testu MP, aby zainicjować nowy test DLS do pomiaru zawartości mikrocząstek w próbce płytek krwi. Wprowadź informacje o próbce za pomocą skanera kodów kreskowych lub wprowadź je ręcznie.Umieść kapilarnę w systemie DLS zgodnie z instrukcją i rozpocznij test. Po zakończeniu testu wyjmij próbkę z uchwytu kapilarnego i odpowiednio zutylizuj materiały eksploatacyjne zgodnie z wytycznymi zakładu. Oznacz worek płytek krwi kolorem odpowiadającym wynikowi.Na przykład pomarańczowy dla nieaktywowanego i różowy dla aktywnego. Dynamiczne rozpraszanie światła mierzy prędkość cząstek poruszających się w zawieszeniu przez ruchy Browna. W oparciu o różne prędkości, małe cząstki poruszają się szybko, a duże cząstki poruszają się wolno.Technologia ta określa rozkład wielkości próbki. DLS określają, że ta transfuzja zawiera nieaktywowane płytki krwi na podstawie mniej niż 15% zawartości mikrocząstek. Istotnie. Pod mikroskopem widoczne były głównie dyskoidalne płytki krwi z bardzo małą ilością mikrocząstek.Jednak inna transfuzja płytek krwi, która gołym okiem wygląda dokładnie tak samo jak pierwsza torebka, zawierała aktywowane płytki krwi, oparte na ponad 15% zawartości mikrocząstek. W tej próbce pod mikroskopem uwidoczniono różne morfologie płytek krwi, małe agregaty i wiele mikrocząstek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób nieinwazyjnie pobierasz próbkę z worka płytkowego, napełniasz kapilarnę i testujesz próbkę pod kątem zawartości mikrocząstek, aby umożliwić optymalne wykorzystanie inwentarza płytek krwi.Podczas próby tej procedury ważne jest, aby dobrze wymieszać worek, aby uzyskać dobrą, reprezentatywną próbkę. Podążając za tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące komórkowego pochodzenia mikrocząstek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie i pół minuty.Wraz z pięciominutowym testem transfuzje płytek krwi można scharakteryzować w czasie krótszym niż osiem minut. Po opracowaniu technika ta pozwoliła szpitalnym bankom krwi na badania przesiewowe zapasów płytek krwi, leczenie pacjentów hematologicznych/onkologicznych wyłącznie nieaktywowanymi płytkami krwi i zaobserwowanie zmniejszenia liczby stosowanych transfuzji płytek krwi. Jak mówimy, najbezpieczniejsza transfuzja to ta, której nie podaje się.Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w charakterystykę płytek krwi przed transfuzją, może być również stosowana do badania osocza bogatopłytkowego bezpośrednio od dawców. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie pacjentów z rakiem krwi, ponieważ odnoszą oni korzyści z nieaktywowanych transfuzji płytek krwi, które zmniejszają ryzyko wystąpienia oporności.

routine-screening-method-for-microparticles-in-platelet-transfusions

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metoda ta bada fenotyp agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) pośredniczonej przez płytki krwi w izolatach klinicznych. Jest to realizowane poprzez izolację oraz wspólną inkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Tutaj krew myszy została pobrana w obecności antykoagulantu. Płytki krwi oczyszczono za pomocą pożywki gradientowej joheksolu przy użyciu wirowania z niską prędkością. Płytki krwi aktywowano trombiną w celu zbadania, czy są one zdolne do życia. Jakość oczyszczonych płytek krwi analizowano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy

Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.

Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Naucz się rutynowej metody badań przesiewowych mikrocząstek w koncentratach płytek krwi przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła. Technika ta pozwala szybko odróżnić aktywowane i nieaktywowane płytki, optymalizując leczenie pacjentów hematologiczno-onkologicznych.

Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

Przeglądaj więcej filmów